1.本发明属于微生物制剂技术领域，涉及一种醋酸菌发酵剂及其制备方法与应用，具体涉及一种直投式醋酸菌发酵剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.醋酸菌(acetic acid bacteria，简称aab)为革兰氏阴性菌，化能异养型，严格好氧，是一类能将乙醇氧化成醋酸的细菌的统称。醋酸菌属于α-变形菌门，具有高频率得突变性。在自然界中，醋酸菌存在于水果、花、土壤、蜂蜜及酸败的食物表面。大量研究表明：利用醋酸菌发酵制得的果醋和粮食醋对促进肠道蠕动，抗菌杀菌，缓解疲劳，抑制血糖上升，降血脂，改善肝脂质代谢，软化血管，提升智力，抑制肥胖，调节内分泌，美容养颜有一定的作用。由此可见，醋酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。也正因为如此，醋酸菌被广泛应用于轻工业、食品、医药等行业，特别是醋酸等产品的发酵中。
3.目前，醋酸发酵剂主要以醋酸曲发酵剂为主，醋酸菌曲发酵剂是混合发酵剂，其主要包括的微生物有酵母菌、黑曲霉、醋酸菌等。主要使用方法是种子液传代接种或固体拌料法。混合发酵剂在生产上存在步骤繁琐、杂菌污染和菌种退化的问题。而直投式醋酸发酵剂可以解决杂菌污染、菌种退化等问题，是生产液态发酵醋饮企业较迫切的需求。直投式醋酸发酵剂是指在果醋、食醋制作过程中不经传代而直接投入发酵罐中的干粉状发酵剂或冷冻浓缩型发酵剂，它发酵活力强，活菌数含量高，广泛应用于发酵工业中。
4.例如cn102304487a公开了一种直投式高活性浓缩固体果蔬醋酸发酵剂的制备方法。采用醋酸杆菌，在种子培养基中添加果汁，连续驯化培养、分离纯化，获得醋酸菌试管斜面菌种，培养、干燥制得。干燥过程中使用的保护剂为：脱脂奶粉15％、麦芽糊精8％、环状糊精6％、海藻糖1％、蔗糖1％；干燥条件为：冷阱-50℃，真空度1pa，冷冻干燥24h。得到的菌数高达109cfu/g以上，成功应用于果蔬醋酸饮品的酿造。
5.cn103820368a公开了一种醋酸菌冻干菌粉的制备方法及用途，其制备方法包含如下步骤：1)将醋酸菌菌种接入液体培养基中在28～30℃培养10～30小时得到一级菌种；2)将一级菌种接入发酵培养基，在28～33℃培养10～30小时，并在发酵过程中加入5～25wt％的氢氧化钠水溶液，得到发酵混合液；3)将发酵混合液进行过滤或离心分离得到菌泥；4)将菌泥与菌泥保护剂混合均匀，得到菌悬液；5)将菌悬液进行冷冻干燥得到所述醋酸菌冻干菌粉。将上述方法制得的醋酸菌冻干菌粉与多种添加剂混合后，经不同工艺可得到解酒效果良好的解酒片、解酒饮品。
6.然而，现有技术中提供的直投式醋酸菌发酵剂在制备过程中难以保持醋酸菌的活性，导致制得的发酵剂中活菌数较少，一般为2.0-7.0
×
109cfu/g，不能满足生产的需求。
7.因此如何开发一种使用简单、活力高的醋酸菌发酵剂成为了本领域目前迫切需要解决的问题。


技术实现要素：

8.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种醋酸菌发酵剂及其制备方法与应用，具体提供一种直投式醋酸菌发酵剂及其制备方法与应用。
9.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种直投式醋酸菌发酵剂，所述直投式醋酸菌发酵剂的制备原料包括醋酸菌和保护剂；
11.所述保护剂包括脱脂乳粉和氨基酸，所述氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
12.本发明创造性地将脱脂乳粉、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸进行组合作为醋酸菌的保护剂，四种组分相互配合，协同增效，能够降低在冻干过程中冰晶形成对菌体的破坏作用及脱水干燥对菌体和酶活性的损伤，更好地保护醋酸菌的活性，提升其在冻干过程中的存活率，提高制得的发酵剂中醋酸菌的活菌数。
13.优选地，所述保护剂以重量份数计包括脱脂乳粉4-25份和氨基酸0.6-3份。
14.上述4-25份中的具体数值例如4份、6份、8份、10份、12份、14份、16份、18份、20份、22份、25份等。
15.上述0.6-3份中的具体数值例如0.6份、0.8份、1份、1.2份、1.5份、1.7份、2份、2.2份、2.5份、2.7份、3份等。
16.优选地，所述氨基酸中亮氨酸、异亮氨酸与缬氨酸的质量比为(1-3):(1-3):(1-3)。
17.上述(1-3)中的具体数值例如1、1.2、1.5、1.7、2.0、2.2、2.5、2.7、3等。
18.优选地，所述保护剂还包括蔗糖、菊粉、麦芽糊精、甘油或缓冲盐中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如蔗糖和菊粉的组合、菊粉和麦芽糊精的组合、甘油和缓冲盐的组合等，其他任意的组合方式均可，优选蔗糖、菊粉、麦芽糊精、甘油和缓冲盐的组合。
19.蔗糖、菊粉、麦芽糊精、甘油均能够降低冻干过程中冰晶形成对菌体的破坏作用及脱水干燥对菌体和酶活性的损伤。此外，通过缓冲盐的添加，将体系ph控制在5.0-6.5，能够防止干燥浓缩过程中氢离子对菌体的损伤。与其他选择相比，在以脱脂乳粉与氨基酸为保护剂的基础上进一步添加蔗糖、菊粉、麦芽糊精、甘油和缓冲盐，能够在冻干过程中对醋酸菌进行更好的保护，进一步提升其存活率，提高制得的发酵剂中醋酸菌的活菌数。
20.优选地，所述保护剂以重量份数计包括蔗糖6-10份、菊粉2-6份、麦芽糊精2-8份、甘油0.5-1.5份、缓冲盐1-5份、氨基酸0.6-3份和脱脂乳粉4-25份。
21.上述6-10份中的具体数值例如6份、6.5份、7份、7.5份、8份、8.5份、9份、9.5份、10份等。
22.上述2-6份中的具体数值例如2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份、5份、5.5份、6份等。
23.上述2-8份中的具体数值例如2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份、5份、5.5份、6份、6.5份、7份、7.5份、8份等。
24.上述0.5-1.5份中的具体数值例如0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份、1份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份、1.5份等。
25.上述1-5份中的具体数值例如1份、1.5份、2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份、5份
等。
26.上述0.6-3份中的具体数值例如0.6份、0.8份、1份、1.2份、1.5份、1.7份、2份、2.2份、2.5份、2.7份、3份等。
27.上述4-25份中的具体数值例如4份、6份、8份、10份、12份、14份、16份、18份、20份、22份、25份等。
28.优选地，所述缓冲盐包括磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的组合、磷酸二氢钠和磷酸氢二钾的组合、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的组合等，其他任意的组合方式均可。
29.第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的直投式醋酸菌发酵剂的制备方法，所述直投式醋酸菌发酵剂的制备方法包括如下步骤：
30.(1)培养醋酸菌，得种子液；
31.(2)发酵培养步骤(1)得到的种子液，得菌液，离心，收集菌泥；
32.(3)将步骤(2)得到的菌泥与保护剂混合，冷冻干燥，即得所述直投式醋酸菌发酵剂。
33.优选地，步骤(1)所述醋酸菌的接种量为0.5％-1.5％，例如0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等。
34.优选地，步骤(1)所述培养的温度为28-35℃，例如28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃等。
35.优选地，步骤(2)所述种子液的接种量为0.5％-1.5％，例如0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等。
36.优选地，步骤(2)所述发酵培养为阶段降温培养，所述阶段降温培养包括至少两次降温，优选为两次降温。
37.优选地，所述阶段降温培养过程为：初始温度设置为30-34℃，当培养液中的葡萄糖消耗0.5％-1.5％时，开始第一阶段降温，降温至28-32℃，当培养液中的葡萄糖剩余0.6％-1.2％时，开始第二阶段降温，降温至24-28℃，当培养液中的葡萄糖剩余0.3％-0.5％时，终止培养。
38.本发明创造性地在醋酸菌发酵培养时采用阶段降温的培养方式，提高了菌种的低温适应能力，显著提高了醋酸菌的活菌数，降低了其衰减速率。
39.上述30-34℃中的具体数值例如30℃、30.5℃、31℃、31.5℃、32℃、32.5℃、33℃、33.5℃、34℃等。
40.上述0.5％-1.5％中的具体数值例如0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等。
41.上述28-32℃中的具体数值例如28℃、28.5℃、29℃、29.5℃、30℃、30.5℃、31℃、31.5℃、32℃等。
42.上述0.6％-1.2％中的具体数值例如0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％等。
43.上述24-28℃中的具体数值例如24℃、24.5℃、25℃、25.5℃、26℃、26.5℃、27℃、27.5℃、28℃等。
44.上述0.3％-0.5％中的具体数值例如0.3％、0.32％、0.35％、0.37％、0.4％、0.42％、0.45％、0.47％、0.5％等。
45.优选地，所述阶段降温培养过程为：初始温度设置为31-33℃，当培养液中的葡萄糖消耗0.5％-1.5％时，开始第一阶段降温，降温至29-31℃，当培养液中的葡萄糖剩余0.6％-1.2％时，开始第二阶段降温，降温至26-28℃，当培养液中的葡萄糖剩余0.3％-0.5％时，终止培养。
46.优选地，步骤(2)所述离心的速度为3000-6000r/min，所述离心的时间为10-40min。
47.上述3000-6000r/min中的具体数值例如3000r/min、3200r/min、3500r/min、3700r/min、4000r/min、4200r/min、4500r/min、4700r/min、5000r/min、5200r/min、5500r/min、5700r/min、6000r/min等。
48.上述10-40min中的具体数值例如10min、12min、15min、17min、20min、22min、25min、27min、30min、32min、35min、37min、40min等。
49.优选地，步骤(3)所述菌泥与保护剂的质量比为1:(1-3)，例如1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.7、1:2、1:2.2、1:2.5、1:2.7、1:3等。
50.优选地，步骤(3)所述冷冻干燥过程包括预冻阶段、一次干燥阶段和解析干燥阶段；所述预冻阶段为控制层板1h降温至-50～-45℃，保持3-4h；所述一次干燥阶段为控制层板2h升温至-30～-25℃，保持至一次干燥终点；所述解析干燥阶段为控制层板1h升温至22-30℃，保持至二次干燥终点。
51.上述-50～-45℃中的具体数值例如-50℃、-49℃、-48℃、-47℃、-46℃、-45℃等。
52.上述3-4h中的具体数值例如3h、3.1h、3.2h、3.3h、3.4h、3.5h、3.6h、3.7h、3.8h、3.9h、4h等。
53.上述-30～-25℃中的具体数值例如-30℃、-29℃、-28℃、-27℃、-26℃、-25℃等。
54.上述22-30℃中的具体数值例如22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等。
55.第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的直投式醋酸菌发酵剂或如第二方面所述的直投式醋酸菌发酵剂的制备方法在制备发酵饮料或发酵调味料中的应用。
56.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
57.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
58.本发明创造性地将脱脂乳粉、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸进行组合作为醋酸菌的保护剂，四种组分相互配合，协同增效，能够降低在冻干过程中冰晶形成对菌体的破坏作用及脱水干燥对菌体和酶活性的损伤，更好地保护醋酸菌的活性，提升其在冻干过程中的存活率，提高制得的发酵剂中醋酸菌的活菌数。在以脱脂乳粉与氨基酸为保护剂的基础上进一步添加蔗糖、菊粉、麦芽糊精、甘油和缓冲盐，能够在冻干过程中对醋酸菌进行更好的保护，进一步提升其存活率，提高制得的发酵剂中醋酸菌的活菌数。此外，本发明创造性地在醋酸菌发酵培养时采用阶段降温的培养方式，提高了菌种的低温适应能力，显著提高了醋酸菌的活菌数，降低了其衰减速率。在醋酸菌阶段降温发酵培养过程中，各个阶段温度的控
制以及温度变化的时机对醋酸菌的生长有一定的影响，进而影响其活菌数，采用本发明优选的阶段降温培养条件得到的菌泥中醋酸菌活菌数达7.6
×
10
11
cfu/g以上，冻干存活率达90％以上，最终制得的木醋杆菌发酵剂中醋酸菌活菌数达5.0
×
10
11
cfu/g以上。
具体实施方式
59.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
60.本发明所述醋酸菌可以为现有技术中可获得的任意一种醋酸菌，例如木醋杆菌、葡萄糖酸杆菌、产酮醋杆菌、葡萄糖醋酸菌、醋化醋杆菌、巴氏醋杆菌等。下述实施例、对比例所涉及的醋酸菌为木醋杆菌(atcc 23767)。下述实施例、对比例所涉及的种子培养基的配方为：葡萄糖40g/l、酵母膏40g/l、磷酸二氢钾2g/l、一水硫酸镁0.59g/l、一水硫酸锰0.19g/l、吐温-80 1g/l、碳酸钙5g/l。发酵培养基配方为：葡萄糖40g/l、酵母膏40g/l、k2hpo4·
3h2o2g/l、mgso4·
7h2o 0.59g/l、mnso
4 0.19g/l、吐温-80 1g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、碳酸钙5g/l。
61.实施例1
62.本实施例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法如下：
63.(1)取木醋杆菌按照2％的接种量接种至摇瓶种子培养基，150r/min 30℃恒温培养16h，得到一级种子液；用上述同样的方法制得二级种子液。
64.(2)将种子液按2％(v/v)的接种量接种至发酵罐中利用发酵培养基进行培养，补加氢氧化钠控制发酵过程的ph为5.3，启动设置温度为32℃，当葡萄糖消耗1％时，开始第一阶段降温，降温至30℃，当葡萄糖剩余1％时，开始第二阶段降温，降温至27℃，葡萄糖发酵残糖至0.5％时终止培养，得菌液，4000r/min离心20min获得菌泥。
65.(3)将菌泥与保护剂以1:2(w/w)的比例混合均匀，进行冷冻干燥。冷冻干燥过程包括预冻阶段、一次干燥阶段以及解析干燥阶段，预冻为控制层板设置-45℃，保持4h，一次干燥为控制层板2h升温至-25℃，保持30h，解析干燥为控制层板1h升温至25℃，保持15h，即得。
66.所述保护剂的配方为：蔗糖70g/l、菊粉40g/l、麦芽糊精60g/l、甘油10g/l、磷酸二氢钾10g/l、磷酸氢二钾10g/l、亮氨酸0.33g/l、异亮氨酸0.33g/l、缬氨酸0.33g/l和脱脂乳粉120g/l，溶剂为水。
67.实施例2
68.本实施例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法如下：
69.(1)取木醋杆菌按照2％的接种量接种至摇瓶种子培养基，150r/min 33℃恒温培养14h，得到一级种子液；用上述同样的方法制得二级种子液。
70.(2)将种子液按2％(v/v)的接种量接种至发酵罐中利用发酵培养基进行培养，补加氢氧化钠控制发酵过程的ph为5.3，启动设置温度为33℃，当葡萄糖消耗1.5％时，开始第一阶段降温，降温至31℃，当葡萄糖剩余0.6％时，开始第二阶段降温，降温至28℃，葡萄糖发酵残糖至0.3％时，终止培养，得菌液，6000r/min离心15min获得菌泥。
71.(3)将菌泥与保护剂以1:2(w/w)的比例混合均匀，进行冷冻干燥。冷冻干燥过程包括预冻阶段、一次干燥阶段以及解析干燥阶段，预冻为控制层板设置-50℃，保持3h，一次干
燥为控制层板2h升温至-30℃，保持至一次干燥终点，解析干燥为控制层板1h升温至22℃，保持至二次干燥终点，即得。
72.所述保护剂的配方为：蔗糖60g/l、菊粉60g/l、麦芽糊精25g/l、甘油15g/l、磷酸二氢钠15g/l、磷酸氢二钠15g/l、亮氨酸0.5g/l、异亮氨酸0.2g/l、缬氨酸0.6g/l和脱脂乳粉200g/l，溶剂为水。
73.实施例3
74.本实施例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法如下：
75.(1)取木醋杆菌按照2％的接种量接种至摇瓶种子培养基，150r/min 28℃恒温培养18h，得到一级种子液；用上述同样的方法制得二级种子液。
76.(2)将种子液按2％(v/v)的接种量接种至发酵罐中利用发酵培养基进行培养，补加氢氧化钠控制发酵过程的ph为5.3，启动设置温度为31℃，当葡萄糖消耗0.7％时，开始第一阶段降温，降温至29℃，当葡萄糖剩余1.2％时，开始第二阶段降温，降温至26℃，葡萄糖发酵残糖至0.4％时，终止培养，得菌液，3000r/min离心40min，获得菌泥。
77.(3)将菌泥与保护剂以1:2(w/w)的比例混合均匀，进行冷冻干燥。冷冻干燥过程包括预冻阶段、一次干燥阶段以及解析干燥阶段，预冻为控制层板设置-48℃，保持3.5h，一次干燥为控制层板2h升温至-27℃，保持至一次干燥终点，解析干燥为控制层板1h升温至28℃，保持至二次干燥终点，即得。
78.所述保护剂的配方为：蔗糖90g/l、菊粉25g/l、麦芽糊精80g/l、甘油5g/l、磷酸二氢钾7g/l、磷酸氢二钾7g/l、亮氨酸0.8g/l、异亮氨酸0.3g/l、缬氨酸0.8g/l和脱脂乳粉80g/l，溶剂为水。
79.实施例4
80.本实施例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中阶段降温过程改为：
81.启动设置温度为34℃，当葡萄糖消耗1％时，开始第一阶段降温，降温至32℃，当葡萄糖剩余1％时，开始第二阶段降温，降温至28℃，葡萄糖发酵残糖至0.5％时终止培养。
82.其他条件参照实施例1。
83.实施例5
84.本实施例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中阶段降温过程改为：
85.启动设置温度为30℃，当葡萄糖消耗1％时，开始第一阶段降温，降温至38℃，当葡萄糖剩余1％时，开始第二阶段降温，降温至24℃，葡萄糖发酵残糖至0.5％时终止培养。
86.其他条件参照实施例1。
87.实施例6
88.本实施例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中阶段降温过程改为：
89.启动设置温度为36℃，当葡萄糖消耗1.6％时，开始第一阶段降温，降温至33℃，当葡萄糖剩余0.5％时，开始第二阶段降温，降温至29℃，葡萄糖发酵残糖至0.5％时终止培养。
90.其他条件参照实施例1。
91.实施例7
92.本实施例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中阶段降温过程改为：
93.启动设置温度为30℃，当葡萄糖消耗0.4％时，开始第一阶段降温，降温至27℃，当葡萄糖剩余1.3％时，开始第二阶段降温，降温至23℃，葡萄糖发酵残糖至0.5％时终止培养。
94.其他条件参照实施例1。
95.实施例8
96.本实施例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)不进行阶段降温培养，即步骤(2)为：
97.将种子液按2％(v/v)的接种量接种至发酵罐中利用发酵培养基进行培养，补加氢氧化钠控制发酵过程的ph为5.3，32℃下培养至葡萄糖发酵残糖至0.5％时终止培养，得菌液，4000r/min离心20min获得菌泥。
98.其他条件参照实施例1。
99.实施例9
100.本实施例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于保护剂配方中不含有麦芽糊精和甘油，其他条件参照实施例1。
101.实施例10
102.本实施例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于保护剂配方中不含有菊粉、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，其他条件参照实施例1。
103.对比例1
104.本对比例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于保护剂配方中不含有脱脂乳粉，缺少的量用水补足，其他组分及含量均不变，其他条件参照实施例1。
105.对比例2
106.本对比例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将保护剂配方中的“亮氨酸0.33g/l、异亮氨酸0.33g/l、缬氨酸0.33g/l和脱脂乳粉120g/l”替换为“脱脂乳粉121g/l”，其他组分及含量均不变，其他条件参照实施例1。
107.对比例3
108.本对比例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将保护剂配方中的“亮氨酸0.33g/l、异亮氨酸0.33g/l、缬氨酸0.33g/l”替换为“缬氨酸1g/l”，其他组分及含量均不变，其他条件参照实施例1。
109.对比例4
110.本对比例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将保护剂配方中的“亮氨酸0.33g/l、异亮氨酸0.33g/l、缬氨酸0.33g/l”替换为“亮氨酸1g/l”，其他组分及含量均不变，其他条件参照实施例1。
111.对比例5
112.本对比例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将保护剂配方中的“亮氨酸0.33g/l、异亮氨酸0.33g/l、缬氨酸0.33g/l”替换为“异亮氨酸1g/
l”，其他组分及含量均不变，其他条件参照实施例1。
113.对比例6
114.本对比例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将保护剂配方中的“亮氨酸0.33g/l、异亮氨酸0.33g/l、缬氨酸0.33g/l”替换为“亮氨酸0.5g/l、异亮氨酸0.5g/l”，其他组分及含量均不变，其他条件参照实施例1。
115.对比例7
116.本对比例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将保护剂配方中的“亮氨酸0.33g/l、异亮氨酸0.33g/l、缬氨酸0.33g/l”替换为“缬氨酸0.5g/l、异亮氨酸0.5g/l”，其他组分及含量均不变，其他条件参照实施例1。
117.对比例8
118.本对比例提供一种直投式醋酸菌发酵剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将保护剂配方中的“亮氨酸0.33g/l、异亮氨酸0.33g/l、缬氨酸0.33g/l”替换为“缬氨酸0.5g/l、亮氨酸0.5g/l”，其他组分及含量均不变，其他条件参照实施例1。
119.测试例1
120.根据gb 4789.35-2016食品安全国家标准，食品微生物学检验，醋酸菌检验方法检测实施例1-10和对比例1-8的步骤(2)制得的菌泥以及步骤(3)制得的发酵剂中木醋杆菌的活菌数并计算其存活率。
121.发酵剂活菌数检测：称量1g步骤(3)得到的发酵剂加入9ml含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，得菌液，取1ml菌液至9ml生理盐水中进行梯度稀释，取100μl稀释液涂布于固体培养基中，涂布3个梯度，每个梯度3个平行，将涂布后的培养皿放于30℃恒温培养箱中培养48h后取出计数，得冻干后总活菌数。
122.菌泥活菌数检测：称量1g步骤(2)得到的菌泥加入9ml含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，得菌液，取1ml菌液至9ml生理盐水中进行梯度稀释，取100μl稀释液涂布于mrs固体培养基中，涂布3个梯度，每个梯度3个平行，将涂布后的培养皿放于30℃恒温培养箱中培养48h后取出计数，再乘以菌泥重量，得冻干前总活菌数。
123.(3)菌泥水分含量测定：取10g菌泥，置于烘箱中105℃烘干至恒重，计算菌泥水分含量。
124.(4)计算冻干存活率：
125.冻干存活率＝冻干后每克菌粉的活菌数/(每克菌泥活菌数
×
菌泥水分含量)。
126.结果如表1所示。
127.表1
[0128][0129][0130]
结果显示：各实施例制得的发酵剂中木醋杆菌的活菌数较高，说明本发明提供的直投式醋酸菌发酵剂的活性高。对比例1-8制得的发酵剂中木醋杆菌的活菌数以及在冻干过程中的存活率与实施例1相比较低，说明脱脂乳粉与氨基酸在冻干过程中对木醋杆菌起
重要的保护作用，将脱脂乳粉、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸进行组合比单一氨基酸、单一的脱脂乳粉或两种氨基酸的组合能够更好地保护木醋杆菌，提升其在冻干过程中的存活率，证明了四者间的协同增效作用。实施例9-10制得的发酵剂中木醋杆菌的活菌数以及在冻干过程中的存活率与实施例1相比稍低，说明在以脱脂乳粉与氨基酸为保护剂的基础上进一步添加蔗糖、菊粉、麦芽糊精、甘油和缓冲盐，能够在冻干过程中对木醋杆菌进行更好的保护，进一步提升其存活率。实施例8得到的菌泥活菌数与实施例1相比显著下降，其在冻干过程中的存活率也较低，说明在木醋杆菌发酵培养时采用阶段降温的培养方式能够显著提高木醋杆菌的活菌数，降低其衰减速率。实施例4-7得到的菌泥数相较于实施例1较少，说明在木醋杆菌阶段降温发酵培养过程中，各个阶段温度的控制以及温度变化的时机对木醋杆菌的生长有一定的影响，进而影响其活菌数，阶段降温培养过程优选为“初始温度设置为30-34℃，当培养液中的葡萄糖消耗0.5-1.5％时，开始第一阶段降温，降温至28-32℃，当培养液中的葡萄糖剩余0.6-1.2％时，开始第二阶段降温，降温至24-28℃，当培养液中的葡萄糖剩余0.3-0.5％时，终止培养。”，进一步优选为“初始温度设置为31-33℃，当培养液中的葡萄糖消耗0.5-1.5％时，开始第一阶段降温，降温至29-31℃，当培养液中的葡萄糖剩余0.6-1.2％时，开始第二阶段降温，降温至26-28℃，当培养液中的葡萄糖剩余0.3-0.5％时，终止培养。”[0131]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种直投式醋酸菌发酵剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0132]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0133]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。