mut-甲醇营养型酵母
技术领域
1.本发明涉及在缺乏醇氧化酶1(aox1)和醇氧化酶2(aox2)的重组甲醇营养型酵母中生产目的蛋白(poi)。


背景技术：

2.在重组宿主细胞培养物中产生的蛋白质作为诊断剂和治疗剂变得越来越重要。为此目的，工程化改造和/或选择细胞以产生异常高水平的重组或异源目的蛋白。对细胞培养条件的优化对于重组蛋白或异源蛋白的成功商业生产是重要的。
3.在细胞培养中用原核宿主细胞和真核宿主细胞两者均已实现目的蛋白(poi)的成功生产。真核宿主细胞，特别是哺乳动物宿主细胞、酵母或丝状真菌，或细菌通常用作生物药物蛋白以及大宗化学品的生产宿主。最突出的实例是甲醇营养型酵母(methylotrophic yeast)，诸如以高效分泌异源蛋白而闻名的巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)。巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)已被重新归类于新属驹形氏酵母属(komagataella)，并且分为三个种：巴斯德驹形氏酵母(k.pastoris)、法夫驹形氏酵母(k.phaffii)和伪巴斯德驹形氏酵母(k.pseudopastoris)。通常用于生物技术应用的菌株属于两种提出的种，巴斯德驹形氏酵母和法夫驹形氏酵母。菌株gs115、x-33、cbs2612和cbs7435是法夫驹形氏酵母，而菌株dsmz70382被归类为模式种巴斯德驹形氏酵母，所述模式种是所有可用的巴斯德毕赤酵母菌株的参考菌株(kurtzman 2009,j ind microbiol biotechnol.36(11):1435-8)。mattanovich等人(microbial cell factories 2009,8:29doi:10.1186/1475-2859-8-29)描述了巴斯德驹形氏酵母的模式株dsmz 70382的基因组测序并且分析了其分泌组和糖转运蛋白。
4.已使用缺乏两种aox基因aox1和aox2(称为mut-)或仅缺乏aox2(称为muts)或不缺乏任何aox基因(称为mut
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)的巴斯德毕赤酵母菌株。
5.用于在重组宿主细胞中产生蛋白质的启动子是受调控的(例如，在向培养基中添加甲醇后诱导的，甲醇控制的)或是持续活性的(组成型)。甲醇诱导型启动子paox1已被描述为控制mut-、mut
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或muts菌株中的蛋白质表达。
6.chiruvolu等人(enzyme microb.technol.1997,21:277-283)描述了用于重组蛋白生产的mut-菌株的构建。确定的是mut-菌株不能在甲醇上生长，这需要使用另一种碳源提供用于生长、维持和蛋白质生产。poi在paox1的控制下得到表达，这通过将甲醇注入发酵罐以维持约0.5％(v/v)的浓度来诱导。
7.chauhan等人(process biochemistry 1999,34:139-145)描述了使用aox1缺失宿主(定名为mut-，然而，被理解为muts)，其携带在paox1启动子下表达hbsag的基因。蛋白质表达由甲醇诱发，但发现肉汤中高浓度的甲醇对细胞有毒，因为发现muts细胞对甲醇浓度敏感。
8.karaoglan等人(biotechnol.lett.1995,doi 10.1007/s10529-015-1993-z)描述了对巴斯德毕赤酵母中醇脱氢酶(adh)基因的功能分析。破坏adh3(xm_002491337)和adh
(fn392323)基因。双敲除菌株还产生乙醇。结论是adh基因在乙醇代谢中不起作用；并且ppadh3是在巴斯德毕赤酵母中唯一负责消耗乙醇的基因。
9.singh和narang(biorxiv,doi:10.1101/573519，预印本)描述了在法夫驹形氏酵母(komagataella phaffii)(巴斯德毕赤酵母)的mut
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、muts(aox1-)和mut-(aox1-aox2-)菌株中的β-半乳糖苷酶表达。结论是甲酸盐和/或甲醛很可能是真正的诱导剂，因为两者均诱导在不能从甲酸盐或甲醛合成细胞内甲醇的mut-中的p
aox1
表达，并且提出甲酸盐作为甲醇的有希望的替代品，因为它似乎不会遭受影响甲醇的缺陷。
10.wei shen等人(microbial cell factories 2016,15(1):1-11)描述了无甲醇巴斯德毕赤酵母蛋白质表达系统。两种激酶突变体δgut1和δdak在非甲醇碳源下显示出强的醇氧化酶活性，并且用于构建无甲醇表达系统。
11.ia pla等人(biotechnol prog,2006,pp 881-888)描述了使用aox启动子和甲醇诱发表达scfv的muts和mut+巴斯德毕赤酵母菌株。
12.ep 1905836 a1公开了用于生产重组人干扰素α的巴斯德毕赤酵母菌株，并且提出使用包含突变aox1基因但不完全缺失aox1基因座的aox1受干扰的克隆。
13.ching-hsiang chang等人(bmc biotechnology 2018,18(1):81)提出在使用甲醇表达调控因子1(mxr1)重编程细胞的巴斯德毕赤酵母中的灵活paox1诱发系统。
14.russmayer h.等人(bmc biology 2015,13(1):80)描述了aox在调控巴斯德毕赤酵母表达系统方面的重要性。
15.tomas-gamisans m.等人(microbial biotechnology 2018,11(1):224-237)描述了一种巴斯德毕赤酵母基因组规模的代谢模型，其用于在作为唯一碳源的甲醇或甘油上的改善的预测。
16.moser等人(microbial cell factories 2017,16(1):49)描述了适应性实验室演变以改善巴斯德毕赤酵母的生长和重组蛋白生产。
17.在巴斯德毕赤酵母中的重组蛋白生产需要高强度的过程方案，导致高氧气需要量和热产生，从而需要高生物质(biomass)浓度和甲醇消耗。下游加工中的氧气转移、冷却和生物质分离是昂贵的。因此希望开发出低氧气需要量和热产生的方法。进一步希望增加蛋白质生产的产率，特别是通过碳源的高效使用。


技术实现要素：

18.本发明的目的是改善甲醇营养型酵母中的重组蛋白生产。
19.所述目的由权利要求的主题解决并且如本文进一步描述。
20.本发明提供了重组甲醇利用途径缺陷型甲醇营养型酵母(mut-)宿主细胞，所述宿主细胞是通过以下方式经工程化改造的：
21.a)一种或多种遗传修饰以与在所述一种或多种遗传修饰之前的所述宿主细胞相比减少第一内源基因和第二内源基因的表达，其中
22.i.所述第一内源基因编码包含鉴定为seq id no:1的氨基酸序列或其同源物的醇氧化酶1(aox1)，以及
23.ii.所述第二内源基因编码包含鉴定为seq id no:3的氨基酸序列或其同源物的醇氧化酶2(aox2)，
24.以及
25.b)一种或多种遗传修饰以与在所述一种或多种遗传修饰之前的所述宿主细胞相比增加醇脱氢酶(adh2)基因的表达，其中adh2基因编码醇脱氢酶(adh2)。
26.具体地，adh2蛋白是归类为ec 1.1.1.1的醇脱氢酶。
27.如本文所述，术语“adh2”应指天然醇脱氢酶，诸如包含鉴定为seq id no:50的氨基酸序列(uniprotkb-f2qsx6_kompc；fr839629基因组dna翻译：cca38504.1；基因：pp7435_chr2-0821)或由鉴定为seq id no:50的氨基酸序列组成的巴斯德毕赤酵母醇脱氢酶，或与seq id no:50具有一定同源性(或序列同一性)的序列。
28.具体地，adh2可以源自巴斯德毕赤酵母菌株或者可以是其同源物或直向同源物，所述同源物或直向同源物是天然存在的，源自生物体的野生型细胞或对于生物体的野生型细胞是内源的，所述生物体诸如真核生物，包括例如酵母，特别是甲醇营养型酵母菌株、物种或属的酵母，或者所述同源物或直向同源物是此类天然存在的adh2的突变体。
29.具体地，adh2蛋白是宿主细胞物种中天然存在的或内源的或者是其突变体。
30.具体地，编码巴斯德毕赤酵母醇脱氢酶的基因(本文中称为adh2基因)包含鉴定为seq id no:51的核苷酸序列或编码adh2(所述adh2与seq id no:50具有一定同源性(或序列同一性))的同源多核苷酸(基因)或由鉴定为seq id no:51的核苷酸序列或编码adh2的同源多核苷酸(基因)组成。
31.具体地，adh2基因对于mut-宿主细胞是内源的或异源的。具体地，mut-宿主细胞包含所述adh2基因的一个或多个拷贝。
32.具体地，adh2是以下中的任一种：
33.a)adh2，其为对于酵母物种(特别是甲醇营养型酵母)是内源的包含鉴定为seq id no:50的氨基酸序列或其同源物的巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)adh2；或
34.b)a)的adh2的突变体，其与seq id no:50具有至少60％同一性。
35.同源序列也称为adh2同源物或adh2同源物。
36.示例性同源物描述在图1中：
37.seq id no:52：巴斯德驹形氏酵母(komagataella pastoris)atcc 28485的adh2氨基酸序列
38.seq id no:53：巴斯德驹形氏酵母atcc 28485的adh2基因序列
39.seq id no:54：副多形绪方酵母(ogataea parapolymorpha)dl-1的adh2氨基酸序列
40.seq id no:55：副多形绪方酵母dl-1的adh2基因序列
41.seq id no:56：副多形绪方酵母dl-1的adh2氨基酸序列
42.seq id no:57：副多形绪方酵母dl-1的adh2基因序列
43.seq id no:58：多形绪方酵母(ogataea polymorpha)ncyc 495leu1.1的adh氨基酸序列
44.seq id no:59：多形绪方酵母ncyc 495leu1.1的adh基因序列
45.seq id no:60：多形绪方酵母ncyc 495leu1.1的adh氨基酸序列
46.seq id no:61：多形绪方酵母ncyc 495leu1.1的adh基因序列
47.seq id no:62：酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)yjm627的adh2氨基酸序列
48.seq id no:63：酿酒酵母yjm627的adh2基因序列
49.seq id no:64：麦芽糖假丝酵母(candida maltosa)xu316的adh2氨基酸序列
50.seq id no:65：麦芽糖假丝酵母xu316的adh2基因序列
51.seq id no:66：马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)dmku3-1042的adh4氨基酸序列
52.seq id no:67：马克斯克鲁维酵母dmku3-1042的adh4基因序列
53.seq id no:68：大肠杆菌(escherichia coli)7.1982的adh1氨基酸序列
54.seq id no:69：大肠杆菌7.1982的adh1基因序列
55.seq id no:70：禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)ph-1的adh1氨基酸序列
56.seq id no:71：禾谷镰刀菌ph-1的adh1基因序列
57.具体地，adh2同源物与seq id no:50具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％中任一个的序列同一性。adh2同源物在本文中理解为编码adh2同源物。具体地，确定序列同一性，如本文进一步公开的，例如在比较全长序列时。
58.具体地，同源物或同源序列的特征在于，在野生型宿主细胞中诸如在巴斯德毕赤酵母、特别是巴斯德驹形氏酵母或法夫驹形氏酵母中adh2蛋白的相同定性功能，例如作为醇脱氢酶(ec 1.1.1.1.)。
59.具体地，seq id no:50的同源序列属于除巴斯德毕赤酵母、特别是巴斯德驹形氏酵母或法夫驹形氏酵母以外的物种，例如，驹形氏酵母属或毕赤酵母属的另一种酵母，并且相应内源编码序列的表达增加(例如，敲入)，如本文所述。
60.如果宿主细胞是巴斯德毕赤酵母、特别是巴斯德驹形氏酵母或法夫驹形氏酵母，则adh2蛋白可以包含不同菌株或物种的内源序列，例如seq id no:50)或seq id no:50的同源物，或者突变adh2蛋白的人工序列或由其组成，所述人工序列不是野生型菌株或生物体中天然存在的，特别地，所述人工序列不是甲醇营养型酵母中天然存在的。
61.根据一具体实施例，与野生型巴斯德毕赤酵母中的内源的天然存在的巴斯德毕赤酵母醇脱氢酶的活性相比，同源序列具有至少0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、或甚至更高醇脱氢酶活性中的任一种。醇脱氢酶活性可以在合适的测定中例如通过醇脱氢酶测定使用无细胞提取物来测量。可以通过用氧化锆/二氧化硅/玻璃珠对细胞培养物进行机械破坏获得无细胞提取物，如karaoglan等人(biotechnol lett.2016；38(3):463-9)所述。醇脱氢酶活性可以在形成nadh后通过测量在340nm波长处的吸收增加来测量，如walker(biochemical education.1992 21(1):42-43)所述。nad
+
和醇可以用作底物并且以等摩尔浓度消耗。nadh的产生与nad
+
的消耗呈负相关。可替代地，可以使用商业比色醇脱氢酶活性测定试剂盒(mak053，西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))。示例性测定在本文描述在实施例部分中。
62.如本文所述，术语“aox1”应指天然醇氧化酶1，诸如包含鉴定为seq id no:1的氨基酸序列(uniprotkb-f2qy27)或由其组成的巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1，或与seq id no:1具有一定同源性(或序列同一性)的序列，所述序列可以是巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1的同源物，所述巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1对于甲醇营养型酵母物种是内源的，特别是对于本文中在降低所述内源醇氧化酶1的表达的所述一种或多种遗传修饰之前用作宿主细胞的甲醇
营养型酵母是内源的。特别地，aox1蛋白是对于宿主细胞物种的物种是内源的直向同源物。
63.具体地，编码巴斯德毕赤酵母醇氧化酶1的基因(本文中称为aox1基因)包含鉴定为seq id no:2的核苷酸序列或由鉴定为seq id no:2的核苷酸序列组成。
64.同源序列也称为aox1同源物或aox1同源物。具体地，aox1蛋白或aox1同源物是归类为ec 1.1.3.13的醇氧化酶。
65.具体地，aox1同源物与seq id no:1具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％中的任一个的序列同一性。aox1同源物在本文中被理解为编码aox1同源物。具体地，确定序列同一性，如本文进一步公开的，例如在比较全长序列时。
66.如本文所述，术语“aox2”应指天然醇氧化酶2，诸如包含鉴定为seq id no:3的氨基酸序列(uniprotkb-f2r038)或由鉴定为seq id no:3的氨基酸序列(uniprotkb-f2r038)组成的巴斯德毕赤酵母醇氧化酶2，或与seq id no:3具有一定同源性(或序列同一性)的序列，所述序列可以是巴斯德毕赤酵母醇氧化酶2的同源物，所述巴斯德毕赤酵母醇氧化酶2对于甲醇营养型酵母物种是内源的，特别是在本文中在降低所述内源醇氧化酶2的表达的所述一种或多种遗传修饰之前用作宿主细胞的甲醇营养型酵母是内源的。特别地，aox2蛋白是对于宿主细胞物种的物种是内源的直向同源物。
67.具体地，编码巴斯德毕赤酵母醇氧化酶2的基因(本文中称为aox2基因)包含鉴定为seq id no:4的核苷酸序列或由鉴定为seq id no:4的核苷酸序列组成。
68.同源序列也称为aox2同源物或aox2同源物。具体地，aox2蛋白或aox2同源物是归类为ec 1.1.3.13的醇氧化酶。
69.具体地，aox2同源物与seq id no:3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％中的任一个的序列同一性。aox2同源物在本文中理解为编码aox2同源物。具体地，确定序列同一性，如本文进一步公开的，例如在比较全长序列时。
70.具体地，aox1和/或aox2蛋白是巴斯德毕赤酵母来源的，特别是巴斯德驹形氏酵母或法夫驹形氏酵母来源的，如果宿主细胞是巴斯德毕赤酵母，特别是分别为巴斯德驹形氏酵母和法夫驹形氏酵母的话。可替代地，aox1和aox2蛋白中的每一种包含巴斯德毕赤酵母(特别是巴斯德驹形氏酵母或法夫驹形氏酵母)来源的相应蛋白的同源(或直向同源)序列，所述同源(或直向同源)序列对于野生型宿主细胞(如果是另一种来源或物种)是内源的。例如，如果宿主细胞是法夫驹形氏酵母，则内源aox1或aox2蛋白包含分别鉴定为seq id no:1和seq id no:3的氨基酸序列或由分别鉴定为seq id no:1和seq id no:3的氨基酸序列组成。
71.根据另一实施例，如果宿主细胞是巴斯德驹形氏酵母，则内源aox1蛋白包含鉴定为seq id no:9的氨基酸序列(巴斯德驹形氏酵母，atcc 28485)或由鉴定为seq id no:9的氨基酸序列(巴斯德驹形氏酵母，atcc 28485)组成，所述氨基酸序列与seq id no:1具有99.85％同一性。
72.根据另一实施例，如果宿主细胞是巴斯德驹形氏酵母，则内源aox2蛋白包含鉴定为seq id no:11的氨基酸序列或由鉴定为seq id no:11的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与seq id no:3具有99.40％同一性。
73.示例性同源物描述在图1中：
74.seq id no:9：巴斯德驹形氏酵母atcc 28485的aox1氨基酸序列
75.seq id no:10：巴斯德驹形氏酵母atcc 28485的aox1核苷酸序列
76.seq id no:11：巴斯德驹形氏酵母atcc 28485的aox2氨基酸序列
77.seq id no:12：巴斯德驹形氏酵母atcc 28485的aox2核苷酸序列
78.seq id no:13：甲醇绪方酵母(ogataea methanolica)jcm 10240的mod1氨基酸序列
79.seq id no:14：甲醇绪方酵母jcm 10240的mod1核苷酸序列
80.seq id no:15：甲醇绪方酵母jcm 10240的mod2氨基酸序列
81.seq id no:16：甲醇绪方酵母jcm 10240的mod2核苷酸序列
82.seq id no:17：甲醇绪方酵母jcm 10240的pmod1启动子序列
83.seq id no:18：甲醇绪方酵母jcm 10240的pmod2启动子序列
84.seq id no:19：多形绪方酵母ncyc 495leu 1.1的mox氨基酸序列
85.seq id no:20：多形绪方酵母ncyc 495leu 1.1的mox核苷酸序列
86.seq id no:21：多形绪方酵母ncyc 495leu 1.1的pmox启动子序列
87.然而，如果宿主细胞属于不同物种(除了巴斯德驹形氏酵母和/或法夫驹形氏酵母)，则对于宿主细胞内源的aox1或aox2蛋白序列分别是seq id no:1和seq id no:3的同源物，并且为了本文所述的目的，在宿主细胞中此类同源物(分别为seq id no:1和seq id no:3的直向同源序列)的表达减少。
88.具体地，任何或每个同源序列的特征在于，在野生型宿主细胞中诸如在巴斯德毕赤酵母、特别是巴斯德驹形氏酵母或法夫驹形氏酵母中相应的aox1和aox2蛋白的相同定性功能，例如作为醇氧化酶(ec 1.1.3.13)。
89.具体地，seq id no:1和seq id no:3的相应同源序列属于除巴斯德毕赤酵母、特别是巴斯德驹形氏酵母或法夫驹形氏酵母外的物种，例如，驹形氏酵母属或毕赤酵母属的另一种酵母，并且相应内源编码序列的表达减少或消除(敲除)，如本文所述。
90.具体地，aox1和aox2蛋白两者对于宿主细胞是内源的，并且分别编码aox1和aox2的基因的表达减少或缺失。
91.具体地，aox1和aox2蛋白两者是相同来源的，源自于在其经工程化改造以减少所述第一内源基因和第二内源基因的表达之前的相同宿主细胞(或宿主细胞物种)或对于所述相同宿主细胞(或宿主细胞物种)是内源的。
92.具体地，aox1和aox2蛋白两者是巴斯德毕赤酵母来源的，特别是由对于宿主细胞是内源的相应基因编码的蛋白质，其中宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。
93.具体地，aox1和aox2蛋白两者是法夫驹形氏酵母(komagataella phaffii)来源的，特别是由对于宿主细胞是内源的相应基因编码的蛋白质，其中宿主细胞是法夫驹形氏酵母。
94.具体地，aox1和aox2蛋白两者是巴斯德驹形氏酵母来源的，特别是由对于宿主细胞是内源的相应基因编码的蛋白质，其中宿主细胞是巴斯德驹形氏酵母。
95.根据一个具体方面，所述一种或多种遗传修饰包括破坏、取代、缺失、敲入或敲除(i)一个或多个多核苷酸或其一部分；或(ii)表达控制序列。
96.根据一个具体方面，所述一种或多种遗传修饰针对的是本文所述宿主细胞的一种或多种内源多核苷酸，诸如编码多核苷酸，包括例如编码相应aox1、aox2或adh2蛋白(特别
是宿主细胞物种、类型或菌株中天然存在的野生型(未经修饰或天然的)蛋白)的所述多核苷酸(或基因)；或控制所述多核苷酸(或基因)的表达的核苷酸序列。
97.根据一个具体方面，所述一种或多种遗传修饰针对的是表达控制序列，包括例如启动子、核糖体结合位点、转录或翻译起始和终止序列；或针对的是增强子或激活子序列。
98.可以采用多种工程化改造宿主细胞的方法来调节(减少或增加)内源多核苷酸的表达，诸如
99.a)减少编码相应aox1或aox2蛋白的基因的表达，包括例如破坏编码相应aox1或aox2蛋白的多核苷酸、破坏与此类多核苷酸可操作地连接的启动子、将此类启动子用另一种具有更低启动子活性的启动子替代；或
100.b)增加编码adh2蛋白的基因的表达，包括例如将编码adh2蛋白的多核苷酸引入宿主细胞基因组中、破坏与此类多核苷酸可操作地连接的启动子、将此类启动子用另一种具有更高启动子活性的启动子替代。
101.修饰基因表达的具体方法采用：调节(例如，激活、上调、失活、抑制或下调)调节多核苷酸(基因)的表达的调控序列(诸如通过在基于crispr的修饰宿主细胞的方法中使用的rna引导的核糖核酸酶使用靶向相关序列的相应转录调节因子)，例如选自由以下项组成的组的调控序列：启动子、核糖体结合位点、转录起始或终止序列、翻译起始或终止序列、增强子或激活子序列、阻遏子或抑制子序列、信号或前导序列，特别是控制蛋白质表达和/或分泌的那些序列。
102.根据一个具体方面，所述一种或多种遗传修饰包括所述adh2基因的功能获得性改变，其导致adh2水平或活性增加。
103.具体地，所述功能获得性改变包括敲入adh2基因。
104.具体地，所述功能获得性改变上调所述细胞中的adh2基因表达。
105.具体地，所述功能获得性改变包括插入异源表达盒以在所述细胞中过表达adh2基因。
106.具体地，所述异源表达盒包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含在启动子序列的控制下的adh2基因。此类启动子可以是组成型启动子、阻遏型启动子或诱导型启动子中的任意。
107.具体地，增加基因表达的所述一种或多种遗传修饰包括一个或多个基因组突变，包括基因或基因组序列的插入或激活(例如，通过敲入异源基因或增加内源基因的拷贝数)，其使基因或基因的一部分的表达与未经此类遗传修饰的相应宿主相比增加至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或甚至更多。
108.具体地，增加表达的一种或多种遗传修饰包括组成性地改善或以其他方式增加一种或多种内源多核苷酸的表达的基因组突变。
109.具体地，增加表达的一种或多种遗传修饰包括引入一个或多个诱导型或阻遏型调控序列的基因组突变，所述调控序列有条件地改善或以其他方式增加一种或多种内源多核苷酸的表达。此类条件活性的修饰特别针对依赖于细胞培养条件而有活性和/或表达的那些调控元件和基因。
110.具体地，当在生产目的蛋白(poi)的方法中使用宿主细胞时，编码adh2蛋白的多核苷酸的表达增加。具体地，在遗传修饰后，adh2蛋白的表达在产生poi的宿主细胞培养条件
下增加。
111.具体地，宿主细胞经遗传修饰以使adh2蛋白的量(例如，水平、活性或浓度)与未经所述修饰(例如，通过敲入一个或多个相应adh2基因)的宿主细胞相比增加至少以下中的任一个：50％、60％、70％、80％、90％或95％(mol/mol)或甚至更多。根据一个具体实施方案，宿主细胞经遗传修饰以(一个或多个)基因组序列、特别是被整合到宿主细胞基因组中的编码相应adh2蛋白的基因组序列的一个或多个插入。此类宿主细胞通常作为敲入菌株提供。
112.根据一个具体实施方案，一旦本文所述的宿主细胞在细胞培养物中培养，宿主细胞或宿主细胞培养物中adh2蛋白的总量与通过在此类遗传修饰之前或未经此类遗传修饰的宿主细胞表达或产生的参考量相比、或与在相应宿主细胞培养物中产生的参考量相比、或与在所述修饰之前或未经所述修饰的宿主细胞相比增加至少以下中的任一个：50％、60％、70％、80％、90％或95％(活性％或mol/mol)或甚至100％或更多。
113.具体地，减少基因(诸如aox1和/或aox2基因)表达的所述一种或多种遗传修饰包括一个或多个基因组突变，包括基因或基因组序列的缺失或失活(例如，通过基因敲除)，其使基因或基因的一部分的表达与未经此类遗传修饰的相应宿主相比减少至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或甚至完全消除其表达。
114.具体地，减少表达的一种或多种遗传修饰包括组成性地损害或以其他方式减少一种或多种内源多核苷酸的表达的基因组突变。
115.具体地，减少表达的一种或多种遗传修饰包括引入一个或多个诱导型或阻遏型调控序列的基因组突变，所述调控序列有条件地损害或以其他方式减少一种或多种内源多核苷酸的表达。此类条件活性的修饰特别针对依赖于细胞培养条件而有活性和/或表达的那些调控元件和基因。
116.具体地，当在生产目的蛋白(poi)的方法中使用宿主细胞时，所述一种或多种内源多核苷酸的表达减少，从而减少编码相应aox1或aox2蛋白的多核苷酸的表达。具体地，在遗传修饰后，aox1和aox2蛋白两者的表达在产生poi的宿主细胞培养条件下减少。
117.具体地，宿主细胞经遗传修饰(例如，通过敲除相应的aox1和aox2基因)以使aox1和aox2蛋白两者的量(例如，水平、活性或浓度)与未经所述修饰的宿主细胞相比减少至少以下中的任一个：50％、60％、70％、80％、90％或95％(活性％或mol/mol)或甚至100％，例如至不可检测的量，从而完全消除aox1和aox2蛋白两者的产生。根据一个具体实施方案，宿主细胞经遗传修饰以包含(一个或多个)基因组序列、特别是编码相应aox1和/或aox2蛋白的基因组序列的一个或多个缺失。此类宿主细胞通常作为缺失或敲除菌株提供。
118.根据一个具体方面，所述第一内源基因和/或第二内源基因通过所述一种或多种遗传修饰被敲除。具体地，mut-宿主细胞是δaox1/δaox2敲除菌株。
119.根据一个具体方面，所述第一内源基因和/或第二内源基因通过所述一种或多种遗传修饰被敲除；并且所述adh2基因通过所述一种或多种遗传修饰被敲入。具体地，mut-宿主细胞是δaox1/δaox2+adh2-oe菌株。
120.根据一个具体实施方案，一旦本文所述的宿主细胞在细胞培养物中培养，宿主细胞或宿主细胞培养物中相应aox1和/或aox2蛋白的总量与通过在此类遗传修饰之前或未经此类遗传修饰的宿主细胞表达或产生的参考量相比、或与在相应宿主细胞培养物中产生的参考量相比、或与在所述修饰之前或未经所述修饰的宿主细胞相比减少至少以下中的任一
个：50％、60％、70％、80％、90％或95％(mol/mol)或甚至100％，例如至不可检测的量。
121.当针对所述遗传修饰增加或减少相应adh2、aox1或aox2蛋白的产生的作用比较本文所述的宿主细胞时，通常将其与在此类遗传修饰之前或未经此类遗传修饰的可比较宿主细胞相比。通常与未经此类遗传修饰(或在此类遗传修饰之前)的相同宿主细胞物种或类型进行比较，所述宿主细胞物种或类型经工程化改造以产生重组或异源poi，特别是当在产生所述poi的条件下培养时。然而，也可以与未经进一步工程化改造以产生重组或异源poi的相同宿主细胞物种或类型进行比较。
122.根据一个具体方面，相应adh2、aox1或aox2蛋白的增加或减少通过细胞中相应蛋白质的量(例如，水平、活性或浓度)的增加或减少来确定。具体地，所述蛋白质的量通过合适的方法来确定，所述合适的方法诸如采用蛋白质印迹、免疫荧光成像、流式细胞术或质谱法，特别是其中质谱法是液相色谱-质谱法(lc-ms)或液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)，例如，如doneanu等人(mabs.2012；4(1):24-44)所述。根据一个具体实施例，醇脱氢酶活性可以通过活性测定使用无细胞提取物来测量。可以通过用氧化锆/二氧化硅/玻璃珠对细胞培养物进行机械破坏获得无细胞提取物，如karaoglan等人(biotechnol lett.2016；38(3):463-9)所述。醇脱氢酶活性通过在形成nadh后直接通过测量在340nm波长处的吸收增加来测量，如walker(biochemical education.1992 21(1):42-43)所述。nad
+
和醇用作底物并且以等摩尔浓度消耗。nadh的产生与nad
+
的消耗呈负相关。可替代地，可以使用商业比色醇脱氢酶活性测定试剂盒(mak053，西格玛奥德里奇公司)。醇氧化酶活性可以用与过氧化氢反应的2,2'-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸以量热方式测量，如verduyn等人(journal of microbiological methods.1984(2)1:15-25)所述，或通过测量所形成的甲醛的量来测量，如couder和baratti(agric.bioi.chern.1980；44(10):2279-2289)所述。在本文的实施例部分中描述了详细的测定。
123.根据一个具体方面，mut-宿主细胞包含异源目的基因表达盒(goiec)，所述异源目的基因表达盒包含与编码目的蛋白(poi)的目的基因(goi)可操作地连接的表达盒启动子(ecp)。
124.根据一个具体方面，mut-宿主细胞是包含至少一个异源goiec的重组宿主细胞，其中在goiec中包含的至少一个组分或组分的组合对于宿主细胞是异源的。具体地，使用人工表达盒，特别是其中启动子和goi是彼此异源的，在自然界中不以这样的组合出现，例如其中启动子和goi中的任一个(或仅一个)相对于另一个和/或本文所述的宿主细胞是人工的或异源的；启动子是内源启动子并且goi是异源goi；或启动子是人工或异源启动子并且goi是内源goi；其中启动子和goi两者都是人工的、异源的或来自不同来源，诸如与本文所述的宿主细胞相比来自不同物种或类型(菌株)的细胞。具体地，在用作本文所述宿主细胞的细胞中，ecp不与所述goi天然相关和/或不与其可操作地连接。
125.具体地，goiec包含组成型启动子、诱导型启动子或阻遏型启动子。
126.组成型启动子的具体实例包括例如pgap及其功能变体、wo 2014139608中公开的任何组成型启动子，诸如pcs1。
127.诱导型启动子或阻遏型启动子的具体实例包括例如天然paox1或paox2及其功能变体、wo 2013050551中公开的任何调控启动子，诸如pg1-pg8及其片段；wo 2017021541 a1中公开的任何调控启动子，诸如pg1和pg1-x。
128.用于酵母宿主细胞的合适启动子描述在mattanovich等人(methods mol.biol.(2012)824:329-58)中并且包括糖酵解酶，如磷酸丙糖异构酶(tpi)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh或gap)及其变体、乳糖酶(lac)和半乳糖苷酶(gal)、巴斯德毕赤酵母葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子(ppgi)、3-磷酸甘油酸激酶启动子(ppgk)、甘油醛磷酸脱氢酶启动子(pgap)、翻译延伸因子启动子(ptef)、和巴斯德毕赤酵母烯醇酶1(pen01)启动子、丙糖磷酸异构酶(ptpi)、核糖体亚基蛋白(prps2、prps7、prps31、prpl1)、醇氧化酶启动子(paox1、paox2)或其具有修饰特征的变体、甲醛脱氢酶启动子(pfld)、异柠檬酸裂解酶启动子(picl)、α-酮异己酸脱羧酶启动子(pthi)、热休克蛋白家族成员(pssa1、phsp90、pkar2)启动子、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(pgnd1)、磷酸甘油酸变位酶(pgpm1)、转酮醇酶(ptkl1)、磷脂酰肌醇合酶(ppis1)、铁-02-氧化还原酶(pfet3)、高亲和性铁通透酶(pftr1)、阻遏型碱性磷酸酶(pph08)、n-肉豆蔻酰基转移酶(pnmt1)、信息素反应转录因子(pmcm1)、泛素(pubi4)、单链dna内切核酸酶(prad2)、线粒体内膜的主要adp/atp载体的启动子(ppet9)(wo 2008/128701)和甲酸脱氢酶(fmd)启动子。
129.合适启动子的其他示例包括酿酒酵母烯醇酶(eno1)、酿酒酵母半乳糖激酶(gal1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(adh1、adh2/gap)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(tpi)、酿酒酵母金属硫蛋白(cup1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶(pgk)、和麦芽糖酶基因启动子(mal)。
130.gap启动子(pgap)、aox1(paox1)或aox2(paox2)启动子或作为其功能变体和源自pgap或paox1或paox2中任一种的启动子是特别优选的。paox启动子可以通过甲醇诱导并且被葡萄糖阻遏。具体地，功能变体至少与衍生其的启动子具有至少80％、85％、90％、95％或100％中的任一个的序列同一性，并且与衍生其的启动子相比具有大约相同的启动子活性(例如，+/-50％、40％、30％、20％或10％中的任一个；尽管启动子活性可能改善)。
131.根据一个具体实施方案，ecp是可甲醇诱导的。特别地，ecp是由甲醇控制的。具体地，在含有甲醇的细胞培养物中可以完全诱导ecp。在这种情况下，甲醇不仅可以用作供应于细胞培养物的能量源，还可以在诱导ecp时诱导poi表达。
132.根据一个具体方面，通过用作产生poi的碳源的在细胞培养物中存在的甲醇的量，ecp是可甲醇诱导的。具体地，通过异源表达盒的goi表达可通过甲醇诱导型ecp诱导。
133.具体地，ecp是可甲醇诱导的，并且例如，在细胞培养基或上清液中不存在小于0.1％、0.05％或0.01％(v/v)中的任一个的甲醇量(本文中称为启动子阻遏量)的情况下被阻遏。
134.具体地，ecp是可甲醇诱导的，并且例如，在细胞培养基或上清液中存在比启动子阻遏量高例如至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2.0％、2.5％或3％(v/v)中的一个的甲醇量(本文中称为启动子诱导量)的情况下被诱导。
135.具体地，如本文所述的细胞培养方法中所用的甲醇量完全诱导ecp。如果培养条件提供约最大诱导，则认为ecp启动子被完全诱导。
136.细胞培养基或上清液中的此类量特别理解为在向宿主细胞进料并且被宿主细胞消耗后可以检测到的量。通常，当在细胞培养物的生产阶段产生poi时，通过以下方式向细胞培养物进料：添加补充碳源，但其量在poi生产期间立即被细胞消耗，因此，在细胞培养基或上清液中不留下或仅留下低的剩余量，例如至多1.0g/l的量。
137.具体地，ecp对于宿主细胞是内源的或异源的。
138.具体地，ecp是以下中的任一种：
139.a)paox1启动子，其包括与seq id no:5至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一个的序列同一性或由与seq id no:5至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一个的序列同一性组成；或
140.b)paox2启动子，其包括与seq id no:6至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一个的序列同一性或由与seq id no:6至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一个的序列同一性组成；或
141.c)包含选自由seq id no:36-49组成的组的核苷酸序列或由选自由seq id no:36-49组成的组的核苷酸序列组成的启动子。
142.具体地，可以使用在表38中列出的任何甲醇诱导型启动子，特别是包含选自由seq id no:36-49组成的组的核苷酸序列或由选自由seq id no:36-49组成的组的核苷酸序列组成的那些。
143.以至少60％的序列同一性为特征的功能paox1和paox2启动子变体由本文进一步描述的示例性甲醇诱导型启动子举例。例如，seq id no:17(甲醇绪方酵母jcm 10240的pmod1启动子序列)与seq id no:5相比具有54.0％的序列同一性；并且seq id no:18(甲醇绪方酵母jcm 10240的pmod2启动子序列)与seq id no:6相比具有53.7％的序列同一性。pmod1和pmod2启动子与相应paox1和paox2启动子相比的序列同一性已使用lalign版本36.3.8g 2017年12月通过比对来确定；结果涉及与相同序列取向比对并且最高重叠的序列(参数：矩阵：+5/-4；空位开放：-5；空位延伸：-4；e()阈值10.0；输出格式：markx 0；图形：是)。
144.其他示例性甲醇诱导型启动子列出在表38中或是pshb17、pald4、pfdh1、pdas1、pdas2、ppmp20、pfba1-2 ppmp47、pfld、pfgh1、ptal1-2、pdas2、pcam1、ppp7435_chr1-0336，如gasser等人(gasser,steiger和mattanovich,2015,microb cell fact.14:196)所描述。
145.如本文所述，术语“paox1”应指包含鉴定为seq id no:5的序列或与seq id no:5具有一定同源性(或序列同一性)的序列的启动子两者。同源序列也称为paox1同源物。paox1同源物可以是天然的天然存在的序列或例如通过任何合适的诱变方法产生的其突变体。
146.如本文所述，术语“paox2”应指包含鉴定为seq id no:6的序列或与seq id no:6具有一定同源性(或序列同一性)的序列的启动子两者。同源序列也称为paox2同源物。paox2同源物可以是天然的天然存在的序列或例如通过任何合适的诱变方法产生的其突变体。
147.本文所述的paox1或paox2突变体的具体特征在于启动子强度与当处于诱导状态时的相应天然paox1或paox2启动子相比增加约0.5倍至至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.3倍、3.5倍、3.8倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍或至少6倍中的任一个，如在可比较的表达系统或生产宿主细胞系中所确定的。
148.具体地，启动子强度通过poi(诸如模型蛋白(例如，绿色荧光蛋白gfp，包括例如增强型gfp、egfp，基因库(gene bank)登录号u57607))的表达水平和/或与参考启动子相比的
no:24的酿酒酵母天然α配对因子的信号序列或其突变体。
162.根据一个具体方面，本文所述的宿主细胞可以经受一种或多种进一步的遗传修饰，例如用于改善蛋白质生产。
163.具体地，宿主细胞经进一步工程化改造以修饰影响蛋白水解活性的一个或多个基因，其用于产生蛋白酶缺陷型菌株，特别是羧肽酶y活性缺陷型菌株。wo1992017595 a1中描述了具体的实例。us6153424a中描述了具有液泡蛋白酶(vacuolar protease)(诸如蛋白酶a或蛋白酶b)功能缺陷的蛋白酶缺陷型毕赤酵母属菌株的其他实例。其他实例是具有ade2缺失和/或蛋白酶基因pep4和prb1中的一个或两个的缺失的毕赤酵母属菌株，由例如赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific)提供。
164.具体地，宿主细胞经工程化改造以修饰编码功能基因产物、特别是蛋白酶的至少一个核酸序列，选自由以下项组成的组：pep4、prb1、yps1、yps2、ymp1、ymp2、ymp1、dap2、grhl、prd1、ysp3和prb3，如wo 2010099195 a1中所公开的。
165.特定地应用编码辅助因子的基因的过表达或欠表达以增强goi的表达，例如，如wo 2015158800 a1中所描述的。
166.poi可以是宿主细胞的真核肽、原核肽或合成肽、多肽、蛋白质或代谢物中的任一种。
167.根据一个具体方面，poi对于mut-宿主细胞或ecp是异源的。
168.具体地，poi对于宿主细胞物种是异源的。
169.具体地，poi是分泌肽、多肽或蛋白质，即从宿主细胞分泌到细胞培养物上清液中的。
170.具体地，poi是真核蛋白质，优选哺乳动物来源的或相关的蛋白质(诸如人蛋白质或包含人蛋白质序列的蛋白质)或细菌蛋白质或细菌来源的蛋白质。
171.优选地，poi是在哺乳动物中起作用的治疗蛋白。
172.在具体情况下，poi是多聚体蛋白质，特别是二聚体或四聚体。
173.具体地，poi是选自由以下项组成的组的肽或蛋白质：抗原结合蛋白、治疗蛋白、酶、肽、蛋白抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白质缀合物、结构蛋白、调控蛋白、疫苗抗原、生长因子、激素、细胞因子、加工酶。
174.具体地，抗原结合蛋白选自由以项下组成的组：
175.a)抗体或抗体片段，诸如嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、fab、fd、scfv、双体抗体、三体抗体、fv四聚体、微型抗体、单结构域抗体(如vh、vhh、ignar或v-nar)中的任意；
176.b)抗体模拟物，诸如adnectin、亲和体(affibody)、affilin、affimer、affitin、α体、anticalin、avimer、darpin、fynomer、kunitz结构域肽、单体(monobody)或nanoclamps；或
177.c)包含一个或多个免疫球蛋白折叠结构域、抗体结构域或抗体模拟物的融合蛋白。
178.具体的poi是抗原结合分子，诸如抗体或其片段，特别是包含抗原结合结构域的抗体片段。具体的poi有抗体，诸如单克隆抗体(mab)、免疫球蛋白(ig)或g类免疫球蛋白(igg)、重链抗体(hcab)；或其片段，诸如抗原结合片段(fab)、fd、单链可变片段(scfv)；或
其工程化改造变体，诸如例如fv二聚体(双体抗体)、fv三聚体(三体抗体)、fv四聚体或微型抗体和单结构域抗体(如vh、vhh、ignar或v-nar)或包含免疫球蛋白折叠结构域的任何蛋白质。其他抗原结合分子可以选自抗体模拟物或(替代)支架蛋白，诸如例如经工程化改造的kunitz结构域、adnectin、亲和体、affiline、anticalin或darpin。
179.根据一个具体方面，poi是例如botox、myobloc、neurobloc、dysport(或肉毒杆菌神经毒素的其他血清型)、阿糖苷酶α、达托霉素、yh-16、绒膜促性腺激素α、非格司亭(filgrastim)、西曲瑞克(cetrorelix)、白介素-2、阿地白介素、替西白介素(teceleulin)、地尼白介素(denileukin diftitox)、干扰素α-n3(注射剂)、干扰素α-nl、dl-8234、干扰素、suntory(γ-1a)、干扰素γ、胸腺素α1、他索纳明(tasonermin)、digifab、viperatab、echitab、crofab、奈西立肽、阿巴西普、阿法赛特(alefacept)、rebif、依托特明那法(eptoterminalfa)、特立帕肽(骨质疏松症)、可注射降血钙素(骨病)、降血钙素(鼻用，骨质疏松症)、依那西普、聚戊二醛血红蛋白(hemoglobin glutamer)250(牛)、替加色罗(drotrecogin)α、胶原酶、卡培立肽、重组人表皮生长因子(外用凝胶、伤口愈合)、dwp401、达贝泊汀α(darbepoetin alpha)、依泊汀(epoetin)ω、依泊汀β、依泊汀α、地西卢定(desirudin)、来匹卢定(lepirudin)、比伐卢定、诺那凝血素(nonacog)α、mononine、依他凝血素(eptacog)α(活化)、重组因子viii+vwf、recombinate、重组因子viii、因子viii(重组)、alphnmate、辛凝血素(octocog)α、因子viii、帕利夫明(palifermin)、indikinase、替奈普酶、阿替普酶、帕米普酶(pamiteplase)、瑞替普酶、那替普酶、孟替普酶、促滤泡素α、rfsh、hpfsh、米卡芬净(micafungin)、聚乙二醇非格司亭、来格司亭、那托司亭、舍莫瑞林、胰高血糖素、艾塞那肽、普兰林肽、伊米苷酶(iniglucerase)、加硫酶、leucotropin、molgramostirn、醋酸曲普瑞林、组氨瑞林(histrelin)(皮下植入物，hydron)、德舍瑞林(deslorelin)、组氨瑞林、那法瑞林、亮丙瑞林缓释贮库(atrigel)、亮丙瑞林植入物(duros)、戈舍瑞林、eutropin、kp-102程序、生长激素(somatropin)、美卡舍明(生长异常)、恩夫韦替(enlfavirtide)、org-33408、甘精胰岛素、赖谷胰岛素、胰岛素(吸入)、赖脯胰岛素、地特胰岛素(insulin deternir)、胰岛素(经颊，rapidmist)、美卡舍明-林菲培、阿那白滞素、西莫白介素、99mtc-阿西肽锝(apcitide)注射液、myelopid、倍泰龙(betaseron)、醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)、gepon、沙格司亭、奥普瑞白介素、人白细胞源性α干扰素s、倍尔来福(bilive)、胰岛素(重组)、重组人胰岛素、天冬胰岛素、mecasenin、罗扰素(roferon)-a、干扰素-α2、alfaferone、干扰素alfacon-1、干扰素α、阿沃纳斯(avonex)重组人黄体化激素、脱氧核糖核酸酶(dornase)α、曲弗明、齐考诺肽、他替瑞林、地波特明α(diboterminalfa)、阿托西班、贝卡普勒明、依替巴肽、zemaira、ctc-111、shanvac-b、hpv疫苗(四价)、奥曲肽、兰瑞肽、ancestirn、半乳糖苷酶(agalsidase)β、半乳糖苷酶α、拉罗尼酶、醋肽铜(prezatide copper acetate)(外用凝胶)、拉布立酶、兰尼单抗(ranibizumab)、actimmune、peg-intron、tricomin、重组屋尘螨过敏脱敏注射液、重组人甲状旁腺激素(pth)1-84(皮下，骨质疏松症)、依泊汀δ、转基因抗凝血酶iii、granditropin、vitrase、重组胰岛素、干扰素-α(口服锭剂)、gem-21s、伐普肽、艾度硫酸酯酶(idursulfase)、奥马曲拉(omnapatrilat)、重组血清白蛋白、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、谷卡匹酶(glucarpidase)、人重组c1酯酶抑制剂(血管性水肿)、拉诺普酶(lanoteplase)、重组人生长激素、恩夫韦地(无针注射液，biojector 2000)、vgv-1、干扰素(α)、芦西纳坦
(lucinactant)、阿肽地尔(aviptadil)(吸入，肺病)、艾替班特(icatibant)、艾卡拉肽(ecallantide)、奥米加南(omiganan)、aurograb、醋酸培西加南(pexigananacetate)、adi-peg-20、ldi-200、地加瑞克(degarelix)、贝辛白介素(cintredelinbesudotox)、favld、mdx-1379、isatx-247、利拉鲁肽、特立帕肽(骨质疏松症)、替法可近(tifacogin)、aa4500、t4n5脂质体洗剂、卡妥索单抗(catumaxomab)、dwp413、art-123、chrysalin、去氨普酶、安地普酶(amediplase)、绒促卵泡素(corifollitropin)α、th-9507、替度鲁肽(teduglutide)、diamyd、dwp-412、生长激素(缓释注射液)、重组g-csf、胰岛素(吸入，air)、胰岛素(吸入，technosphere)、胰岛素(吸入，aerx)、rgn-303、diapep277、干扰素β(丙型肝炎病毒感染(hcv))、干扰素α-n3(口服)、贝拉西普(belatacept)、经皮胰岛素贴剂、amg-531、mbp-8298、xerecept、奥培巴康(opebacan)、aidsvax、gv-1001、lymphoscan、豹蛙酶(ranpirnase)、lipoxysan、卢舒普肽(lusupultide)、mp52(β-磷酸三钙载体，骨再生)、黑色素瘤疫苗、西普鲁塞(sipuleucel)-t、ctp-37、insegia、vitespen、人凝血酶(冷冻，手术出血)、凝血酶、transmid、alfimeprase、普瑞凯希(puricase)、特利加压素(terlipressin)(静脉，肝肾综合征)、eur-1008m、重组fgf-i(可注射，血管疾病)、bdm-e、罗替加肽(rotigaptide)、etc-216、p-113、mbi-594an、耐久霉素(吸入，囊性纤维化)、scv-07、opi-45、内皮抑素、血管抑素、abt-510、bowman birk抑制剂浓缩物、xmp-629、99mtc-hynic-annexin v、kahalalide f、ctce-9908、替维瑞克(延长释放)、ozarelix、rornidepsin、bay-504798、白介素4、prx-321、pepscan、iboctadekin、重组人乳铁蛋白(rhlactoferrin)、tru-015、il-21、atn-161、西仑吉肽、白蛋白干扰素(albuferon)、biphasix、irx-2、ω干扰素、pck-3145、cap-232、帕瑞肽(pasireotide)、hun901-dmi、卵巢癌免疫治疗疫苗、sb-249553、oncovax-cl、oncovax-p、blp-25、cervax-16、多表位肽黑色素瘤疫苗(mart-1，gp100，酪氨酸酶)、奈米非肽(nemifitide)、raat(吸入)、raat(皮肤病学)、cgrp(吸入，哮喘)、pegsunercept、胸腺素β4、plitidepsin、gtp-200、雷莫拉宁(ramoplanin)、graspa、obi-1、ac-100、鲑降血钙素(口服，eligen)、降血钙素(口服，骨质疏松症)、艾沙瑞林(examorelin)、卡莫瑞林(capromorelin)、cardeva、维拉夫明(velafermin)、131i-tm-601、kk-220、t-10、乌拉立肽(ularitide)、地来司他(depelestat)、hematide、chrysalin(外用)、rnapc2、重组因子v111(聚乙二醇化脂质体)、bfgf、聚乙二醇化重组葡萄球菌激酶变体、v-10153、sonolysis prolyse、neurovax、czen-002、胰岛细胞新生疗法、rglp-1、bim-51077、ly-548806、艾塞那肽(受控释放，medisorb)、ave-0010、ga-gcb、阿伏瑞林(avorelin)、acm-9604、醋酸利那洛肽(linaclotid eacetate)、ceti-1、hemospan、val(可注射)、快速作用的胰岛素(可注射，viadel)、鼻内胰岛素、胰岛素(吸入)、胰岛素(口服，eligen)、重组甲硫氨酰基人瘦素、匹曲白滞素(pitrakinra)皮下注射，eczema)、匹曲白滞素(吸入干粉，哮喘)、multikine、rg-1068、mm-093、nbi-6024、at-001、pi-0824、org-39141、cpn10(自身免疫性疾病/炎症)、talactoferrin(外用)、rev-131(眼科)、rev-131(呼吸疾病)、口服重组人胰岛素(糖尿病)、rpi-78m、奥普瑞白介素(口服)、cyt-99007 ctla4-ig、dty-001、伐拉司特(valategrast)、干扰素α-n3(外用)、irx-3、rdp-58、tauferon、胆盐刺激脂酶、merispase、碱性磷酸酶、ep-2104r、美拉诺坦(melanotan)-ii、布雷默浪丹(bremelanotide)、atl-104、重组人微纤溶酶、ax-200、semax、acv-1、xen-2174、cjc-1008、强啡肽a、si-6603、lab ghrh、aer-002、bgc-728、疟疾疫苗(病毒颗粒，pevipro)、altu-135、细小病毒b19疫苗、流感疫苗(重组神经氨酸
苷酶)、疟疾/hbv疫苗、炭疽疫苗、vacc-5q、vacc-4x、hiv疫苗(口服)、hpv疫苗、tat类毒素、yspsl、chs-13340、pth(1-34)脂质体乳膏(novasome)、ostabolin-c、pth类似物(外用，银屑病)、mbri-93.02、mtb72f疫苗(结核病)、mva-ag85a疫苗(结核病)、fara04、ba-210、重组瘟疫fiv疫苗、ag-702、oxsodrol、rbetv1、der-p1/der-p2/der-p7过敏原靶向疫苗(尘螨过敏)、pr1肽抗原(白血病)、突变ras疫苗、hpv-16e7脂肽疫苗、迷路(labyrinthin)疫苗(腺癌)、cml疫苗、wt1-肽疫苗(癌症)、idd-5、cdx-110、pentrys、norelin、cytofab、p-9808、vt-111、艾罗卡肽(icrocaptide)、替柏明(telbermin)(皮肤病学，糖尿病足部溃疡)、芦平曲韦(rupintrivir)、reticulose、rgrf、ha、α-半乳糖苷酶a、ace-011、altu-140、cgx-1160、血管紧张素治疗疫苗、d-4f、etc-642、app-018、rhmbl、scv-07(口服，结核病)、drf-7295、abt-828、erbb2特异性免疫毒素(抗癌)、dt3ssil-3、tst-10088、pro-1762、combotox、肠促胰酶肽-b/胃泌素受体结合肽、111in-hegf、ae-37、trasnizumab-dm1、拮抗剂g、il-12(重组)、pm-02734、imp-321、rhigf-bp3、blx-883、cuv-1647(外用)、基于l-19的放射免疫治疗药(癌症)、re-188-p-2045、amg-386、dc/1540/klh疫苗(癌症)、vx-001、ave-9633、ac-9301、ny-eso-1疫苗(肽)、na17.a2肽、黑色素瘤疫苗(脉冲抗原治疗药)、前列腺癌疫苗、cbp-501、重组人乳铁蛋白(干眼症)、fx-06、ap-214、wap-8294a(可注射)、acp-hip、sun-11031、肽yy[3-36](肥胖症，鼻内)、fgll、阿塞西普(atacicept)、br3-fc、bn-003、ba-058、人甲状旁腺激素1-34(经鼻，骨质疏松症)、f-18-ccr1、at-1100(乳糜泻/糖尿病)、jpd-003、pth(7-34)脂质体乳膏(novasome)、耐久霉素(眼科，干眼症)、cab-2、ctce-0214、糖基聚乙二醇化促红细胞生成素、epo-fc、cnto-528、amg-114、jr-013、因子xiii、氨基康定(aminocandin)、pn-951、716155、sun-e7001、th-0318、bay-73-7977、替维瑞克(立即释放)、ep-51216、hgh(受控释放，biosphere)、ogp-i、西夫韦肽(sifuvirtide)、tv4710、alg-889、org-41259、rhcc10、f-991、胸腺五肽(thymopentin)(肺病)、r(m)crp、肝脏选择性胰岛素、subalin、l19-il-2融合蛋白、弹力素、nmk-150、altu-139、en-122004、rhtpo、促血小板生成素受体激动剂(血小板减少障碍)、al-108、al-208、神经生长因子拮抗剂(疼痛)、slv-317、cgx-1007、inno-105、口服特立帕肽(eligen)、gem-os1、ac-162352、prx-302、lfn-p24融合疫苗(therapore)、ep-1043、肺炎链球菌(s pneumoniae)儿科疫苗、疟疾疫苗、b群脑膜炎奈瑟氏菌(neisseria meningitidis)疫苗、新生儿b群链球菌疫苗、炭疽疫苗、hcv疫苗(gpe1+gpe2+mf-59)、中耳炎疗法、hcv疫苗(核心抗原+iscomatrix)、hpth(1-34)(经皮，viaderm)、768974、syn-101、pgn-0052、阿维库明(aviscumnine)、bim-23190、结核病疫苗、多表位酪氨酸酶肽、癌症疫苗、enkastim、apc-8024、gi-5005、acc-001、tts-cd3、血管靶向tnf(实体瘤)、去氨加压素(颊受控释放)、奥那西普(onercept)、或tp-9201、阿达木单抗(humira)、英利昔单抗(infliximab)(remicade
tm
)、利妥昔单抗(rituxan
tm
/mab thera
tm
)、依那西普(enbrel
tm
)、贝伐单抗(avastin
tm
)、曲妥单抗(herceptin
tm
)、聚乙二醇非格司亭(pegrilgrastim)(neulasta
tm
)、或任何其他合适的poi，包括生物类似物和biobetter。
[0180]
根据一个具体方面，从细胞培养物中分离出发酵产物，所述发酵产物包含poi或从mut-宿主细胞获得的宿主细胞代谢物。
[0181]
根据一个具体方面，mut-宿主细胞是毕赤酵母属(pichia)、驹形氏酵母属(komagataella)、汉逊酵母属(hansenula)、绪方酵母属(ogataea)或假丝酵母属(candida)的酵母细胞。
[0182]
具体地，mut-宿主细胞来源于酵母菌株，所述酵母选自由以下项组成的组：毕赤酵母属物种，诸如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母(pichia methanolica)、克鲁维毕赤酵母(pichia kluyveri)和安格斯毕赤酵母(pichia angusta)；驹形氏酵母属物种，诸如巴斯德驹形氏酵母、伪巴斯德驹形氏酵母(komagataella pseudopastoris)或法夫驹形氏酵母(komagataella phaffii)；汉逊酵母属物种，诸如多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)；绪方酵母属物种，诸如多形绪方酵母或副多形绪方酵母；和假丝酵母属物种，诸如产朊假丝酵母(candida utilis)、可可假丝酵母(candida cacaoi)和博伊丁假丝酵母(candida boidinii)。
[0183]
优选巴斯德毕赤酵母物种。具体地，宿主细胞是选自由以下项组成的组的巴斯德毕赤酵母菌株：cbs 704、cbs 2612、cbs 7435、cbs 9173-9189、dsmz 70877、x-33、gs115、km71、km71h和smd1168。
[0184]
来源：cbs 704(＝nrrl y-1603＝dsmz 70382)、cbs 2612(＝nrrl y-7556)、cbs 7435(＝nrrl y-11430)、cbs 9173-9189(cbs菌株：cbs-knaw真菌生物多样性中心(fungal biodiversity centre)，centraalbureau voor schimmelculturen，乌特勒支，荷兰)和dsmz 70877(德国微生物和细胞培养物保藏中心(german collection of microorganisms and cell cultures))；来自英杰公司(invitrogen)的菌株，诸如x-33、gs115、km71、km71h和smd1168。
[0185]
根据一个具体方面，本发明提供了生产目的蛋白(poi)的方法，其包括使用甲醇作为碳源培养本文所述的mut-宿主细胞以产生poi，特别是用作能量源而不(仅)用于ecp的甲醇诱发的这样的甲醇量。
[0186]
根据一个具体方面，所述方法包括使用甲醇作为碳源培养mut-宿主细胞以产生poi，所述mut-宿主细胞包含异源目的基因表达盒(goiec)，所述异源目的基因表达盒包含与编码目的蛋白(poi)的目的基因(goi)可操作地连接的表达盒启动子(ecp)，
[0187]
其中mut-宿主细胞通过一种或多种遗传修饰被工程化改造以与所述一种或多种遗传修饰之前的所述宿主细胞相比减少第一内源基因和第二内源基因的表达，其中
[0188]
a)所述第一内源基因编码包含鉴定为seq id no:1的氨基酸序列或其同源物的醇氧化酶1(aox1)，以及
[0189]
b)所述第二内源基因编码包含鉴定为seq id no:3的氨基酸序列或其同源物的醇氧化酶2(aox2)。
[0190]
具体地，mut-宿主细胞使用甲醇作为唯一碳源或在与其他碳源(或碳水化合物)的混合物中(特别是作为能量源，诸如用于生长和/或poi生产(合成))培养。
[0191]
具体地，此类其他碳源(本文中也称为“非甲醇碳源”)是碳水化合物。
[0192]
具体地，非甲醇碳源选自糖类、多元醇、醇、或任何一种或多种前述项的混合物。
[0193]
具体地，糖类可以是以下中的任何一种或多种：单糖(诸如己糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖)或二糖(诸如蔗糖)；或醇或多元醇，例如乙醇、或任何二元醇或三元醇，例如甘油，或任何前述项的混合物。除了用作如本文所述碳源的甲醇量之外，可以在细胞培养物中以产生所述poi的量另外使用任何此类非甲醇碳源。
[0194]
根据一个具体实施方案，培养mut-宿主细胞的细胞系。
[0195]
具体地，在分批培养条件、补料分批培养条件或连续培养条件下培养细胞系。可以
在微量滴定板、摇瓶或生物反应器中进行培养，并且任选地以分批阶段作为第一步骤开始，然后是补料分批阶段或连续培养阶段作为第二步骤。
[0196]
根据一个具体方面，本文所述的方法包括生长阶段和生产阶段。
[0197]
具体地，所述方法包括以下步骤：
[0198]
a)在生长条件下培养宿主细胞(生长阶段(growing phase)或“生长阶段(growth phase)”)；以及进一步的步骤
[0199]
b)在生长限制条件下在作为碳源的甲醇的存在下培养宿主细胞(生产阶段)，在此期间表达goi以产生所述poi。
[0200]
具体地，第二步骤b)在第一步骤a)之后。
[0201]
具体地，
[0202]
a)生长阶段，在所述生长阶段期间使用基础碳源作为能量源培养所述mut-宿主细胞；然后是
[0203]
b)生产阶段，在所述生产阶段期间使用甲醇进料培养所述mut-宿主细胞，从而产生poi。
[0204]
具体地，在第一步骤中在细胞培养基中在生长条件下培养宿主细胞，所述细胞培养基包含例如足以使宿主细胞能够在细胞培养物中生长的量的第一碳源，任选地直到所述量的碳源被消耗，并且可以在生长限制条件下进行进一步培养。
[0205]
具体地，第二碳源是甲醇和任选地一种或多种其他碳源(除甲醇外)，所述第二碳源被称为补充碳源。
[0206]
具体地，所述基础碳源和/或补充碳源(除甲醇之外)可以选自糖类、多元醇、醇、或前述中的任何一种或多种的混合物。
[0207]
根据一个具体实施方案，基础碳源不同于补充碳源，例如定量地和/或定性地不同。定量差异通常提供了阻遏或诱导ecp启动子活性的不同条件。
[0208]
根据又一个具体实施方案，基础碳源和补充碳源包含相同类型的分子或碳水化合物，优选是不同浓度的。根据又一个具体实施方案，碳源是两种或更多种不同碳源的混合物。
[0209]
可以使用任何类型的有机碳源，特别是通常用于宿主细胞培养、特别是真核宿主细胞培养的那些有机碳源。根据一个具体实施方案，碳源是己糖，诸如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖；二糖，诸如蔗糖；醇，诸如甘油或乙醇，或其混合物。
[0210]
根据一个特别优选的实施方案，基础碳源选自由以下项组成的组：葡萄糖、甘油、乙醇或其混合物。根据一个优选的实施方案，基础碳源是甘油。
[0211]
根据又一个具体实施方案，补充碳源包含(除甲醇之外)己糖，诸如葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖；二糖，诸如蔗糖；醇，诸如甘油或乙醇；或其混合物。根据一个优选的实施方案，补充碳源除甲醇之外还包含葡萄糖。
[0212]
所述两个培养步骤具体包括在所述碳源的存在下培养细胞系。
[0213]
具体地，所述生长阶段(步骤a))培养在分批阶段中进行；并且所述生产阶段(步骤b))培养在补料分批培养阶段或连续培养阶段中进行。
[0214]
具体地，在高生长速率阶段(在生长条件下)步骤a)(例如，至少50％或至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或高达最大生长速率)期间
在包含基础碳源的富碳源培养基中生长宿主细胞，并且在低生长速率阶段(在生长限制条件下)步骤b)(例如，最大生长速率的小于90％，优选小于80％、小于70％、小于60％、小于50％或小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％或小于0.2％)期间在限制碳源的同时生产poi，特别是通过进料限定的基本培养基，所述基本培养基仅包含在生产阶段维持细胞培养时完全消耗的碳源量。
[0215]
具体地，将至少0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％或1.0％(v/v)中的任一个例如至多3％、2.5％、2％、1.5％或1％(v/v)中的任一个的平均甲醇浓度用于宿主细胞培养物中，特别是用于细胞培养基或上清液中，特别是在生产阶段。
[0216]
具体地，在至少24小时的生产阶段期间将平均甲醇浓度优选维持在至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％或3％(v/v)中的任一个。
[0217]
根据一个具体实施方案，在至少24小时的生产阶段期间，平均甲醇浓度是0.5％-2％(v/v)。
[0218]
平均量或浓度可以计算为如至少在观察期开始和结束时以及在观察期内(例如，至少每24h)或按照连续测量在细胞培养物中、特别是在细胞培养基或上清液中测量的甲醇浓度的总和除以测量次数。
[0219]
细胞培养物中的甲醇浓度可以使用合适的标准测定如hplc来测量，例如确定为在被细胞培养物消耗后培养基中的残余浓度。
[0220]
具体地，在生产阶段期间，甲醇进料的平均进料速率为至少以下中的任一个：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg甲醇/(g干生物质*h)或更高，例如2-20或2-15mg甲醇/(g干生物质*h)。
[0221]
可以将甲醇以一个或多个分量添加到细胞培养物中，例如通过一次或多次注射，或者可以在产生poi时的某个时间段内连续添加。平均量可以计算为在观察期内所有甲醇添加的总和除以平均总干生物质并且除以观察期的持续时间。平均总干生物质通过至少在观察期的开始和结束时并且任选地在观察期内测量干生物质浓度来计算。然后在观察期的开始与结束之间内推干生物质浓度。内推的干生物质浓度乘以在每个间隔的反应器体积，将所有间隔的计算值相加并且除以间隔数。间隔持续时间小于或等于1h。
[0222]
具体地，在至少24小时的生产阶段期间将平均进料速率优选维持在至少以下中的任一个：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg甲醇/(g干生物质*h)或更高，例如2-20或2-15mg甲醇/(g干生物质*h)。
[0223]
观察期在本文中被理解为其中细胞培养物产生poi的某个时间段，并且特别地被理解为生产阶段，特别是补料分批或连续细胞培养方法的生产阶段。虽然实际poi生产过程或生产阶段可能比观察期更长，但平均量是在限定的观察期内计算的。
[0224]
具体地，poi生产过程的持续时间是10至500h。
[0225]
具体地，分批阶段进行大约10至36h。
[0226]
关于培养时间的术语“大约”应意指+/-5％或+/-10％。
[0227]
例如，大约10至36h的具体分批执行时间可以是18-39.6h，特别是19-37.8h。
[0228]
根据一个具体实施方案，使用10至50g/l的甘油、特别是20至40g/l的甘油作为分
批培养基中的基础碳源来进行分批阶段，并且培养在25℃下进行大约27至30h、或在30℃下进行大约23至36h、或在25℃与30℃之间的任何温度下在23至36h的培养时间内进行。降低分批培养基中的甘油浓度将减少分批阶段的长度，而增加分批培养基中的甘油将甚至延长分批阶段。作为甘油的替代物，可以使用葡萄糖，例如以大约相同的量。
[0229]
在其中分批阶段之后是补料分批阶段的典型细胞培养和poi表达系统中，具体地，补料分批阶段的培养进行持续以下中的任一个：大约15至100h、大约15至80h、大约15至70h、大约15至60h、大约15至50h、大约15至45h、大约15至40h、大约15至35h、大约15至30h、大约15至35h、大约15至25h、或大约15至20h；优选大约20至40h。具体地，补料分批阶段的培养进行持续以下中的任一个：大约100h、大约80h、大约70h、大约60h、大约55h、大约50h、大约45h、大约40h、大约35h、大约33h、大约30h、大约25h、大约20h、或大约15h。
[0230]
具体地，体积比产物形成速率(rp)是每单位体积(l)和单位时间(h)形成的产物量(mg)(mg(l h)-1
)。体积比产物形成速率也称为时空产率(sty)或体积生产率。
[0231]
具体地，进行本文所述方法的补料分批培养，使得时空产率为大约30mg(l h)-1
(意指30mg(l h)-1
+/-5％或+/-10％)。具体地，在大约30h的补料分批内实现大约30mg(l h)-1
的时空产率，具体地，可以在小于33h、32h、31h、30h、29h、28h、27h、26h或25h中的任一个的补料分批时间内实现至少以下中的任一个：27、28、29、30、31、32或33mg(l h)-1
。
[0232]
具体地，在生产阶段中在生长限制条件下表达poi，例如通过以小于最大生长速率，通常细胞最大生长速率的小于90％，优选小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％或小于0.2％的生长速率培养细胞系。通常，最大生长速率是针对每种类型的宿主细胞单独确定的。
[0233]
根据一个具体方面，在生产阶段期间在将宿主细胞生长限制为小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(w/w生物质)中的任一个的条件下培养mut-宿主细胞。
[0234]
具体地，生产阶段采用进料培养基，所述进料培养基提供生长限制量的补充碳源以将比生长速率保持在0.0001h-1
至0.2h-1
、优选0.005h-1
至0.15h-1
的范围内。
[0235]
根据一个具体方面，本发明提供了重组甲醇利用途径缺陷型甲醇营养型酵母(mut-)宿主细胞在生产发酵产物的方法中的用途，所述方法包括在允许所述mut-宿主细胞使用甲醇作为醇脱氢酶(adh2)的底物以及产生所述发酵产物的条件下培养所述mut-宿主细胞。
[0236]
具体地，所述mut-宿主细胞缺乏醇氧化酶1(aox1)和醇氧化酶2(aox2)。
[0237]
具体地，在所述mut-宿主细胞中，敲除或缺失编码醇氧化酶1(aox1)和醇氧化酶2(aox2)的基因。
[0238]
根据一个具体方面，本发明提供了重组甲醇利用途径缺陷型甲醇营养型酵母(mut-)宿主细胞在生产发酵产物的方法中的用途，所述方法包括在允许所述mut-宿主细胞使用甲醇作为碳源产生所述发酵产物的条件下培养所述mut-宿主细胞，所述mut-宿主细胞通过一种或多种遗传修饰被工程化改造
[0239]
a)以与在所述一种或多种遗传修饰之前的所述宿主细胞相比减少第一内源基因和第二内源基因的表达，其中
[0240]
i.所述第一内源基因编码包含鉴定为seq id no:1的氨基酸序列或其同源物的醇氧化酶1(aox1)，以及
[0241]
ii.所述第二内源基因编码包含鉴定为seq id no:3的氨基酸序列或其同源物的醇氧化酶2(aox2)，以及
[0242]
b)以增加醇脱氢酶(adh2)基因的表达，其中所述adh2基因编码醇脱氢酶(adh2)。
[0243]
根据一个具体方面，本发明提供了用于在宿主细胞中生产目的蛋白(poi)的方法，其包括以下步骤：
[0244]
a)将宿主细胞进行遗传工程化改造以减少分别编码aox1和aox2的所述第一基因和第二基因的表达(欠表达)；
[0245]
b)将宿主细胞进行遗传工程化改造以增加编码adh2的基因的表达(过表达)；
[0246]
c)将异源表达盒引入宿主细胞中，所述异源表达盒包含在表达盒启动子(ecp)的控制下编码所述poi的目的基因(goi)；
[0247]
d)使用甲醇作为碳源在产生所述poi的条件下培养所述宿主细胞，从而特别地为生长和/或poi生产提供能量；
[0248]
e)任选地从细胞培养物中分离出所述poi；以及
[0249]
f)任选地纯化所述poi。
[0250]
具体地，本文所述方法的步骤a)在步骤b)之前、之后或同时进行。
[0251]
具体地，本文所述方法的步骤a)和b)在步骤c)之前、之后或同时进行。
[0252]
根据一个具体方面，宿主细胞首先经遗传修饰以减少分别编码aox1和aox2的所述第一基因和第二基因的表达，并且增加编码adh2的基因的表达，然后经工程化改造以产生poi。根据一个具体实例，根据本文所述方法的步骤a)和b)对野生型宿主细胞进行遗传修饰。具体地，在将所述一种或多种遗传修饰引入野生型宿主细胞株中以减少分别编码aox1和aox2的所述第一基因和第二基因并且增加编码adh2的基因的表达后提供宿主细胞。
[0253]
根据又一个方面，宿主细胞首先经工程化改造以产生异源或重组poi，然后经进一步遗传修饰以减少分别编码aox1和aox2的所述第一基因和第二基因并且增加编码adh2的基因的表达。根据一个具体实例，野生型宿主细胞可以首先经工程化改造以包含用于poi生产的表达盒。然后此类经工程化改造的宿主细胞可以经进一步修饰以减少分别编码aox1和aox2的所述第一基因和第二基因并且增加编码adh2的基因的表达。
[0254]
根据又一个方面，宿主细胞正在经受工程化改造步骤，包括针对poi生产进行工程化改造，以及同时(即，在一个方法步骤中)进行遗传修饰以减少分别编码aox1和aox2的所述第一基因和第二基因并且增加编码adh2的基因的表达，例如在一种或多种反应混合物中采用相应的表达盒、试剂和工具。
[0255]
具体地，所述方法采用生产如本文进一步所述的重组mut-宿主细胞的方法步骤。
[0256]
具体地，异源表达盒包含如本文进一步所述的ecp。
[0257]
具体地，可以通过以下方式产生poi：在适当的培养基中培养mut-宿主细胞，在培养步骤期间使用包含甲醇的细胞培养生产培养基产生poi，以及从细胞培养物、特别是在分离细胞后从细胞培养物上清液或培养基中分离出表达的poi，以及任选地通过适于表达的产物的方法将其纯化。因此，可以产生纯化poi制剂。
[0258]
令人惊讶地发现，mut-宿主细胞对甲醇不敏感，并且可以有效地摄取和使用如为
poi生产提供能量所需的显著量的甲醇。这是令人惊讶的，因为在现有技术中，发现甲醇对muts菌株有毒。
[0259]
根据如本文所述细胞培养物的具体实例，mut-宿主细胞的生长在生产阶段期间有利地受到限制，这减少了氧气供应和冷却的必要性。
[0260]
甚至更令人惊讶的是，poi生产的产率通过甲醇营养型酵母中迄今为止被低估的醇脱氢酶机制和adh2活性而增加，结果导致甲醇摄取和有效甲醇消耗，尽管在甲醇利用途径缺陷型甲醇营养型酵母中敲除了aox1和aox2基因。
[0261]
根据一个具体实施例，甲醇诱导型ecp已有利地用在goiec中。如在细胞培养物中用作碳源的甲醇量足以诱导goi的表达。
附图说明
[0262]
图1：本文提及的序列。
具体实施方式
[0263]
如在整个说明书中使用的具体术语具有以下含义。
[0264]
如本文所用的术语“碳源”应意指适合作为微生物的能量源的可发酵碳底物，通常是碳水化合物源，诸如能够被宿主生物体或生产细胞系代谢的那些，特别是选自由以下项组成的组的源：单糖、寡糖、多糖、包括甘油在内的醇，其呈纯化形式、在基本培养基中或提供在原料中，诸如复合营养材料。碳源可以如本文所述作为单一碳源或作为不同碳源的混合物使用。
[0265]
如本文所述，甲醇用作碳源，例如，在生产阶段用作唯一碳源，或在与非甲醇碳源的混合物中。具体地，将甲醇与任何非甲醇碳源共同进料到细胞培养物中。
[0266]
非甲醇碳源在本文中被理解为除甲醇以外的任何碳源，特别是不含甲醇的碳源。
[0267]
诸如本文所述的“基础碳源”通常是适合细胞生长的碳源，诸如用于宿主细胞、特别是用于真核细胞的营养物。基础碳源可以提供在培养基诸如基础培养基或复合培养基中，而且还可以提供在含有纯化碳源的化学成分确定的培养基中。基础碳源的提供量通常提供用于细胞生长，特别是在培养过程的生长阶段期间，例如以获得至少5g/l细胞干质量、优选至少10g/l细胞干质量或至少15g/l细胞干质量的细胞密度，例如在标准继代培养步骤期间展现出大于90％、优选大于95％的活力。
[0268]
基础碳源通常以过量或过剩量使用，所述过量或过剩量被理解为提供能量增加生物质的过量，例如在以高比生长速率培养细胞系期间，诸如在分批或补料分批培养过程中细胞系的生长阶段期间。此过剩量特别地超过补充碳源的限制量(如在生长限制条件下使用的)以达到在发酵肉汤中可测量的并且通常是在进料限制量的补充碳源期间的至少10倍、优选至少50倍或至少100倍的残余浓度。
[0269]
如本文所述的“补充碳源”通常是促进生产细胞系生产发酵产物的补充底物，特别是在培养过程的生产阶段。生产阶段具体地在生长阶段之后，例如在分批、补料分批和连续培养过程中。补充碳源具体地可以包含在补料分批过程的进料中。通常在碳底物限制条件下(即，使用限制量的碳源)的细胞培养物中采用补充碳源。
[0270]
具体地，在本文所述的方法中，甲醇用作补充碳源。
[0271]“限制量”的碳源或“限制的碳源”在本文中被理解为具体是指促进生产细胞系产生发酵产物的碳底物的类型和量，特别是在具有小于最大生长速率的受控生长速率的培养过程中。生产阶段具体地在生长阶段之后，例如在分批、补料分批和连续培养过程中。细胞培养过程可以采用分批培养、连续培养和补料分批培养。分批培养是这样的培养过程，其中将少量的种子培养溶液添加到培养基中，并且在培养期间不添加另外的培养基或排出培养溶液的情况下生长细胞。
[0272]
连续培养是这样的培养过程，其中在培养期间连续添加和排出培养基。连续培养还包括灌注培养。补料分批培养是分批培养与连续培养之间的中间方式并且也称为半分批培养，是这样的培养过程，其中在培养期间连续或顺序地添加培养基，但与连续培养不同，不连续排出培养溶液。
[0273]
特别优选的是基于将生长限制性营养底物进料到培养物中的补料分批过程。补料分批策略，包括单一补料分批或重复补料分批发酵，通常用于生物工业过程以在生物反应器中达到高细胞密度。碳底物的受控添加直接影响培养物的生长速率并且有助于避免溢出代谢或不需要的代谢副产物的形成。在碳源限制条件下，碳源具体地可以包含在补料分批过程的进料中。因此，以限制量提供碳底物。
[0274]
同样在如本文所述的恒化器或连续培养中，可以严格控制生长速率。
[0275]
限制量的碳源在本文中特别理解为将生产细胞系保持在生长限制条件下(例如，在生产阶段或生产模式中)所需的碳源量。这样的限制量可以用于补料分批过程，其中碳源包含在进料培养基中并且以低进料速率供应于培养物用于持续的能量递送，例如以产生poi，同时将生物质保持在低的比生长速率。通常在细胞培养物的生产阶段将进料培养基添加到发酵肉汤中。
[0276]
碳源的限制量可以例如由细胞培养肉汤中碳源的残余量来确定，所述残余量低于预定阈值或甚至低于如在标准(碳水化合物)测定中测量的检测限。通常将在收获发酵产物后在发酵肉汤中确定残余量。
[0277]
碳源的限制量也可以通过限定碳源向发酵罐中的平均进料速率来确定，例如，所述平均进料速率如通过在整个培养过程(例如，补料分批阶段)中添加的量/培养时间以确定计算平均量/时间来确定。将此平均进料速率保持为低以确保细胞培养物完全使用补充碳源，例如在0.6g l-1
h-1
(g碳源/l初始发酵体积和h时间)与25g l-1
h-1
之间，优选在1.6g l-1
h-1
与20g l-1
h-1
之间。
[0278]
碳源的限制量也可以通过在生产阶段期间(例如，在预定范围内)测量比生长速率(所述比生长速率保持为低，例如低于最大比生长速率)来确定，诸如在0.001h-1
至0.20h-1
或0.005h-1
至0.20h-1
、优选在0.01h-1
与0.15h-1
之间的范围内。
[0279]
具体地，使用化学成分确定的并且包含甲醇的进料培养基。
[0280]
与细胞培养基诸如补料分批过程中的基本培养基或进料培养基有关的术语“化学成分确定的”应意指适用于生产细胞系的体外细胞培养的培养基，其中所有化学组分和(多)肽是已知的。通常，化学成分确定的培养基完全不含动物源性组分并且代表纯且一致的细胞培养环境。
[0281]
如本文所用的术语“细胞”或“宿主细胞”应指宿主细胞的单一细胞、单一细胞克隆或细胞系。术语“宿主细胞”应特别适用于甲醇营养型酵母细胞，其适合用于重组目的以产
生poi或宿主细胞代谢物。充分理解的是，术语“宿主细胞”不包括人类。具体地，如本文所述的宿主细胞是天然(野生型)宿主细胞的人工生物体和衍生物。充分理解的是，本文所述的宿主细胞、方法和用途(例如，具体是指包括一种或多种遗传修饰、所述异源表达盒或构建体、所述转染或转化的宿主细胞和重组蛋白的那些)是非天然存在的、“人造的”或合成的，并且因此不被视为“自然法则”的结果。
[0282]
如本文所用的术语“细胞系”是指特定细胞类型的已建立克隆，其已获得在延长的时间段内增殖的能力。细胞系通常用于表达内源或重组基因，或代谢途径的产物以产生多肽或由此类多肽介导的细胞代谢物。
[0283]
产生如本文所述poi的宿主细胞也称为“生产宿主细胞”，并且相应的细胞系称为“生产细胞系”。“生产细胞系”通常被理解为准备用于在生物反应器中的细胞培养以获得生产过程的产物诸如poi的细胞系。
[0284]
本文所述的具体实施方案涉及mut-生产宿主细胞，其可以有效地使用adh2来酶促加工甲醇从而为细胞提供能量。
[0285]
本文所述的具体实施方案涉及生产细胞系，其经工程化改造以欠表达编码aox1和aox2蛋白的内源基因并且过表达编码adh2的基因，并且其特征在于在本文所述ecp的控制下使用甲醇作为碳源的poi生产产率高。
[0286]
如本文关于宿主细胞所用的术语“细胞培养”或“培养(culturing)”或“培养(cultivation)”是指根据行业中已知的方法具体地在受控生物反应器中在有利于细胞的生长、分化或持续活力(处于活动或静止状态)的条件下将细胞维持在人工(例如，体外)环境中。
[0287]
当使用适当的培养基培养细胞培养物时，在适合支持在细胞培养物中培养细胞的条件下使细胞与培养容器中的培养基或与底物接触。如本文所述，提供了可以用于宿主细胞(例如，甲醇营养型酵母)生长的培养基。标准细胞培养技术是本领域众所周知的。
[0288]
如本文所述的细胞培养物特别采用这样的技术，其提供分泌poi的生产，诸如以在细胞培养基中获得poi，所述poi可与本文中称为“细胞培养物上清液”的细胞生物质分离并且可以纯化以获得更高纯度的poi。当细胞培养物中的宿主细胞产生和分泌蛋白质(诸如例如poi)时，在本文中应理解，此类蛋白质被分泌到细胞培养物上清液中，并且可以通过以下方式获得：将细胞培养物上清液与宿主细胞生物质分离，并且任选地进一步纯化蛋白质以产生纯化的蛋白质制剂。
[0289]
细胞培养基提供在受控、人工和体外环境中维持和生长细胞所需的营养物。细胞培养基的特征和组成根据特定细胞要求而变化。重要参数包括渗透压摩尔浓度、ph和营养配方。营养物的进料可以根据本领域已知的方法以连续或不连续模式进行。
[0290]
而分批过程是这样的细胞培养模式，其中培养细胞所需的所有营养物都包含在初始培养基中，而在发酵期间不另外供应其他营养物，在补料分批过程中，在分批阶段之后进行进料阶段，其中通过进料向培养物中供应一种或多种营养物。尽管在大多数过程中，进料模式是关键且重要的，但本文所述的宿主细胞和方法不限于某种细胞培养模式。
[0291]
可以使用本文所述的宿主细胞和相应的细胞系通过以下方式产生重组poi：在适当的培养基中培养，从培养物中分离出表达的产物或代谢物，并且任选地通过合适的方法将其纯化。
[0292]
用于生产如本文所述poi的若干种不同方法是优选的。可以通过以下方式表达、加工和任选地分泌poi：用含有编码相关蛋白质的重组dna的表达载体转染或转化宿主细胞，制备转染或转化细胞的培养物，生长培养物，诱导转录和poi生产，以及回收poi。
[0293]
在某些实施方案中，细胞培养过程是补料分批过程。具体地，在生长阶段中培养用编码所希望的重组poi的核酸构建体转化的宿主细胞并且过渡到生产阶段以便产生所希望的重组poi。
[0294]
在另一个实施方案中，本文所述的宿主细胞以连续模式培养，例如采用恒化器。连续发酵过程的特征在于将新鲜培养基以限定的、恒定的和连续的速率进料到生物反应器中，由此以相同的限定的、恒定的和连续的去除速率同时从生物反应器中去除培养肉汤。通过将培养基、进料速率和去除速率保持在相同的恒定水平使生物反应器中的细胞培养参数和条件保持恒定。
[0295]
如本文所述的稳定细胞培养物具体理解为是指即使在培养约20代、优选至少30代、更优选至少40代、最优选至少50代后也维持遗传特性，特别是保持高(例如，在μg水平)poi生产水平的细胞培养物。具体地，提供了稳定的重组宿主细胞系，当用于工业规模生产时，这被认为是大的优势。
[0296]
本文所述的细胞培养特别有利于工业制造规模的方法，例如在体积和技术系统两者与基于营养物的进料的培养模式、特别是补料分批或分批过程或者连续或半连续过程(例如，恒化器)的组合的方面。
[0297]
通常针对本文所述的宿主细胞测试其表达用于poi生产的goi的能力，通过以下任何测试来测试poi产率：elisa、活性测定、hplc、或其他合适的测试，诸如sds-page和蛋白质印迹技术或质谱法。
[0298]
为了与在相应细胞中没有此类一种或多种遗传修饰的菌株相比确定一种或多种遗传修饰对在相应细胞培养物中编码aox1和/或aox2蛋白的基因的欠表达或表达降低的作用以及例如其对poi产生的作用，可以在微量滴定板、摇瓶或生物反应器中使用补料分批或恒化器发酵培养宿主细胞系。
[0299]
本文所述的生产方法特别允许中试或工业规模的发酵。工业过程规模将优选采用至少10l，特别是至少50l、优选至少1m3、优选至少10m3、最优选至少100m3的体积。
[0300]
工业规模的生产条件是优选的，其是指例如，反应器体积为100l至10m3或更大的采用若干天的典型过程时间的补料分批培养，或发酵罐体积为大约50-1000l或更大的稀释速率大约0.02-0.15h-1
的连续过程。
[0301]
用于本文所述目的的装置、设施和方法特别适用于在任何所希望的细胞系(包括原核和/或真核细胞系)的培养中使用和与其一起使用。此外，在实施方案中，装置、设施和方法适用于培养任何细胞类型，包括悬浮细胞或贴壁依赖性(贴壁)细胞，并且适用于配置用于生产制药和生物制药产物(诸如多肽产物(poi)、核酸产物(例如，dna或rna)、或细胞和/或病毒，诸如用于细胞和/或病毒疗法的那些)的生产操作。
[0302]
在某些实施方案中，细胞表达或产生产物，诸如重组治疗或诊断产物。如本文更详细所述，由细胞产生的产物的实例包括但不限于poi，诸如本文例示的poi，包括抗体分子(例如，单克隆抗体、双特异性抗体)、抗体模拟物(与抗原特异性结合但与在结构上抗体不相关的多肽分子，诸如例如darpin、亲和体、adnectin或ignar)、融合蛋白(例如，fc融合蛋
白、嵌合细胞因子)、其他重组蛋白(例如，糖基化蛋白、酶、激素)、或病毒疗法(例如，抗癌溶瘤病毒、用于基因疗法的病毒载体和病毒免疫疗法)、细胞治疗药(例如，多能干细胞、间充质干细胞和成体干细胞)、疫苗或脂质包裹的颗粒(例如，外泌体、病毒样颗粒)、rna(诸如例如，sirna)或dna(诸如例如，质粒dna)、抗生素或氨基酸。在实施方案中，装置、设施和方法可以用于生产生物类似物。
[0303]
如所述，在某些实施方案中，装置、设施和方法允许真核细胞诸如例如酵母细胞的生产，例如由所述细胞以大规模方式合成的poi，包括蛋白质、肽或抗生素、氨基酸、核酸(诸如dna或rna)。除非本文另有说明，否则装置、设施和方法可以包括任何所希望的体积或生产能力，包括但不限于实验室规模、中试规模和全生产规模能力。
[0304]
此外并且除非本文另有说明，否则装置、设施和方法可以包括任何一种或多种合适的反应器，包括但不限于搅拌罐、空气提升式、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷动床生物反应器。如本文所用，“反应器”可以包括发酵罐或发酵单元或任何其他反应容器，并且术语“反应器”可以与“发酵罐”互换使用。例如，在一些方面，示例性生物反应器单元可以执行以下中的一项或多项或全部：营养物和/或碳源的进料、合适气体(例如，氧气)的注入、发酵或细胞培养基的入口和出口流、气相和液相的分离、温度的维持、氧气和co2水平的维持、ph水平的维持、搅动(例如，搅拌)和/或清洁/灭菌。示例性反应器单元，诸如发酵单元，可以在单元内包含多个反应器，例如，单元可以在每个单元中具有1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100或更多个生物反应器和/或设施可以在设施中含有具有单个或多个反应器的多个单元。在各种实施方案中，生物反应器可以适用于分批、半补料分批、补料分批、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施方案中，生物反应器可以具有在约100ml与约50,000l之间的体积。非限制性实例包括100ml、250ml、500ml、750ml、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升的体积。另外，合适的反应器可以是多次使用的、单次使用的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，所述材料包括金属合金，诸如不锈钢(例如，316l或任何其他合适的不锈钢)和铬镍铁合金(inconel)、塑料和/或玻璃。
[0305]
在实施方案中并且除非本文另有说明，否则本文所述的装置、设施和方法还可以包括未另外提及的任何合适的单元操作和/或设备，诸如用于分离、纯化和分离出此类产物的操作和/或设备。可以使用任何合适的设施和环境，诸如传统的构件式(stick-built)设施、模块化、移动和临时设施，或任何其他合适的建造物、设施和/或布局。例如，在一些实施方案中，可以使用模块化洁净室。此外并且除非另有说明，否则本文所述的装置、系统和方法可以被安置在单个位置或设施中和/或在单个位置或设施中执行，或者可替代地被安置在单独的或多个位置和/或设施处和/或在单独的或多个位置和/或设施处执行。
[0306]
合适的技术可以包括在生物反应器中培养，从分批阶段开始，然后是高比生长速率的短指数补料分批阶段，再然后是低比生长速率的补料分批阶段。另一种合适的培养技术可以包括分批阶段，然后是任何合适的比生长速率或比生长速率组合(诸如在poi生产时
间内从高到低的生长速率或在poi生产时间内从低到高的生长速率)的补料分批阶段。另一种合适的培养技术可以包括分批阶段，然后是低稀释速率的连续培养阶段。
[0307]
优选的实施方案包括分批培养以提供生物质，然后是补料分批培养以进行高产率poi生产。
[0308]
优选在生长条件下在生物反应器中培养如本文所述的宿主细胞以获得至少1g/l细胞干重，更优选至少10g/l细胞干重，优选至少20g/l细胞干重，优选至少30、40、50、60、70或80g/l细胞干重中的任一个的细胞密度。以中试或工业规模提供此类生物质生产的产率是有利的。
[0309]
允许生物质积累的生长培养基，特别是基础生长培养基，通常包含碳源、氮源、硫源和磷酸盐源。通常，此类培养基另外包含微量元素和维生素，并且可以进一步包含氨基酸、蛋白胨或酵母提取物。
[0310]
优选的氮源包括nh4h2po4或nh3或(nh4)2so4；
[0311]
优选的硫源包括mgso4或(nh4)2so4或k2so4；
[0312]
优选的磷酸盐源包括nh4h2po4、或h3po4、或nah2po4、kh2po4、na2hpo4或k2hpo4；
[0313]
其他典型的培养基组分包括kcl、cacl2、和微量元素，诸如：fe、co、cu、ni、zn、mo、mn、i、b；
[0314]
优选地，培养基补充有维生素b7；
[0315]
用于巴斯德毕赤酵母的典型生长培养基包含甘油、山梨糖醇或葡萄糖、nh4h2po4、mgso4、kcl、cacl2、生物素和微量元素。
[0316]
在生产阶段，具体地使用具有仅限制量的补充碳源的生产培养基。
[0317]
优选地，在具有合适碳源的矿物培养基中培养宿主细胞系，从而进一步显著简化分离过程。优选矿物培养基的实例是含有可利用碳源(特别是如本文所述的甲醇，任选地与例如葡萄糖、甘油或山梨糖醇组合)、含有常量元素(钾、镁、钙、铵、氯化物、硫酸盐、磷酸盐)和微量元素(铜、碘化物、锰、钼酸盐、钴、锌和铁盐以及硼酸)的盐、以及任选地维生素或氨基酸(例如，以补足营养缺陷)的矿物培养基。
[0318]
具体地，在适合进行所希望的poi的表达的条件下培养细胞，所述poi可以从细胞或培养基中纯化，取决于表达系统和表达的蛋白质的性质，例如蛋白质是否与信号肽融合以及蛋白质是可溶的还是膜结合的。如本领域技术人员将理解，培养条件将根据包括宿主细胞类型和所采用的特定表达载体在内的因素而变化。
[0319]
典型的生产培养基包含补充碳源，以及另外的nh4h2po4、mgso4、kcl、cacl2、生物素和微量元素。
[0320]
例如，添加到发酵中的补充碳源的进料可以包含具有最高达50wt％可利用糖的碳源。
[0321]
发酵优选在从3至8范围内的ph下进行。
[0322]
典型的发酵时间是约24至120小时，其中温度范围为20℃至35℃、优选22℃-30℃。
[0323]
优选采用产生至少1mg/l、优选至少10mg/l、优选至少100mg/l、最优选至少1g/l的滴度的条件来表达poi。
[0324]
如本文所用的术语“表达”或“表达盒”是指含有可操作连接的所希望的编码序列和控制序列的核酸分子，使得用这些序列转化或转染的宿主能够产生编码的蛋白质或宿主
细胞代谢物。为了实现转化，可以将表达系统包含在载体中；然而，相关dna也可以整合到宿主细胞染色体中。表达可以指分泌的或非分泌的表达产物，包括多肽或代谢物。
[0325]
表达盒方便地作为表达构建体提供，例如呈“载体”或“质粒”的形式，所述表达构建体通常是在合适的宿主生物体中克隆重组核苷酸序列(即，重组基因)的转录以及其mrna的翻译所需的dna序列。表达载体或质粒通常包含自主复制起点或用于基因组整合在宿主细胞中的基因座、选择标记(例如，氨基酸合成基因或赋予对诸如博莱霉素、卡那霉素、g418或潮霉素、诺尔丝菌素的抗生素的抗性的基因)、许多限制性酶切位点、合适的启动子序列和转录终止子，所述组分可操作地连接在一起。如本文所用的术语“质粒”和“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合的核苷酸序列，诸如人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)。
[0326]
表达载体可以包括但不限于克隆载体、经修饰的克隆载体和特别设计的质粒。本文所述的优选表达载体是适合在真核宿主细胞中表达重组基因的表达载体，并且根据宿主生物体进行选择。适当的表达载体通常包含适合在真核宿主细胞中表达编码poi的dna的调控序列。调控序列的实例包括启动子、操纵子、增强子、核糖体结合位点、以及控制转录和翻译起始和终止的序列。调控序列通常与待表达的dna序列可操作地连接。
[0327]
本文所述的特定表达构建体包含启动子，所述启动子与在所述启动子的转录控制下编码poi的核苷酸序列可操作地连接。具体地，启动子与poi的编码序列不是天然相关的。
[0328]
为了允许在宿主细胞中表达重组核苷酸序列，本文描述为goiec的表达盒或载体包含ecp，通常是启动子核苷酸序列，其与编码序列的5’端相邻，例如在目的基因(goi)上游并且与其相邻或如果使用信号或前导序列的话则分别在所述信号和前导序列的上游并且与其相邻，以促进poi的表达和分泌。启动子序列通常调节和启动与其可操作地连接的下游核苷酸序列(特别包括goi)的转录。
[0329]
本文所述的特定表达构建体包含编码与前导序列连接的poi的多核苷酸，所述前导序列引起poi从宿主细胞中的分泌。当旨在重组表达和分泌的poi是非天然分泌的蛋白质并且因此缺乏天然分泌前导序列或者在没有其天然分泌前导序列的情况下其核苷酸序列已被克隆时，通常需要在表达载体中存在这样的分泌前导序列。通常，可以使用有效引起poi从宿主细胞分泌的任何分泌前导序列。分泌前导序列可以来源于酵母源，例如来源于酵母α-因子(诸如酿酒酵母的mfa)或酵母磷酸酶；来源于哺乳动物或植物源；或其他。
[0330]
在具体的实施方案中，可以使用多克隆载体，所述载体是具有多克隆位点的载体。具体地，可以在多克隆位点整合或掺入所希望的异源基因以制备表达载体。在多克隆载体的情况下，启动子通常置于多克隆位点的上游。
[0331]
如本文所用的术语“基因表达”或“表达多核苷酸”意在包括选自由以下项组成的组的至少一个步骤：dna转录成mrna、mrna加工、mrna成熟、mrna输出、翻译、蛋白质折叠和/或蛋白质转运。
[0332]
在本文中也称为“过表达”的术语“增加表达”是指高于由参考标准展现出的表达水平的任何量，参考标准可以是在增加某个多核苷酸的表达的遗传改变之前的宿主细胞，或者所述表达水平是以其他方式在未经工程化改造以增加所述多核苷酸的表达的相同类型或物种的宿主细胞中表达的。
[0333]
如果宿主细胞不包含给定的基因产物，则有可能将基因产物引入宿主细胞进行表
达；在这种情况下，任何可检测的表达都被术语“过表达”所包括。
[0334]
编码蛋白质(例如，adh2)的基因的过表达也称为蛋白质(例如，adh2)的过表达。可以以本领域技术人员已知的任何方式实现过表达。通常，它可以通过增加基因的转录/翻译来实现，例如通过增加基因的拷贝数或改变或修饰与基因表达相关的调控序列或位点来实现。例如，可以将基因与强启动子可操作地连接以便达到高表达水平。此类启动子可以是内源启动子或异源启动子，特别是重组启动子。人员可以用增加基因表达的异源启动子取代启动子。使用诱导型启动子另外使得有可能在培养过程中增加表达。此外，过表达也可以通过以下方式实现：例如，修饰特定基因的染色体位置，改变与特定基因相邻的核酸序列(诸如核糖体结合位点或转录终止子)，在开放阅读框中引入移码，修饰参与基因转录和/或基因产物翻译的蛋白质(例如，调控蛋白、抑制子、增强子、转录激活子等等)，或本领域中惯用的使特定基因表达失调的任何其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，例如以阻断阻遏蛋白的表达或使转录因子的基因缺失或突变，所述转录因子通常阻遏希望过表达的基因的表达。延长mrna的寿命也可以提高表达水平。例如，某些终止子区可以用于延长mrna的半衰期。如果包含多个基因拷贝，则所述基因可以位于可变拷贝数的质粒中或整合在染色体中并且扩增。有可能将一个或多个基因或基因组序列引入宿主细胞中进行表达。
[0335]
根据一个具体实施方案，编码adh2蛋白的多核苷酸可以以单个拷贝或多个拷贝/个细胞存在。拷贝可以彼此相邻或远离。根据另一个具体实施方案，adh2蛋白的过表达采用编码adh2蛋白的重组核苷酸序列，其以单个拷贝或多个拷贝/个细胞提供在适合整合到宿主细胞的基因组中(即，敲入)的一个或多个质粒上。拷贝可以彼此相邻或远离。过表达可以通过表达多核苷酸的多个拷贝诸如所述多核苷酸的2、3、4、5、6或更多个拷贝/个宿主细胞来实现。
[0336]
包含goi和编码adh2蛋白的多核苷酸(基因)的重组核苷酸序列可以提供在一个或多个自主复制的质粒上，并且引入单个拷贝或多个拷贝/个细胞中。
[0337]
可替代地，包含goi和编码adh2蛋白的多核苷酸(基因)的重组核苷酸序列可以存在于同一质粒上，并且以单个拷贝或多个拷贝/个细胞引入。
[0338]
编码adh2蛋白的异源多核苷酸(基因)或包含编码adh2蛋白的多核苷酸(基因)的异源重组表达构建体优选整合到宿主细胞的基因组中。
[0339]
术语“基因组”通常是指在dna(或rna)中编码的生物体的全部遗传信息。它可能存在于染色体中、质粒或载体上、或两者都有。优选地，编码adh2蛋白的多核苷酸(基因)被整合到所述细胞的染色体中。
[0340]
编码adh2蛋白的多核苷酸(基因)可以整合到其天然基因座中。“天然基因座”意指特定染色体上的位置，其中编码adh2蛋白的多核苷酸(基因)位于天然存在的野生型细胞中。然而，在另一个实施方案中，编码adh2蛋白的多核苷酸(基因)存在于宿主细胞的基因组中不在其天然基因座处，而是异位整合的。术语“异位整合”意指将核酸插入微生物基因组中的除其通常染色体基因座以外的位点处，即预定或随机整合。在另一个实施方案中，编码adh2蛋白的多核苷酸(基因)整合到天然基因座中并且是异位的。异源重组可以用于实现随机或非靶向整合。异源重组是指序列显著不同的dna分子之间的重组。
[0341]
对于酵母细胞，编码adh2蛋白的多核苷酸(基因)和/或goi可以插入所希望的基因座，诸如aox1、gap、eno1、tef、his4(zamir等人,proc.natl acad.sci.usa(1981)78(6):
3496-3500)、ho(voth等人nucleic acids res.2001年6月15日；29(12):e59)、tyr1(mirisola等人,yeast 2007；24:761-766)、his3、leu2、ura3(taxis等人,biotechniques(2006)40:73-78)、lys2、ade2、trp1、gal1、adh1或在5s核糖体rna基因的整合上。
[0342]
在其他实施方案中，编码adh2蛋白的多核苷酸(基因)和/或goi可以整合到质粒或载体中。优选地，质粒是真核表达载体，优选酵母表达载体。合适的质粒或载体进一步描述在本文中。
[0343]
内源或异源多核苷酸在重组宿主细胞中的过表达可以通过修饰表达控制序列来实现。表达控制序列是本领域已知的，并且包括例如，启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(ires)等，其提供了多核苷酸序列在宿主细胞中的表达。表达控制序列与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用。示例性表达控制序列描述在例如goeddel,gene expression technology:methods in enzymology,第185卷,学术出版社,圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)中。
[0344]
在优选的实施方案中，过表达是通过使用增强子表达多核苷酸来实现的。转录增强子不依赖相对方向和位置，已发现在转录单元的5’和3’、在内含子内以及在编码序列本身内。增强子可以在编码序列的5’或3’位置处剪接到表达载体中，但优选位于启动子的5’位点。大多数酵母基因只含有一个uas，其通常位于帽位点的几百个碱基对内，并且大多数酵母增强子(uas)在位于启动子的3’时无法起作用，但高等真核生物的增强子可以在启动子的5’和3’两者起作用。
[0345]
许多增强子序列已知来自哺乳动物基因(珠蛋白、rsv、sv40、emc、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。人员还可以使用来自真核细胞病毒的增强子，诸如sv40晚期增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点的后边的多瘤增强子、和腺病毒增强子。
[0346]
具体地，如本文所述的goi和/或adh2编码多核苷酸(基因)与提供用于在宿主细胞中表达的转录和翻译调控序列可操作地连接。如本文所用的术语“翻译调控序列”是指与基因核酸序列相关并且调控基因的翻译的核苷酸序列。转录和/或翻译调控序列可以位于质粒或载体中或整合到宿主细胞的染色体中。转录和/或翻译调控序列位于与其所调控的基因的相同核酸分子中。
[0347]
具体地，adh2蛋白的过表达可以通过本领域已知的方法来实现，例如通过遗传修饰它们的内源调控区，如marx等人,2008(marx,h.,mattanovich,d.和sauer,m.microb cell fact 7(2008):23)所述，此类方法包括例如，整合增加基因表达的重组启动子。
[0348]
例如，内源或异源多核苷酸在重组宿主细胞中的过表达可以通过修饰控制此类表达的启动子来实现，例如通过将与所述多核苷酸可操作地连接的启动子(例如，内源启动子或在野生型生物体中与所述多核苷酸天然连接的启动子)用另一种更强的启动子替代以便达到高表达水平。此类启动子可以是诱导型的或组成型的。启动子的修饰也可以通过本领域已知的诱变方法进行。
[0349]
在一个优选的实施方案中，编码adh2蛋白的多核苷酸和编码poi的多核苷酸两者的表达由诱导型启动子驱动。在另一个优选的实施方案中，编码adh2蛋白的多核苷酸和编码poi的多核苷酸两者的表达由组成型启动子驱动。在又另一个优选的实施方案中，编码adh2蛋白的多核苷酸的表达由组成型启动子驱动，并且编码poi的多核苷酸的表达由诱导型启动子驱动。在又另一个优选的实施方案中，编码adh2蛋白的多核苷酸的表达由诱导型
启动子驱动，并且编码poi的多核苷酸的表达由组成型启动子驱动。
[0350]
具体地，甲醇诱导型启动子可以用在用于过表达编码adh2的基因和/或表达goi的表达构建体中，如本文进一步所述的。
[0351]
例如，编码adh2蛋白的多核苷酸的表达可以由组成型gap启动子驱动，并且编码poi的多核苷酸的表达可以由甲醇诱导型aox1或aox2启动子驱动。
[0352]
在一个实施方案中，编码adh2蛋白的多核苷酸和poi的表达由就启动子活性(例如，启动子强度)和/或表达行为(例如，诱导型或组成型)而言相同启动子或相同类型的启动子驱动。
[0353]
在本文中也称为“欠表达”的术语“降低表达”是指小于由参考标准展现出的表达量或水平(例如，活性或浓度)的任何量或水平(例如，活性或浓度)，参考标准可以是在减少某个多核苷酸的表达的遗传改变之前的宿主细胞，或者所述表达量或水平是以其他方式在未经工程化改造以降低所述多核苷酸的表达的相同类型或物种的宿主细胞中表达的。如本文所述的表达的减少具体是指编码定义的aox1蛋白或aox2蛋白的多核苷酸或基因，特别是对于工程化改造前的宿主细胞是内源的基因。特别地，相应的基因产物是如本文所述的定义的aox1蛋白或aox2蛋白。在通过遗传修饰对宿主细胞进行工程化改造以减少所述基因的表达后，所述基因产物或多肽的表达水平小于在宿主细胞的遗传修饰之前或在未经遗传修饰的可比较宿主中的相同基因产物或多肽的表达。“小于”包括例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。术语“表达的减少”或“欠表达”还包括不表达基因产物或多肽。
[0354]
根据本文所述的具体实施方案，宿主细胞经工程化改造以敲低或敲除(用于基因或其一部分的失活或缺失)编码aox1蛋白或aox2蛋白(如本文所定义，包括例如野生型巴斯德毕赤酵母中天然存在的序列的同源物或直向同源物)的内源宿主细胞基因或赋予宿主细胞表达或产生所述aox1蛋白或aox2蛋白的能力的其他(编码或非编码)核苷酸序列。
[0355]
具体地，提供了缺失菌株，其中核苷酸序列被破坏。
[0356]
如本文所用的术语“破坏”是指在宿主细胞中一种或多种内源蛋白的表达或活性的显著减少至完全去除，诸如通过敲低或敲除。这可以测量为在宿主细胞的细胞培养物或培养基中该一种或多种内源蛋白的存在，诸如通过质谱法，其中内源蛋白的总含量可以小于阈值或不可检测。可替代地，它可以测量为内源蛋白的酶活性。
[0357]
术语“破坏”具体是指通过选自由以下项组成的组的至少一个步骤遗传工程化改造的结果：基因沉默、基因敲低、基因敲除、显性负性构建体的递送、条件基因敲除、和/或通过针对特定基因的遗传改变。
[0358]
在如本文所用在基因表达的上下文中的术语“敲低”、“减少”或“缺失”是指与对照细胞中的表达相比导致给定基因的表达减少的实验方法。基因的敲低可以通过各种实验手段实现，所述实验手段诸如将与基因的mrna的部分杂交导致其降解的核酸分子(例如，shrna、rnai、mirna)引入细胞中，或以导致转录减少、mrna稳定性减少、mrna翻译减弱、或编码蛋白的活性降低的方式改变基因的序列。
[0359]
对给定基因表达的完全抑制被称为“敲除”。基因的敲除意指从所述基因没有合成功能转录物，导致通常由此基因提供的功能丧失。基因敲除是通过改变dna序列导致基因或其调控序列或此类基因或调控序列的一部分的破坏或缺失来实现的。敲除技术包括使用同
源重组技术来替代、中断或缺失关键部分或整个基因序列，或使用dna修饰酶(诸如锌指或大范围核酸酶)向目标基因的dna中引入双链断裂，例如，由gaj等人(trends biotechnol.2013；31(7):397-405)所述。
[0360]
具体实施方案采用一种或多种敲除质粒或盒，将其转化或转染到宿主细胞中。通过同源重组，可以破坏宿主细胞中的靶基因。通常重复此程序，直到目标基因的所有等位基因都被稳定去除。
[0361]
用于敲除如本文所述特定基因的一种特定方法是crispr-cas9方法，如在例如weninger等人(j.biotechnol.2016,235:139-49)中所述。另一种方法包括如由例如heiss等人2013(appl microbiol biotechnol.97(3):1241-9.)所述的分割(split)标记方法。
[0362]
另一个实施方案涉及通过使用小干扰rna(sirna)转染宿主细胞并且靶向编码由所述宿主细胞内源表达的靶蛋白的mrna来进行靶mrna降解。
[0363]
可以通过直接干扰基因表达的方法来抑制或减少基因的表达，所述方法包括但不限于dna转录的抑制或减少，例如通过使用特定启动子相关阻遏子，通过给定启动子的位点特异性诱变，通过启动子交换；或翻译的抑制或减少，例如通过rnai或非编码rna诱导的转录后基因沉默。活性降低的功能失调或无活性基因产物的表达可以例如通过位点特异性诱变或随机诱变、在编码基因内的插入或缺失来实现。
[0364]
基因产物活性的抑制或减少可以例如通过在蛋白质表达之前或同时施用相应酶的抑制剂或与其一起孵育来实现。此类抑制剂的实例包括但不限于针对所述酶或其配体或受体的抑制性肽、抗体、适体、融合蛋白或抗体模拟物、或抑制性肽或核酸、或具有相似结合活性的小分子。
[0365]
基因沉默、基因敲低和基因敲除是指通过遗传修饰或通过用具有与mrna转录物或基因互补的序列的寡核苷酸处理来减少基因表达的技术。如果进行dna的遗传修饰，则结果是敲低或敲除生物体。如果基因表达的变化是由与mrna结合或与基因暂时结合的寡核苷酸引起的，则这会导致基因表达的暂时变化，而不修饰染色体dna，并且被称为短暂敲低。
[0366]
在也被以上术语包括的短暂敲低中，此寡核苷酸与活性基因或其转录物的结合通过转录的阻断(在基因结合的情况下)、mrna转录物的降解(例如，通过小干扰rna(sirna)或反义rna)或mrna翻译的阻断而引起表达降低。
[0367]
进行基因沉默、敲低或敲除的其他方法是技术人员从相应的文献中已知的，并且其在本发明的上下文中的应用被认为是常规的。基因敲除是指完全阻断基因表达的技术，即相应的基因不起作用或甚至被去除。实现这个目标的方法学方法是多种多样的并且是技术人员已知的。实例是给定基因显性负性的突变体的产生。此类突变体可以通过定点诱变(例如，缺失、部分缺失、插入或核酸取代)、通过使用合适的转座子、或通过技术人员从相应文献中已知的其他方法产生，其应用因此在本发明的上下文中被认为是常规的。一个实例是通过使用靶向锌指核酸酶敲除。由西格玛奥德里奇公司以“compozr敲除zfn”提供了相应的试剂盒。另一种方法包括使用转录激活因子样效应物核酸酶(talen)。
[0368]
显性负性构建体的递送涉及引入编码功能失调的基因表达产物的序列，例如通过转染。所述编码序列与强启动子在功能上偶联，其方式使得功能失调酶的基因表达推翻基因表达产物的天然表达，这进而导致所述基因表达产物的相应活性的有效生理缺陷。
[0369]
条件基因敲除允许以组织或时间特异性方式阻断基因表达。例如，这是通过在目
的基因周围引入称为loxp位点的短序列来完成的。同样，技术人员从相应的文献中已知其他方法，并且其在本发明的上下文中的应用被认为是常规的。
[0370]
一种其他方法是基因改变，这可能导致功能失调的基因产物或导致活性降低的基因产物。这种方法涉及引入移码突变、无义突变(即，引入提前终止密码子)或导致氨基酸取代的突变，所述氨基酸取代使整个基因产物功能失调或引起活性降低。此类基因改变可以例如通过诱变(例如，缺失、部分缺失、插入或核酸取代)产生，所述诱变是非特异性(随机)诱变或定点诱变。描述基因沉默、基因敲低、基因敲除、显性负性构建体的递送、条件基因敲除、和/或基因改变的实际应用的方案对于本领域技术人员来说通常是可获得的，并且在其常规范围内。因此，本文提供的技术教导对于导致基因产物的基因表达的抑制或减少或导致功能失调或无活性的基因产物或活性降低的基因产物的表达的所有可想到的方法是完全可行的。
[0371]
本文所述的遗传修饰可以采用本领域已知的工具、方法和技术，诸如j.sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual(第3版),冷泉港实验室(cold spring harbor laboratory),冷泉港实验室出版社,纽约(2001)所述。
[0372]
如本文所用的术语“内源”意在包括在减少相应内源基因的表达和/或减少内源蛋白的产生的其修饰之前存在于野生型(天然)宿主细胞中的那些分子和序列，特别是内源基因或蛋白。特别地，如其在自然界中被发现的那样确实存在于特定宿主细胞中(并且可以从其获得)的内源核酸分子(例如，基因)或蛋白被理解为“宿主细胞内源的”或“对于宿主细胞是内源的”。此外，“内源表达”核酸或蛋白质的细胞如相同特定类型的宿主如其在自然界中发现的那样表达该核酸或蛋白质。此外，“内源产生(endogenously producing)”或“内源产生(endogenously produces)”核酸、蛋白质或其他化合物的宿主细胞如相同特定类型的宿主如其在自然界中发现的那样产生该核酸、蛋白质或化合物。
[0373]
因此，即使蛋白质编码基因失活或缺失的宿主细胞(诸如宿主细胞的敲除突变体)不再产生内源蛋白，所述蛋白质在本文中仍被称为“内源的”。
[0374]
如本文关于核苷酸序列、构建体诸如表达盒、氨基酸序列或蛋白质使用的术语“异源的”是指这样的化合物，所述化合物对给定宿主细胞是外来的，即“外源的”，诸如在自然界中在所述宿主细胞中未发现的；或所述化合物是在给定宿主细胞中天然存在的，例如是“内源的”，然而，在异源构建体或整合到此类异源构建体中的上下文中，例如采用与内源核酸融合或结合的异源核酸，从而使构建体是异源的。如内源发现的异源核苷酸序列也可以在细胞中以非天然的量，例如大于预期或大于天然发现的量产生。异源核苷酸序列或包含异源核苷酸序列的核酸可能在序列上与内源核苷酸序列不同，但编码与内源发现的相同的蛋白质。具体地，异源核苷酸序列是在自然界中与宿主细胞不是以相同关系发现的那些。任何重组或人工核苷酸序列都被理解为异源的。异源多核苷酸的实例是与启动子不天然相关的核苷酸序列，例如以获得杂交启动子，或可操作地连接至编码序列，如本文所述。其结果是，可以获得杂交或嵌合多核苷酸。异源化合物的另一个实例是poi编码多核苷酸，其可操作地连接至通常不与内源的天然存在的poi编码序列可操作地连接的转录控制元件(例如，启动子)。
[0375]
如本文所用的术语“可操作地连接”是指核苷酸序列在单个核酸分子(例如，载体或表达盒)上的关联，其方式使得一个或多个核苷酸序列的功能受到存在于所述核酸分子
上的至少一种其他核苷酸序列的影响。通过可操作地连接，核酸序列被置于与相同核酸分子上的另一个核酸序列呈功能关系。例如，当启动子能够影响该编码序列的表达时，它与重组基因的编码序列可操作地连接。又例如，当编码信号肽的核酸能够表达呈分泌形式的蛋白质诸如成熟蛋白质的预成形体或成熟蛋白质时，编码信号肽的核酸与编码poi的核酸序列可操作地连接。具体地，彼此可操作地连接的此类核酸可以紧接地连接，即在编码信号肽的核酸与编码poi的核酸序列之间没有其他元件或核酸序列。
[0376]
如本文所用的术语“甲醇营养型酵母”属于共用共同代谢途径的酵母属和物种，所述共同代谢途径使它们能够使用甲醇作为用于其生长的唯一碳源。在转录调控的对甲醇诱导的反应中，若干种酶以高水平快速合成。由于控制这些基因的表达的启动子是最强和最严格调控的酵母启动子之一，因此甲醇营养型酵母作为大规模生产重组蛋白的宿主很有吸引力。
[0377]
如本文所述的甲醇营养型酵母通过一种或多种遗传修饰突变以使其在甲醇利用途径中存在缺陷，特别是通过欠表达分别编码内源aox1和aox2蛋白的基因中的一种或两种。欠表达编码aox1蛋白的基因和编码aox2蛋白的基因两者或以其他方式在表达编码aox1蛋白的基因和编码aox2蛋白的基因两个方面有缺陷的甲醇营养型酵母在本文中被理解为“mut
‑”
。为了本文所述的目的，此类mut-酵母仍被称为“甲醇营养型酵母”，因为在此类一种或多种遗传修饰之前包含功能甲醇利用途径。
[0378]
如果启动子控制编码序列的转录，则“启动子”序列通常被理解为与编码序列可操作地连接。如果启动子序列与编码序列不天然相关，则其转录在天然(野生型)细胞中不受启动子控制，或者所述序列与不同的连续序列重组。
[0379]
用于本文所述目的的启动子在本文中称为“ecp”。ecp可以是组成型启动子、诱导型启动子或阻遏型启动子。在一个具体实施方案中，ecp是分别可由甲醇和甲醇碳源诱导的启动子。
[0380]
如本文所述的ecp特别启动、调控或以其他方式介导或控制poi编码dna的表达。启动子dna和编码dna可以来自同一个基因或来自不同的基因，并且可以来自相同或不同的生物体。
[0381]
如本文所述的诱导型ecp被具体理解为可调控启动子，其在阻遏和诱导状态下具有不同的启动子强度。关于诱导型或阻遏型调控元件(诸如本文所述的启动子)的术语“可调控”应指这样的元件，其在宿主细胞中例如在分批培养物的生长阶段中在过量物质(诸如细胞培养基中的营养物)的存在下被阻遏并且根据补料分批策略例如在生产阶段中(诸如在进料补充底物或添加甲醇用于甲醇诱导后)被去阻遏以诱导强活性。调控元件也可以设计为是可调控的，使得所述元件在不添加细胞培养添加剂的情况下是无活性的，而在此类添加剂的存在下是有活性的。因此，在添加此类添加剂后可以诱导在此类调控元件的控制下poi的表达。
[0382]
ecp的强度具体是指其转录强度，通过以高或低频率在该启动子处发生的转录起动的效率表示。转录强度越高，在该启动子处发生的转录将越频繁。启动子强度是启动子的典型特征，因为它决定了给定mrna序列转录的频率，有效地为某些基因的转录提供了比其他基因更高的优先级，从而导致更高的转录物浓度。例如，编码大量需要的蛋白质的基因通常具有相对强的启动子。rna聚合酶一次只能执行一项转录任务，并且因此必须优先使其工
作是效率的。选择启动子强度的差异以允许这种优先化。
[0383]
强ecp在本文中是优选的，特别是在完全诱导状态下相对强的ecp，所述状态通常被理解为约最大活性的状态。相对强度通常相对于可比较的启动子来确定，所述可比较的启动子在本文中称为参考启动子，其可以是标准启动子，诸如如用作宿主细胞的细胞的相应pgap启动子。
[0384]
转录频率通常被理解为转录速率，例如，如通过在合适的测定(例如，rt-pcr或rna印迹)中转录物的量确定的。例如，根据本发明的启动子的转录强度在为巴斯德毕赤酵母的宿主细胞中确定并且与巴斯德毕赤酵母的天然pgap启动子进行比较。
[0385]
启动子表达目的基因的强度通常被理解为支持高表达水平/速率的表达强度或能力。例如，本发明启动子的表达和/或转录强度在为巴斯德毕赤酵母的宿主细胞中确定并且与巴斯德毕赤酵母的天然pgap启动子进行比较。
[0386]
与参考启动子相比的比较转录强度可以通过标准方法确定，诸如通过测量转录物的量，例如使用微阵列，或者另外在细胞培养物中，诸如通过测量重组细胞中相应基因表达产物的量。特别地，转录速率可以通过在微阵列、rna印迹上或用定量实时pcr(qrt-pcr)或用rna测序(rna-seq)的转录强度来确定，其中数据显示出具有高生长速率的条件与具有低生长速率的条件或采用不同培养基组成的条件之间的表达水平差异以及与参考启动子相比的高信号强度。
[0387]
例如，表达速率可以通过报告基因(诸如egfp)的表达量来确定。
[0388]
如本文所述的ecp发挥相对高的转录强度，例如，通过与宿主细胞中的天然pgap启动子(也称为“同源pgap启动子”)相比至少15％的转录速率或转录强度反映。优选地，转录速率或强度是与天然pgap启动子相比至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或甚至更高中的任一个，诸如至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％或甚至更高中的任一个，诸如在为了产生poi的重组目的而选择作为宿主细胞的(例如，真核)宿主细胞中确定。
[0389]
天然pgap启动子通常启动编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的gap基因的表达，所述gap基因是存在于大多数活生物体中的组成型启动子。gapdh(ec 1.2.1.12)是糖酵解和糖异生的关键酶，在分解代谢和合成代谢碳水化合物代谢中起至关重要的作用。
[0390]
天然pgap启动子具体地在重组真核细胞中是活性的，其方式与在相同物种或菌株的天然真核细胞(包括未经修饰的(非重组)或重组真核细胞)中相似。此类天然pgap启动子通常被理解为内源启动子，因此与宿主细胞同源，并且可以作为用于比较目的的标准或参考启动子。通常将如本文所述启动子的相对表达或转录强度与用作产生poi的宿主的相同物种或菌株的细胞的天然pgap启动子进行比较。
[0391]
如本文所用的术语“诱变”应指提供核苷酸序列突变体的方法，例如通过插入、缺失和/或取代一个或多个核苷酸以便获得在非编码区或编码区中具有至少一个改变的其变体。诱变可以通过随机、半随机或定点突变进行。可以使用亲本序列作为参考通过合适的诱变方法产生变体。某些诱变方法包括使用相应的亲本序列信息作为模板来工程化改造核酸或从头合成核苷酸序列的那些方法。特定诱变方法适用于突变体的合理工程化改造。
[0392]
本文所用的术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指dna或rna。“核酸序列”或“多核苷酸序列”或简单地“多核苷酸”是指从5’端到3’端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱
基的单链或双链聚合物。它包括表达盒、自我复制质粒、dna或rna的感染性聚合物、以及非功能dna或rna。
[0393]
如本文所用的术语“目的蛋白(poi)”是指借助重组技术在宿主细胞中产生的多肽或蛋白质。更具体地，所述蛋白质可以是宿主细胞中非天然存在的多肽，即异源蛋白，或者另外可以对于宿主细胞是天然的，即宿主细胞的同源蛋白，但是例如通过用含有编码poi的核酸序列的自我复制载体转化、或通过重组技术将编码poi的核酸序列的一个或多个拷贝整合到宿主细胞的基因组中、或通过重组修饰控制编码poi的基因的表达的一个或多个调控序列(例如，启动子序列)来产生。在一些情况下，如本文所用的术语poi也指如由重组表达的蛋白质介导的宿主细胞的任何代谢物产物。
[0394]
与亲本核苷酸或氨基酸序列相比，变体、同源物或直向同源物的术语“序列同一性”指示两个或更多个序列的同一性程度。两个或更多个氨基酸序列可以在相应位置具有相同或保守的氨基酸残基，在一定程度上，最高达100％。两个或更多个核苷酸序列可以在相应位置具有相同或保守的碱基对，在一定程度上，最高达100％。
[0395]
序列相似性搜索是一种用于鉴定具有过量(例如，至少50％)序列同一性的同源物的有效且可靠的策略。经常使用的序列相似性搜索工具是例如blast、fasta和hmmer。
[0396]
序列相似性搜索可以通过检测过量相似性和反映共同祖先的统计上显著的相似性来鉴定此类同源蛋白质或基因。同源物可以包括直向同源物，其在本文中被理解为不同生物体中的相同蛋白质，例如不同不同生物体或物种中此类蛋白质的变体。
[0397]
不同生物体或物种中相同蛋白质的直向同源序列通常是与蛋白质序列、特别是来源于相同属的直向同源物同源的。通常，直向同源物具有至少约以下中的任一个：25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，最高达100％序列同一性。
[0398]
具体地，蛋白质的直向同源物可以在敲除宿主细胞中将所述蛋白质或编码所述蛋白质的基因用直向同源序列替代后确定，所述宿主细胞在此类替代之前已经修饰以敲除相应的基因或蛋白质。
[0399]
例如，如果在其中编码此类内源蛋白的基因已被敲除的巴斯德毕赤酵母宿主细胞中替代相应内源蛋白，推定的adh2、aox1或aox2蛋白在巴斯德毕赤酵母宿主细胞中具有功能，则为了本文所述的目的，此类推定的adh2、aox1或aox2可以被认为是相应的同源物。
[0400]
包含鉴定为seq id no:1的氨基酸序列或由其组成的aox1蛋白是法夫驹形氏酵母来源的。充分理解的是，其他甲醇营养型酵母宿主细胞中存在同源序列。例如，巴斯德毕赤酵母的酵母包含相应同源序列。巴斯德毕赤酵母已被重新归类于新属驹形氏酵母属，并且分为三个种：巴斯德驹形氏酵母、法夫驹形氏酵母和伪巴斯德驹形氏酵母。
[0401]
seq id no:1的特定同源序列例如发现于巴斯德驹形氏酵母(例如，seq id no:9，诸如由包含seq id no:10或由seq id no:10组成的核苷酸序列编码)、多形绪方酵母(例如，seq id no:19，诸如由包含seq id no:20或由seq id no:20组成的核苷酸序列编码)或甲醇绪方酵母(例如，seq id no:13，诸如由包含seq id no:14或由seq id no:14组成的核苷酸序列编码的)。
[0402]
包含鉴定为seq id no:3的氨基酸序列或由鉴定为seq id no:3的氨基酸序列组成的aox2蛋白是法夫驹形氏酵母来源的。充分理解的是，其他甲醇营养型酵母宿主细胞中
存在同源序列。例如，巴斯德毕赤酵母的酵母包含相应同源序列。巴斯德毕赤酵母已被重新归类于新属驹形氏酵母属，并且分为三个种：巴斯德驹形氏酵母、法夫驹形氏酵母和伪巴斯德驹形氏酵母。
[0403]
seq id no:3的特定同源序列例如发现于巴斯德驹形氏酵母(例如，seq id no:11，诸如由包含seq id no:12或由seq id no:12组成的核苷酸序列编码)、多形绪方酵母(例如，seq id no:19，诸如由包含seq id no:20或由seq id no:20组成的核苷酸序列编码)或甲醇绪方酵母(例如，seq id no:15，诸如由包含seq id no:16或由seq id no:16组成的核苷酸序列编码的)。
[0404]
多形绪方酵母仅具有一种醇氧化酶，本文中例示为seq id no:19。因此，如本文所述的多形绪方酵母中aox1和aox2的表达的减少有效地通过减少多形绪方酵母的内源醇氧化酶的表达来进行。
[0405]
具有本文所述的某种序列同一性的aox1或aox2蛋白的任何同源序列、特别是作为巴斯德毕赤酵母aox1或aox2蛋白的直向同源物的任何此类蛋白都包括在如本文所述的相应aox1蛋白或aox2蛋白的定义中。
[0406]
包含鉴定为seq id no:50的氨基酸序列或由鉴定为seq id no:50的氨基酸序列组成的adh2蛋白是法夫驹形氏酵母来源的。充分理解的是，其他甲醇营养型酵母宿主细胞中存在同源序列。例如，巴斯德毕赤酵母的酵母包含相应同源序列。巴斯德毕赤酵母已被重新归类于新属驹形氏酵母属，并且分为三个种：巴斯德驹形氏酵母、法夫驹形氏酵母和伪巴斯德驹形氏酵母。
[0407]
seq id no:50的特定同源序列例如是seq id no:52、54、56、58、60、62、64、66、68或70中的任一个。
[0408]
具有本文所述的某种序列同一性的adh2蛋白的任何同源序列、特别是如本文所述的巴斯德毕赤酵母adh2蛋白的直向同源物的任何此类蛋白。
[0409]
关于本文所述的氨基酸序列、同源物和直向同源物的“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为在比对序列并且引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
[0410]
为了本文所述的目的，使用具有以下示例性参数的ncbi blast程序版本blastp 2.8.1确定两个氨基酸序列之间的序列同一性：程序：blastp，字长：6，期望值：10，hitlist大小：100，空位罚分：11.1，矩阵：blosum62，过滤字符串：f，组成调整：条件组成得分矩阵调整。
[0411]
关于核苷酸序列(例如，启动子或基因)的“同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并且引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选dna序列中与dna序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。可以以本领域技术内的各种方式，例如使用公开可用的计算机软件，来实现用于确定核苷酸序列同一性百分比目的的比对。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
[0412]
为了本文所述的目的(除非另有指示)，使用具有以下示例性参数的ncbi blast程
序版本blastn 2.8.1确定两个氨基酸序列之间的序列同一性：程序：blastn，字长：11，期望阈值：10，hitlist大小：100，空位罚分：5.2，匹配/错配得分：2,-3，过滤字符串：低复杂度区域，仅为查找表标记。
[0413]
如本文关于poi所用的术语“分离的(isolated)”或“分离(isolation)”应指这样的化合物，其已与和其天然相关的环境，特别是细胞培养物上清液充分分离，从而以“纯化的”或“基本上纯的”的形式存在。然而，“分离出的”并不一定意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或排除不干扰基本活性的杂质的存在，并且所述杂质可能例如由于不完全纯化而存在。可以进一步配制分离出的化合物以产生其制剂，并且仍然出于实际目的将其分离出来-例如，当用于诊断或疗法时，poi可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。
[0414]
如本文所用的术语“纯化的”应指包含至少50％(mol/mol)，优选至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物(例如，poi)的制剂。通过适于化合物的方法(例如，色谱方法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、hplc分析等)测量纯度。可以通过纯化细胞培养物上清液以减少杂质来获得如本文所述的分离出的纯化poi。
[0415]
可以使用用于获得重组多肽或蛋白产物的分离和纯化方法，所述方法诸如利用溶解度差异的方法，诸如盐析和溶剂沉淀；利用分子量差异的方法，诸如超滤和凝胶电泳；利用电荷差异的方法，诸如离子交换色谱法；利用特异性亲和力的方法，诸如亲和色谱法；利用疏水性差异的方法，诸如反相高效液相色谱法；以及利用等电点差异的方法，诸如等电聚焦。
[0416]
优选以下标准方法：通过微滤或切向流过滤器(tff)或离心进行细胞(碎片)分离和洗涤、通过沉淀或热处理的poi纯化、通过酶消化的poi活化、通过色谱法(诸如离子交换(iex)、疏水相互作用色谱法(hic)、亲和色谱法、尺寸排阻(sec)或hplc色谱法)的poi纯化、通过超滤步骤浓缩和洗涤poi沉淀。
[0417]
高度纯化的产物基本上不含污染性蛋白质，并且优选具有至少90％、更优选至少95％、或甚至至少98％、最高达100％的纯度。纯化的产物可以通过细胞培养物上清液或另外从细胞碎片中纯化获得。
[0418]
分离出和纯化的poi可以通过常规方法进行鉴定，诸如蛋白质印迹、hplc、活性测定或elisa。
[0419]
如本文所用的术语“重组”意指“是通过遗传工程化改造制备的或是其结果。重组宿主可以经工程化改造以缺失和/或失活一个或多个核苷酸或核苷酸序列，并且可以具体地包含含有重组核酸序列(特别是采用对于宿主是外来的核苷酸序列)的表达载体或克隆载体。通过在宿主中表达相应的重组核酸来产生重组蛋白。如本文关于poi所用的术语“重组”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离出的poi，诸如从经转化以表达poi的宿主细胞中分离出的poi。根据本发明，可以使采用本领域技术范围内常规的分子生物学、微生物学和重组dna技术。文献中充分解释了此类技术。参见例如，maniatis,fritsch和sambrook,“molecular cloning:alaboratory manual,冷泉港,(1982)。
[0420]
某些重组宿主细胞是“经工程化改造的”宿主细胞，其被理解为已使用遗传工程化改造(即，通过人为干预)操纵的宿主细胞。当宿主细胞经工程化改造以减少表达或欠表达给定基因或相应蛋白质时，操纵宿主细胞，使得分别与在操纵前在相同条件下的宿主细胞
相比或与未经工程化改造使得所述基因和蛋白质欠表达的宿主细胞相比，所述宿主细胞不再具有表达此类基因和蛋白质的能力。
[0421]
参考以下实施例将更充分地理解前述描述。然而，此类实施例仅代表实践本发明的一个或多个实施方案的方法，并且不应被理解为限制本发明的范围。
[0422]
实施例
[0423]
实施例1：巴斯德毕赤酵母的甲醇利用负型菌株的产生。
[0424]
为了产生甲醇利用负型菌株(mut-)，从巴斯德毕赤酵母(同义词法夫驹形氏酵母(komagataella phaffii))的基因组中缺失名称为aox1和aox2的负责甲醇利用的两个基因。
[0425]
a)为此目的，使巴斯德毕赤酵母菌株(cbs2612，cbs-knaw真菌生物多样性中心，真菌培养中心办公室(centraalbureau voor schimmelcultures)，乌特勒支，荷兰)处于电感受态。将菌株接种到100ml ypd培养基(主要培养物)中持续16-20小时(25℃；180rpm)，并且通过在两个50ml falcon管中离心(5min；1500g；4℃)以1.8-3的光密度(od
600
)收获。将细胞沉淀物重新悬浮于10ml ypd+20mm hepes+25mm dtt中并且孵育(30min；25℃；180rpm)。孵育期后，向falcon管中填充40ml冰冷的无菌蒸馏水并且离心(5min；1500g；4℃)(艾本德股份公司(eppendorf ag)，德国)。将细胞沉淀物重新悬浮于冰冷的无菌1mm hepes缓冲液ph 8中并且离心(5min；1500g；4℃)。将细胞沉淀物重新悬浮于45ml冰冷的1m山梨糖醇中并且离心(5min；1500g；4℃)。将沉淀物重新悬浮于500μl冰冷的1m山梨糖醇中，并且以80μl等分到冰冷的1.5ml eppendorf管中。将等分的电感受态细胞保持在-80℃直到使用。
[0426]
b)在含有500μg/ml遗传霉素或200μg/ml潮霉素(当为了选择而需要时)的ypd培养基(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖)或ypd琼脂板(10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖，20g/l琼脂-琼脂)中进行酵母菌株的培养。
[0427]
c)为了产生aox1和aox2缺失菌株，使用分割标记盒方法(gasser等人，2013)。用于产生基因缺失的dna片段在表1中找到。分割标记盒携带侧接loxp位点的遗传霉素的抗生素抗性盒。
[0428]
d)通过以下方式进行缺失：将0.5μg aox1分割标记盒1和0.5μg aox1分割标记盒2添加到等分的电感受态细胞中，并且在冰上孵育5min。在2kv下进行电穿孔4毫秒(gene pulser，伯乐实验室公司(bio-rad laboratories,inc)，美国)。转化后，将电穿孔细胞悬浮在1ml ypd培养基中，并且在30℃下在热振荡器(艾本德股份公司，德国)上在700rpm振荡下再生1.5h至3h。随后，将20μl和150μl细胞悬液铺板在含有500μg/ml用于选择的遗传霉素的ypd板上，并且在28℃下孵育48小时。将出现的菌落重新划线到含有500μg/ml遗传霉素的新鲜ypd板上。通过使用结合在缺失盒外的引物aox1_ctrl_fwd和aox1_ctrl_rev(表2)在基因组dna上进行pcr来验证aox1基因座的正确破坏。基于pcr扩增和pcr扩增子的测序选择一个克隆，确认所希望的基因的正确缺失，从而产生巴斯德毕赤酵母aox1δ::kanmx菌株。如实施例1a)中所解释，从单个阳性菌落孵育液体培养物并且使其处于电感受态，不同之处在于向液体培养基中添加500μg/ml遗传霉素以产生主要培养物。将菌株用500μg ptac_cre_hph_mx4质粒进行电穿孔，所述质粒携带用于缺失在loxp区之间的遗传霉素抗生素抗性盒和用于选择的潮霉素抗性盒所需的cre重组酶(marx,mattanovich和sauer，2008)。如所述进行电穿孔，并且通过将转化体平行地重新划线在具有500μg/ml遗传霉素和200μg/ml潮霉
素的ypd和具有仅200μg/ml潮霉素的ypd板上来选择遗传霉素抗性的丧失。选择无法在具有500μg/ml遗传霉素和200μg/ml潮霉素的ypd板上生长但可以在具有仅200μg/ml潮霉素的ypd板上生长的克隆。通过用引物aox1_ctrl_fwd和aox1_ctrl_rev(表2)进行pcr扩增并且测序pcr扩增子(microsynth ag，瑞士)来验证aox1编码区和抗生素标记的成功缺失。产生的菌株称为巴斯德毕赤酵母cbs2612δaox1并且具有muts表型。选择其用于进一步的遗传操纵。
[0429]
e)使用巴斯德毕赤酵母cbs2612δaox1以用a)中所述方案产生电感受态细胞，并且用d)中所述程序用0.5μg aox2分割标记盒1和0.5μg aox2分割标记盒2(表1)进行电穿孔。用与d)中所述相同的程序去除抗生素标记。通过用引物aox2_ctrl_fwd和aox2_ctrl_rev(表2)进行pcr扩增并且测序pcr扩增子(microsynth ag，瑞士)来验证aox2编码区和抗生素标记的成功缺失。产生的菌株称为巴斯德毕赤酵母cbs2612δaox1δaox2并且具有甲醇利用负型(mut-)表型。
[0430]
f)用基因组dna纯化试剂盒(普洛麦格公司(promega corporation)，美国)按照制造商的推荐分离出用于pcr扩增的基因组dna。用q5聚合酶(新英格兰生物实验室公司(new england biolabs,inc.)，美国)按照制造商的推荐完成pcr扩增反应。
[0431]
表1：用于产生aox1和aox2缺失菌株的分割标记盒dna序列。
[0432]
[0433]
[0434]
[0435][0436]
表2：聚合酶链式反应引物
[0437]
引物名称dna序列5’至3’aox1_ctrl_fwdggctggaaatagatgtagggag(seq id no:29)aox1_ctrl_revtcgcatctccgcaaatttctc(seq id no:30)
aox2_ctrl_fwdgatcccattccctatccatgt(seq id no:31)aox2_ctrl_revctctcccccctcgtaatctt(seq id no:32)
[0438]
实施例2：用在甲醇诱导型aox1启动子下的巴斯德毕赤酵母δaox1和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2产生细胞内egfp。
[0439]
为了测试蛋白质生产能力和启动子活性，将巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2和巴斯德毕赤酵母δaox1菌株用用于增强型绿色荧光蛋白(egfp)的表达构建体(表4)转化。egfp编码序列处在p
aox1
:pp7435_chr4(237941
…
238898)的表达控制下。
[0440]
a)使用如(prielhofer等人，2017)所述的golden gate组装程序从质粒bb1_12_paox1、bb1_23_egfp、bb1_34_sccyc1tt和bb3an_14*组装表达构建体bb3an_paox1_gfp_sccyctt。质粒和序列可在golden pics试剂盒#1000000133(addgene公司，美国)中获得。在电穿孔前，将质粒用限制性酶asci(新英格兰生物实验室公司，美国)按照制造商的方案进行线性化并且用higel/pcrdna片段提取试剂盒(s
ü
d-laborbedarf gmbh，德国)进行纯化。将500ng线性化质粒转化到电感受态巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2和巴斯德毕赤酵母δaox1中，如前面实施例1a)和1d)中所述。在具有100μg/l诺尔丝菌素的ypd上选择阳性转化体，并且用于以后的筛选实验。
[0441]
b)在巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2和巴斯德毕赤酵母δaox1中细胞内egfp表达的小规模筛选实验。挑取10个来自实施例2a)的转化体并且接种到含有2ml ypd和100μg/l诺尔丝菌素/孔的24深孔板中的过夜培养物中。一式两份地测试所有转化体。将24孔板用空气可透膜密封并且在25℃和280rpm下孵育。为了筛选egfp的细胞内表达水平，将过夜培养物转移到用于缓慢葡萄糖释放的具有25g/l多糖和0.3％淀粉酶(m2p-labs gmbh，德国)的2.5ml基本asmv6培养基的24深孔板中，并且孵育两小时，然后添加0.2％(v/v)或1％(v/v)甲醇以诱导egfp产生。使用gallios流式细胞仪(贝克曼库尔特公司(beckman coulter,inc.)，美国)在诱导后4和20小时进行egfp测量。为此目的，将细胞稀释在含有0.24g/l kh2po4、1.8g/l na2hpo4*2h2o、0.2g/l kcl、8g/l nacl的磷酸盐缓冲盐水中至0.5的od
600
。测量20,000个事件。用软件facs express版本3(de novo software，美国)使用以下方程计算fx值：
[0442][0443]
fx＝无量纲值
[0444]
fl1＝用505-545nm滤光片测量的荧光
[0445]
fsc＝前向散射
[0446]
所述方法已被描述(ata,prielhofer,gasser,mattanovich和2017；hohenblum,borth和mattanovich,2003；prielhofer等人,2013)。
[0447]
c)基本培养基asmv6：6.3g/l(nh4)2hpo4、0.8g/l(nh4)2so4、0.49g/l mgso4*7h2o、2.64g/l kcl、0.054g/l cacl2*2h2o、22g/l一水柠檬酸、1.47ml/l ptm0微量金属、0.8mg/l生物素、20ml/l nh4oh(25％)；用koh将ph设定为6.5。
[0448]
d)结果显示在表3中。荧光是确定细胞内egfp水平的代表指标，并且细胞内egfp水平是确定p
aox1
活性的代表指标。结果显示，在1％甲醇诱导下20小时，启动子在巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株中是活性的，并且产生了egfp。在20h后，巴斯德毕赤酵母δaox1δ
aox2 bb3an_paox1_gfp_sccyctt菌株的诱导在1％甲醇下好于在0.2％甲醇下，在巴斯德毕赤酵母δaox1菌株中未观察到甲醇浓度之间的差异。
[0449]
表3：来自实施例2b)中所述实验的结果(fx值)与标准偏差
[0450][0451]
表4：在巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2和巴斯德毕赤酵母δaox1中表达的目的基因的编码序列。
[0452]
[0453]
[0454]
[0455][0456]
实施例3：在甲醇诱导型aox1启动子下产生分泌hsa和vhh的巴斯德毕赤酵母δaox1和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株的产生。
[0457]
为了测试在巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株中产生分泌重组蛋白的能力并且将其与巴斯德毕赤酵母δaox1菌株进行比较，将菌株用以下两种分泌模型蛋白的表达构建体转化：(1)具有其天然分泌前导的人血清白蛋白(hsa)或(2)具有酿酒酵母α-配对因子分泌前导的骆驼抗体可变区(vhh)。这些目的基因的编码序列(密码子优化的和外部供应商合成的)可以在表4中找到。
[0458]
a)用于hsa和vhh生产的ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt和ppm2pz30_paox1_αmf-vhh_cyctt表达构建体是wo 2008128701 a2中所述的ppuzzle zeor载体的衍生物，其由大肠杆菌(e.coli)puc19 ori和博莱霉素(zeocin)抗生素抗性盒组成。在ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt的这种情况下，通过限制和连接将博莱霉素抗性交换为诺尔丝菌素抗性。另外，载体携带与pgi基因座pp7435_chr3(1366329
…
1367193)同源的整合序列，以实现高效整合。表达载体在别处有更详细的描述(gasser等人,2013；stadlmayr等人,2010)。目的基因(goi)的表达由p
aox1 pp7435_chr4(237941
…
238898)和酿酒酵母cyc1转录终止子介导。用于人血清白蛋白(hsa)的基因(genbanknp_000468)是针对巴斯德毕赤酵母进行密码子优化并且合成的。它具有天然分泌前导，并且因此分泌到上清液中。vhh的基因是针对巴斯德毕赤酵母进行密码子优化并且合成的(表4)，它具有n端酿酒酵母α-交配型前导，用于分泌到上清液中。为了表达构建体的转化的目的，通过用xmni(新英格兰生物实验室公司，美国)在pgi1同源序列中限制性内切将环形载体线性化，并且用higel/pcr dna片段提取试剂盒(s
ü
d-laborbedarf gmbh，德国)纯化。
[0459]
b)用500ng线性化ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt和ppm2pz30_paox1_αmf-vhh_cyctt质粒电穿孔电感受态巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2和巴斯德毕赤酵母δaox1以及分泌如前面实施例1a)和实施例1d)中所述进行。在分别具有100μg/ml诺尔丝菌素或25μg/ml博莱霉素的ypd板上进行选择。
[0460]
实施例4：产生hsa和vhh的巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2和巴斯德毕赤酵母δaox1的小规模筛选。
[0461]
a)对于预培养，将转化体接种在具有基于用于选择的抗生素抗性的100μg/ml诺尔丝菌素或25μg/ml博莱霉素的2ml ypd中。对于每种表达构建体，挑选十二个转化体用于筛选。将预培养物和筛选培养物在用空气渗透膜密封的24孔板中培养，并且在25℃下以280rpm进行孵育。将筛选培养物以8的起始光密度(od
600
)接种到2ml基本培养基(asmv6)中，其具有基于6mm进料针(科耐摇床有限责任公司(kuhner shaker gmbh)，德国)的缓慢葡萄糖释放系统以将培养物保持在葡萄糖极限内。将菌株与在接收的甲醇总量和持续时间方面不同的不同甲醇进料程序进行比较(表5)。
[0462]
b)孵育期后，取出1ml每种培养物并且在预先称重的eppendorf管中离心。去除上清液，并且用caliper labchip gxii touch(珀金埃尔默公司(perkinelmer,inc.)，美国)按照制造商的说明测量蛋白质浓度。湿细胞重量通过称重具有细胞沉淀物的eppendorf管来确定，并且如下计算：重量(满)-重量(空)＝湿细胞重量(wcw)(g/l)。由此数据计算产率：产率(μg/g)＝蛋白质浓度/湿细胞重量。将具有两倍浓度或在上清液中没有可检测蛋白质的转化体的数据作为异常值从分析中去除。异常值被认为是具有表达构建体的两个拷贝或根本没有拷贝的转化体(aw&polizzi,2013；schwarzhans等人,2016)。
[0463]
表5：用于测试转化菌株的分泌蛋白生产产率的筛选策略的概述。*第一注射是0.5％甲醇。
[0464][0465]
c)结果显示，巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2可以在p
aox1
的诱导下产生分泌蛋白，并且产率是与用作行业标准的巴斯德毕赤酵母δaox1可比较的(表6)。在“两次注射-扩展”策略中，巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2显示出更好的产率，表明在较长的孵育时间和较少的甲醇下，巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2具有产率优势。此外，这显示了有可能使用限制的葡萄糖条件来筛选产生受p
aox1
和甲醇诱导控制的分泌蛋白的巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株。
[0466]
表6：不同筛选条件下测试菌株的以μg产物/g wcw计的平均分泌产物产率与标准偏差。
[0467][0468]
实施例5：生物反应器培养
[0469]
为了确定在重组蛋白生产环境中在补料分批模式下巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2的行为和过程参数，进行生物反应器培养。如下进行培养。
[0470]
a)使用工作体积为0.7l的dasgip生物反应器(艾本德股份公司，德国)。一个生物反应器系统由四个反应器组成，所述反应器排列在一个用于控制温度的生物块中。每个反应器连接至由软件控制的4个蠕动泵。另外，每个反应器具有2个可用天平，所述天平连接至dasgip控制软件(艾本德股份公司，德国)，其用于以重量分析的方式调节泵速。每个反应器连接有可控的气体供应(加压空气、n2、o2可以以任何希望的量混合)以及用于测量反应器废气中o2和co2浓度的气体分析仪。反应器具有连接至dasgip控制软件的ph探针和溶解氧(do)探针。dasgip控制软件以一分钟的间隔记录所有参数。
[0471]
b)生物反应器培养基由bsm培养基组成(mellitzer等人,2014)：11.48g/l h3po4、0.5g/l cacl2*2h2o、7.5g/l mgso4*7h2o、9g/l k2so4、2g/l koh、40g/l甘油、0.25g/l nacl、4.35ml/l ptm0、0.87mg/l生物素、0.1ml/l glanapon 2000，将ph用25％nh3设定为5.5。
[0472]
c)ptm0由以下组成：6.0g cuso4*5h2o、0.08g nai、3.36g mnso4*h2o、0.2g na2moo4*2h2o、0.02g h3bo3、0.82g cocl2、20.0g zncl2、65.0g feso4*7h2o、5ml/l h2so4(95％-98％)。
[0473]
d)葡萄糖进料培养基由以下组成：50％(w/w)葡萄糖、2.08mg/kg生物素、10.4ml/kg ptm0。甲醇进料培养基是：50％(v/v)或100％(v/v)甲醇。甘油进料培养基由以下组成：60％(w/w)甘油、2.08mg/kg生物素、10.4ml/kg ptm0。
[0474]
e)溶解氧(do)设定点是20％。在某些情况下，使do控制失效，并且将搅动和曝气手动设定为恒定的750rpm和9.5sl/h。用由dasgip控制软件控制的12.5％或25％nh3将ph设定为5.0或5.5。在必要时用10％h3po4通过手动添加实现酸控制。将温度设定在25℃。起始od
600
为2，并且起始体积为300ml+15ml接种培养物。
[0475]
f)在每天一次基础上(大约每24小时一次)进行采样。首先从反应器中取出3ml抽吸物以去除采样口的死体积。然后取9ml样品。将3x 2ml移液到重新称重的2ml eppendorf管中，并且将1x 1.5ml移液到一个1.5ml eppendorf管中。将样品离心(16,000g，10min，4℃)。收集上清液用于蛋白质和hplc分析并且储存在-20℃。通过重新悬浮在1ml 0.1m hcl中将沉淀物洗涤以去除痕量盐并且再次离心(16,000g，10min，4℃)。然后将沉淀物在105℃下干燥24小时以确定干细胞重量。如下计算干细胞重量：(重量(满)-重量(空))/2＝干细胞
重量(g/l)并且计算为三个重复的平均值。如果只需要hplc样品，则只取2ml样品。
[0476]
g)通过用碘化丙啶将细胞悬液染色来测量细胞活力。为此，将来自反应器样品的细胞悬液用磷酸盐缓冲盐水稀释至0.5的od
600
并且与碘化丙啶储备溶液混合至最终浓度为10μm，然后用具有590-650nm过滤器的gallios流式细胞仪(贝克曼库尔特公司，美国)测量。每个样品测量50,000个事件。
[0477]
实施例6：确定从没有细胞的生物反应器中甲醇的蒸发速率。
[0478]
为了评估由于曝气和搅动从反应器中甲醇的蒸发速率，向反应器中填充无菌培养基并且用甲醇脉冲，取样品以确定甲醇浓度。
[0479]
a)对于本实施例，向两个反应器中填充310ml不含甘油的bsm培养基，并且向两个反应器中填充500ml不含甘油的bsm培养基以模拟在分批阶段结束时的培养基，此时甘油被生长培养物消耗。
[0480]
b)将反应器搅拌器速度设定为760rpm，并且将通气设定为9.5sl/h，这与培养巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2的情况相同。参数可以在表7中找到。
[0481]
c)手动添加50％(v/v)甲醇脉冲以使甲醇浓度增加到1％(v/v)，并且取样品以确定实际达到的浓度。通过首先从样品口去除3ml死体积并且丢弃抽吸物，在3.4、6.5、22.4、31.0、47.9小时取样品。之后立即取4ml样品。
[0482]
d)如前所述进行甲醇浓度的hplc测量(blumhoff,steiger,marx,mattanovich和sauer,2013)。使用纯标准品进行鉴定和定量。柱是以0.6ml/min的4mm h2so4流动相在下运行的aminex hpx-87h(伯乐实验室公司，美国)。检测器是折射率检测器rid-10a(岛津公司集团(shimadzu,corp.)，日本)，并且用labsolutions v5.85软件(岛津公司集团，日本)进行计算。
[0483]
e)仅由第一个和最后一个样品以最大的时间和浓度差异计算蒸发速率。相邻样品之间的浓度变化很小，并且测量误差可能对计算产生显著影响。数据可以在表8中找到。填充有500ml培养基的r1和r2具有0.063g*l-1
*h-1
的平均值。
[0484]
表7：反应器参数和甲醇脉冲体积。
[0485][0486]
表8：在采样时间点的甲醇浓度和计算的蒸发速率。
[0487][0488]
*太低，被认为是异常值。
[0489]
实施例7：确定巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2的甲醇摄取速率
[0490]
为了确定甲醇摄取速率，在生物反应器中培养巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt菌株。使培养物生长直到一定的生物质浓度。然后应用甲醇脉冲，并且在脉冲后立即和大约20小时后取样品。目标是确定mut-菌株的甲醇摄取速率以及将其与实施例6中测量的甲醇蒸发速率进行比较。
[0491]
a)预培养：在反应器接种前24小时，将含有100μg/l诺尔丝菌素的50ml ypd用巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt接种。在接种反应器前3小时，将预培养物用含有100μg/l诺尔丝菌素的另外50ml ypd稀释。接种前，将适量的培养物离心(1500g，5min，20℃)并且以42的od
600
重新悬浮在15ml bsm培养基中。b)将填充有300ml bsm培养基的反应器用15ml巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt培养物接种。反应器中的目标接种od
600
是2。在由溶解氧尖峰指示的分批阶段结束时，以2.4ml/h开始50％(w/w)葡萄糖进料持续24小时以增加生物质。葡萄糖进料开始后两小时，给予9.5ml 50％(v/v)甲醇注射以使甲醇浓度增加至1.5％(测量浓度为r1＝1.47％并且r2＝1.48％)。这样做是为了诱导甲醇消耗。在葡萄糖进料阶段结束时，取用于细胞干重和hplc的样品。
[0492]
c)在葡萄糖阶段之后，将搅动和通气设定为恒定的750rpm和9.5sl/h。添加另外的50％甲醇脉冲以将浓度增加到1.5％，并且立即取样品(测量浓度为r1＝1.36％并且r2＝1.36％)。在19.5小时后再次测量浓度并且用于确定比甲醇摄取速率(q
甲醇
)。
[0493]
d)与针对表8实施例6e)中的蒸发速率获得的范围为0.022至0.063g l-1
h-1
的值相比，此实验的甲醇浓度降低(dc/dt)显著更高，平均为0.37g l-1
h-1
。
[0494]
如下基于表9中所示的数据计算比甲醇摄取速率。
[0495][0496]
在测量的时间段内体积是恒定的。不减去蒸发的平均比甲醇摄取速率(q
甲醇
)为5.07mg g-1
h-1
。对于减去蒸发的比甲醇摄取速率的计算，基于表8实施例6e)中的结果估计蒸发速率为22mg l-1
h-1
。这种结局是全新且出乎意料的。迄今为止，已公开的文献中报道且接受的是mut-不能代谢甲醇，并且甲醇的减少是由于蒸发损失(looser等人,2015)。
[0497]
表9：比甲醇摄取速率(q
甲醇
)和表观甲醇损失(dc/dt)的数据概述
[0498][0499]
实施例8：培养策略1-向巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2应用恒定的葡萄糖/甲醇共进料
[0500]
在重组蛋白生产场景中培养巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt菌株。向菌株进料恒定的限制的葡萄糖进料，并且用甲醇诱导蛋白质生产。
[0501]
a)如实施例7a)b)中所述进行接种。培养分为两个阶段。(1)第一阶段：分批以在bsm培养基中2的od
600
开始。由反应器r1在22.27h和反应器r2在21.52h的溶解氧尖峰指示分批阶段结束。
[0502]
b)(2)第二阶段：在第一阶段后以2.4ml/h的进料速率开始用50％(w/w)葡萄糖进料的补料分批阶段，持续97小时。同时添加50％(v/v)甲醇脉冲，目的是使甲醇浓度增加到1.5％(v/v)。如实施例6d)中所述取hplc样品以测量确切浓度，并且如有必要，添加另外的脉冲。应用基于预测的生物质浓度和如实施例7d)中测量的比甲醇摄取速率5mg g-1
h-1
计算的甲醇进料。每天通过hplc在线测量甲醇浓度。
[0503]
c)以小时间隔如下计算甲醇进料：
[0504]r甲醇
＝q
甲醇
*x
预测
*t
间隔
[0505][0506]a甲醇
＝v
反应器
*c
甲醇，目标-t
甲醇
[0507][0508]v反应器
＝v
反应器-前一间隔
+f
葡萄糖
+f
甲醇
[0509][0510]q甲醇
＝比甲醇摄取速率(mg g-1
h-1
)
[0511]
x
预测
＝以细胞干重计的预测总生物量(g)
[0512]
t
间隔
＝时间间隔(h)
[0513]r甲醇
＝在t
间隔
时的甲醇消耗(mg)
[0514]
t
甲醇
＝总甲醇(mg)
[0515]a甲醇
＝甲醇添加(mg)
[0516]f甲醇
＝50％(v/v)甲醇进料(ml)
[0517]c甲醇目标
＝目标甲醇浓度(mg/ml)
[0518]v反应器
＝反应器体积(ml)
[0519]f葡萄糖
＝50％(v/v)葡萄糖进料(ml)
[0520]v样品
＝如果适用于区间则为样品体积，否则其为0
[0521][0522]
d)由于基于实施例7d)的预测比甲醇摄取速率，可以在生物反应器培养期间将甲醇浓度保持过量，1.19％至1.5％(v/v)的甲醇，并且仅每天一次进行在线甲醇浓度测量和进料调节。
[0523]
e)过程和生产率数据可以在表10中找到。总体平均比生产率为29.4μg g-1
h-1
。对于反应器r1和r2，在培养结束时的甲醇浓度为10.4和10.0g/l(1％(v/v)甲醇对应于7.92g/l)。反应器r1和r2在第二阶段消耗的甲醇总量为25.03g和24.07g。这通过以下方程计算：
[0524][0525]
t
消耗的甲醇
＝总消耗的甲醇(g)
[0526]m开始
＝在阶段开始时的50％甲醇容器重量(g)
[0527]m结束
＝在进料结束时的50％甲醇容器重量(g)
[0528]
ρ
50％甲醇
＝50％甲醇密度(g/ml)
[0529]
ρ
甲醇
＝100％甲醇密度(g/ml)
[0530]c甲醇
–
结束
＝在进料结束时的甲醇浓度(g/l)
[0531]v反应器
–
结束
＝在进料结束时的反应器体积(l)
[0532]
表10：实施例8的生物反应器培养过程数据和比生产率(q
p
)。在取样品后2.22小时通过另外的50％(v/v)甲醇脉冲调节甲醇浓度，r1＝5.6ml，r2＝2.3ml。
[0533][0534]
*代表甲醇脉冲后的对照样品。
[0535]
实施例9：培养策略2-具有分开的葡萄糖进料阶段和仅甲醇进料阶段的进料策略。
[0536]
在重组蛋白生产场景中测试巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt菌株，其中首先应用限制的葡萄糖进料以增加生物质，然后是分开的阶段，其
用甲醇脉冲和进料以诱导蛋白质生产。
[0537]
a)生物反应器培养分为三个阶段。(1)第一阶段由以2的起始od
600
在bsm培养基上的分批阶段组成。如实施例7a)b)中所述进行接种。分批阶段对于反应器r3和r4分别持续19.68和19.50小时。(2)第二阶段是50％(w/w)葡萄糖进料，以4.8ml/h持续25小时以增加生物质浓度。(3)第三阶段开始于50％(v/v)甲醇脉冲以达到1.5％(v/v)的目标浓度，并且基于预测的细胞干重和如实施例8c)中所述的比甲醇摄取速率计算对于72.7小时的甲醇进料谱。如实施例6d)中所述每天用hplc在线测量甲醇浓度以测量确切浓度，并且如有必要，添加另外的补偿脉冲。在此阶段，将反应器搅拌器速度设定为恒定的760rpm并且将通气设定为9.5sl/h。
[0538]
b)过程和生产率数据可以在表11中找到。整个培养过程中的最大和最小甲醇浓度范围为4.3g/l至12.55g/l。总体平均比生产率为32.9μg g-1
h-1
。对于反应器r3和r4，在培养结束时的甲醇浓度为7.10和7.47g/l。由反应器r3和r4在第三阶段消耗的甲醇量为12.0g和12.6g。这是如实施例8e)中那样计算的。因为在第三阶段的生物质是恒定的，所以第三阶段的甲醇摄取速率(q
甲醇
)如以下方程中计算。
[0539][0540]
t
消耗的甲醇
＝第3阶段中总消耗的甲醇(mg)
[0541]
x
生物质-平均
＝第3阶段中的平均生物质(g)
[0542]
t
第3阶段
＝第3阶段的持续时间(h)
[0543]
在第三阶段，反应器r3的q
甲醇
是3.79mg g-1
h-1
，并且对于反应器r4，其为3.92mg g-1
h-1
。
[0544]
c)表11中的总生物质是针对12ml的样品提取经校正的，并且显示生物质没有增加。总体而言，第三阶段的总生物质对于反应器r3和r4降低了4.5％和3.4％。令人震惊的是，培养物却产生分泌的重组蛋白。这显示了巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt菌株即使在仅用甲醇进料时也可以高效地产生重组分泌蛋白，而没有明显生长。在以甲醇作为唯一碳源的第三阶段中产生的蛋白质的平均总量为105mg。
[0545]
t
生物质
＝v
反应器
*cdw+∑(cdw
前一个
*v
样品
)
[0546]
t
生物质
＝总的校正的生物质
[0547]
cdw＝细胞干重
[0548]v样品
＝样品体积
[0549]
表11：实施例9的生物反应器培养过程数据和生产率(q
p
)。如实施例9b)中那样针对12ml采样校正总生物质。
[0550][0551][0552]
*代表甲醇脉冲后的对照样品。
[0553]
实施例10：培养策略3-具有葡萄糖/甲醇共进料阶段和分开的仅甲醇进料阶段的进料策略。
[0554]
在重组蛋白生产场景中测试巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt菌株，其中在分批阶段后，应用限制的葡萄糖进料和另外的甲醇脉冲和进料，以同时实现生物质增加和重组蛋白生产。在达到所希望的生物质后，停止葡萄糖进料，但在剩余的培养过程中继续甲醇进料。
[0555]
a)此生物反应器培养分为三个阶段。(1)第一阶段是分批阶段。为此，将反应器用生产菌株巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt接种，起始od
600
为2。如实施例7a)b)中所述进行接种。分批阶段对于反应器r1和r2分别持续19.35和19.37小时。由溶解氧峰指示分批阶段的结束。(2)此时，第二阶段开始。第二阶段由50％(w/w)葡萄糖进料组成，以4.8ml/h持续25小时。在第二阶段开始时，应用50％(v/v)甲醇脉冲以使甲醇浓度增加至1.5％(v/v)的目标，并且开始随后的甲醇进料以抵消甲醇消耗、蒸发和被葡萄糖进料的稀释。(3)第三阶段由仅甲醇进料组成，持续72.9小时。在此阶段，将反应器搅拌器速度设定为恒定的760rpm并且将通气设定为9.5sl/h。如实施例6d)中所述，每天用hplc在线测量甲醇浓度。如有必要，添加另外的补偿脉冲。
[0556]
b)如实施例9b)中以每小时间隔计算甲醇进料：
[0557]
c)过程和生产率数据可以在表12中找到。两个重复的整个培养过程中的最大和最小甲醇浓度范围为6.9g/l至11.4g/l。总体平均比生产率为45.8μg g-1
h-1
，第三阶段的总体比生产率为34.0μg g-1
h-1
。对于反应器r1和r2，在培养结束时的甲醇浓度为8.0g/l。由反应
器r1和r2在第三阶段消耗的甲醇量为14.4g和14.1g。这是通过如实施例9b)中所示的方程计算的。因为在第三阶段的生物质是恒定的，所以如实施例9b)中所示计算第三阶段的甲醇摄取速率(q
甲醇
)。在第三阶段，反应器r1的q
甲醇
是4.61mg g-1
h-1
，并且对于反应器r2，其为4.54mg g-1
h-1
。总体而言，在第三阶段，生物质对于反应器r1和r2降低了5.7％和5.5％。这再次显示，没有明显生长的巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株生产是可能的。在以甲醇作为唯一碳源的第三阶段中产生的重组蛋白的平均总量为106mg，这与在实施例9第三阶段中生产的105mg重组蛋白相似。这也通过实施例9的32.9μg g-1
h-1
与本实施例中的34.0μg g-1
h-1
的在第三阶段中的相似比生产率得以说明。总之，第三阶段(仅甲醇进料阶段)的生产率不取决于培养物是否在第二阶段(葡萄糖进料阶段)中被诱导。由于重组蛋白生产与生长无关，因此仅甲醇进料策略在使用巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株时具有若干个优点。在如实施例8中没有仅甲醇进料阶段的生物反应器培养中，所述过程受到最大反应器体积和酵母干质量浓度约束。在一定时间后，通过达到最大体积或最大所希望的生物质浓度，这种约束使培养过程停止。通过如实施例9中使用甲醇进料阶段与巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2的组合，培养时间不再受生物质浓度或体积的限制，因为生物质没有增加，并且体积增加可忽略不计。因此，高生物质浓度的培养物可以在生物反应器中保持更长的时间段而不达到这些约束，并且允许更长的生产阶段，这会增加目的蛋白的浓度。当使用如以下实施例12所示甲醇利用慢型巴斯德毕赤酵母δaox1菌株时也应用仅甲醇进料阶段，但这些优点不存在，因为巴斯德毕赤酵母δaox1在仅甲醇进料上连续生长并且因此展现出如讨论的相同约束。将巴斯德毕赤酵母δaox1限制于与巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2相同的甲醇进料速率导致生产率损失。巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株的进一步过程相关改善在实施例12中讨论。
[0558]
表12：实施例10的生物反应器培养过程数据和比生产率(q
p
)。如实施例9b)中那样针对12ml采样校正总生物质。
[0559]
[0560][0561]
*代表甲醇脉冲后的对照样品。
[0562]
实施例11：培养策略3-应用于分泌vhh的巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2的具有葡萄糖/甲醇共进料阶段和分开的仅甲醇进料阶段的进料策略。
[0563]
为了用另一种分泌蛋白检查分泌重组蛋白的产生，用菌株巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pz30_paox1_αmf-vhh_cyctt重复实施例10a)中所述的生物反应器培养。
[0564]
a)如在实施例10a)中，此生物反应器培养分为三个阶段。(1)第一阶段是分批阶段。为此，将反应器用生产菌株巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pz30_paox1_αmf-vhh_cyctt接种，起始od
600
为2，如实施例7a)b)中所述。分批阶段对于反应器r1和r2分别持续18.79和19.33小时。由溶解氧峰指示分批阶段的结束。(2)此时，第二阶段开始。第二阶段由50％(w/w)葡萄糖进料组成，以4.8ml/h持续33.9小时以增加生物质，所述生物质甚至比实施例10中更高。在第二阶段开始时，添加50％(v/v)甲醇脉冲以使甲醇浓度增加至1.5％(v/v)的目标值，并且开始随后的甲醇进料以抵消甲醇消耗、蒸发和被葡萄糖进料的稀释。(3)第三阶段由仅甲醇进料组成，持续63.9小时。将搅拌器速度设定为恒定的760rpm并且将通气设定为9.5sl/h。如实施例6d)中所述，每天用hplc在线测量甲醇浓度。如有必要，添加另外的补偿脉冲。
[0565]
b)如实施例9b)中所述计算甲醇进料：
[0566]
过程和生产率数据可以在表13中找到。两个重复的整个培养过程中的最大和最小甲醇浓度范围为8.7g/l(r1)至11.3g/l(r1)。总体平均比生产率为118.0μg g-1
h-1
并且在第三阶段为88.2μg g-1
h-1
。对于反应器r1和r2，在培养结束时的甲醇浓度为10.5和10.8g/l。由反应器r1和r2消耗的甲醇量为26.6g和26.0g。这是通过如实施例8e)中所示的以下方程计算的。此量由于更高的生物质浓度而高于实施例10，但仍显著(5倍)低于muts菌株(如实施例12中所述)。因为在第三阶段的生物质是恒定的，所以如实施例9b)中所示计算第三阶段的甲醇摄取速率(q
甲醇
)。在第三阶段，反应器r1的q
甲醇
是4.75mg g-1
h-1
，并且对于反应器r2，其为4.68mg g-1
h-1
。
[0567]
c)总体而言，如先前实施例中，在第三阶段，生物质对于反应器r1和r2降低了4.4％和4.9％。表13中的数据清楚地显示，巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株可以甚至以克/升计的量产生分泌重组蛋白。在仅甲醇进料阶段中，vhh浓度增加了815.5mg/l，这意味着使用甲醇作为唯一碳源产生平均总共323.1mg的抗体片段。
[0568]
表13：实施例11的生物反应器培养过程数据和生产率(qp)。如实施例9b)中那样针对12ml采样校正总生物质。
[0569][0570]
*代表甲醇脉冲后的对照样品。
[0571]
实施例11.1：与用已建立的生物反应器培养方案培养的甲醇利用慢型巴斯德毕赤酵母δaox1(muts)相比，用巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2(mut-)菌株获得的过程参数。
[0572]
为了比较，将巴斯德毕赤酵母δaox1 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt用已建立的用于muts表型的培养方案来培养(potvin,ahmad和zhang,2012)。
[0573]
a)此生物反应器培养分为四个阶段。(1)第一阶段是分批阶段。为此，将反应器用生产菌株巴斯德毕赤酵母δaox1 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt接种，起始od
600
为2，如实施例7a)b)中所述。分批阶段对于反应器r1和r2分别持续20.17和20.30小时。由溶解氧峰指示分批阶段的结束。(2)第二阶段是线性增加的(y＝0.225x+1.95)60％甘油进料，持续8小时。(3)第三阶段是具有线性增加的(y＝3.75-0.111x)60％甘油进料与线性增加的(y＝0.028x+0.6)100％甲醇进料的共进料阶段，持续18小时。(4)第四阶段是具有线性增加的100％甲醇进料(y＝0.028x+1.10)的仅甲醇进料阶段，持续72小时。总运行时间为119.25小时。
[0574]
b)通过dasgip控制软件(艾本德股份公司，德国)基于a)中的方程以重量分析的方式控制甘油和甲醇进料。
[0575]
c)过程和生产率数据可以在表13.1中找到。从第三阶段到第四阶段(生产阶段)的总体平均比生产率是61.7μg g-1
h-1
。消耗的甲醇的甲醇总量在整个培养期为165.8g并且在第四阶段(仅甲醇进料阶段)为150.6g。培养肉汤中的残余甲醇浓度被认为是零，因为这是甲醇限制培养。本实施例中的第四阶段对应于实施例9、10和11中的第三阶段。基于第四阶段中的平均生物质，计算如实施例9b)中所示的甲醇摄取速率(q
甲醇
)。第四阶段的q
甲醇
对于反应器r1为37.1mg g-1
h-1
并且对于反应器r2为37.6mg g-1
h-1
。第四阶段的q
甲醇
促进了不需要的生物质增加。在培养结束时总生物质的53.2％(r1)和52.4％(r2)是在甲醇上的第四阶段生长期间产生的。
[0576]
d)表13.2的表中描绘了菌株相关过程参数的比较，并且来自所呈现的实施例的比甲醇摄取速率和进料速率的概述可以在表13.3中找到。通过使用巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 mut-进行重组蛋白生产，若干个关键过程参数与用巴斯德毕赤酵母δaox1的过程相比得到相当大改善。反应热显著降低了大于80％，导致对冷却的需求减少。比氧气摄取速率和氧气转移率减少了大于80％，导致对混合和曝气的需求减少，降低了曝气的流速以及向生物反应器容器供应纯氧气的需要。较低的比甲醇摄取速率减少培养所需的甲醇量。甲醇有毒且易燃。
[0577]
mut-菌株的使用代表了技术和安全性的改善，因为它降低了需要处理和储存在生产设施中的甲醇的量。另一个优点是巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2对高浓度甲醇的敏感性较低。这通过实施例10中的菌株巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2和本实施例中的巴斯德毕赤酵母δaox1的细胞活力数据得到证实。在实施例10中，在过程结束时反应器r1和r2中mut-细胞的活力为99.8％和99.7％。相比之下，本实施例中反应器r1和r2中muts细胞的细胞活力为95.9％和96.5％。巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株的较低敏感性和较高活力对重组产生的分泌蛋白的纯度具有影响。裂解的细胞会释放降解目的蛋白的蛋白酶并且在上清液中添加不需要的可溶性蛋白，这两种作用都导致上清液中目的蛋白的纯度较低和损失。本实施例中巴斯德毕赤酵母δaox1的纯度对于反应器r1和r2为72％和77％，相比之下，实施例10中巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2的纯度对于反应器r1和r2而言均为85％。
[0578]
表13.1：实施例11.1的生物反应器培养过程数据和比生产率(q
产物
)。
[0579][0580][0581]
表13.2：实施例10中巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt和实施例11.1中巴斯德毕赤酵母δaox1 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt的总体关键生物反应器培养参数和仅甲醇进料阶段的关键生物反应器培养参数的比较。
[0582][0583]
表13.3：在仅甲醇进料阶段中基于平均细胞干重的比甲醇摄取速率和甲醇进料速率。*由于实施例11.1具有限制的甲醇进料，因此q
甲醇
和进料速率被认为是相等的。
[0584][0585]
实施例12：甲醇利用负型和醇脱氢酶缺陷型菌株的产生。
[0586]
在实施例7中观察到的巴斯德毕赤酵母mut-菌株的甲醇消耗是出乎意料且新的。基于此知识，形成了醇脱氢酶可能负责这种特征的假说。为了测试在巴斯德毕赤酵母δ
aox1δaox2中醇脱氢酶对甲醇消耗的影响，选择两种潜在的醇脱氢酶adh2：pp7435_chr2-0821和adh900：pp7435_chr2-0990，用于缺失。通过将基因的编码区与抗生素抗性交换，产生三种菌株：(1)adh2缺陷型菌株，(2)adh900缺陷型菌株，和(3)双缺失adh2和adh900菌株。有效地产生菌株(1)巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr，(2)巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh900δ::kanmx，和(3)巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr adh900δ::kanmx。
[0587]
a)使巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2处于电感受态，如实施例1a)中所述。为了产生adh2缺失，使用实施例1b)中所述的分割标记方法。将电感受态细胞用500ng adh2分割标记盒1和500ng adh2分割标记盒2转化，如实施例1d)所述。盒序列可以在表14中找到。在具有200μg/ml潮霉素的ypd板上选择转化体。基于pcr扩增和pcr扩增子的测序选择一个克隆。通过用引物adh2_ko_ctrl_fwd和adh2_ko_ctrl_rev(表15)进行pcr扩增并且测序pcr扩增子(microsynth ag，瑞士)来验证adh2编码区被抗生素标记成功取代。产生的菌株被称为(1)巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr。
[0588]
b)使巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株处于电感受态，如实施例1a)中所述。将电感受态细胞用500ng adh900分割标记盒1和500ng adh900分割标记盒2转化，如实施例1d)所述。盒序列可以在表14中找到。在具有500μg/ml遗传霉素的ypd板上选择转化体。基于pcr扩增和pcr扩增子的测序选择一个克隆。通过用引物adhii_ko_ctrl_fwd和adhii_ko_ctrl_rev(表15)进行pcr扩增并且测序pcr扩增子(microsynth ag，瑞士)来验证adh900编码区被抗生素标记成功取代。产生的菌株被称为(2)巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh900δ::kanmx。
[0589]
c)使巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr菌株处于电感受态，如实施例1a)所述，除了将200μg/ml潮霉素添加到主要培养基中。将电感受态细胞用500ng adh900分割标记盒1和500ng adh900分割标记盒2转化，如实施例1d)所述。盒序列可以在表14中找到。在具有200μg/ml潮霉素和500μg/ml遗传霉素的ypd板上选择转化体。基于pcr扩增和pcr扩增子的测序选择一个克隆。通过用引物adhii_ko_ctrl_fwd和adhii_ko_ctrl_rev(表15)进行pcr扩增并且测序pcr扩增子(microsynth ag，瑞士)来验证adh900编码区被抗生素标记成功取代。产生的菌株被称为(3)巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr adh900δ::kanmx。
[0590]
d)用基因组dna纯化试剂盒(普洛麦格公司，美国)按照制造商的推荐分离出用于pcr扩增的基因组dna。用q5聚合酶(新英格兰生物实验室公司，美国)按照制造商的推荐完成pcr扩增反应。
[0591]
表14：用于产生adh2和adh900缺失菌株的分割标记盒dna序列。
[0592]
[0593]
[0594]
[0595][0596]
表15：聚合酶链式反应引物。
[0597]
引物名称dna序列5’至3’adh2_ko_ctrl_fwdgaattgagccaaaaaaggagagg(seq id no:76)adh2_ko_ctrl_revgatggaataggagactaggtgtg(seq id no:77)adhii_ko_ctrl_fwdtggttgagacgtttgtattg(seq id no:78)adhii_ko_ctrl_revtgggttgggagtttagtg(seq id no:79)
[0598]
实施例13：adh2和adh900过表达甲醇利用负型菌株的产生。
[0599]
为了检查adh2和adh900过表达的效果的目的。产生表达构建体，其由组成型启动子p
gap
:pp7425_chr1(596296
…
596790)和分别为adh2编码序列或adh900编码序列构成。adh2和adh900编码序列(表16)经修饰以消除编码序列中的bbsi和bsai限制性位点，而不影
响基因产物的氨基酸序列。产生的菌株被定名为巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2bb3az_pgap_adh2_cyctt和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pgap_adh900_cyctt。
[0600]
a)为了使用golden gate组装方法的目的，限制性酶bbsi和bsai(新英格兰生物实验室公司，美国)的限制性位点需要从编码序列中去除，而不影响基因产物的氨基酸序列。此过程称为消除化(curing)。在c.45g》a和c.660c》g处修饰adh2 pp7435_chr2-0821的编码序列。在c.42c》g处修饰adh900 pp7435_chr2-0990的编码序列。用于golden gate组装的经消除化的序列可以在表15中找到。注意，前12个碱基对和最后15个碱基对不是编码序列的一部分，而是golden gate组装所需的。
[0601]
b)如此处使用的golden gate组件已被描述(prielhofer等人,2017)。(1)如下组装表达构建体bb3az_pgap_adh2_cyctt。将adh2_gg_消除化的dna片段(表15)克隆到bb1_23骨架中，产生bb1_23_adh2。通过bb3az_14*(骨架)、bb1_23_adh2(编码序列)、bb1_12_pgap(启动子)、bb1_34_sccyc1tt(终止子)的golden gate组装产生表达构建体。(2)如下组装表达构建体bb3az_pgap_adh900_cyctt。将adh900_gg_消除化的dna片段(表15)克隆到bb1_23骨架中，产生bb1_23_adh900。通过bb3az_14*(骨架)、bb1_23_adh900(编码序列)、bb1_12_pgap(启动子)、bb1_34_sccyc1tt(终止子)的golden gate组装产生表达构建体。质粒和序列可在golden pics试剂盒#1000000133(addgene公司，美国)中获得。
[0602]
表16：adh2和adh900天然编码序列以及具有c.45g》a和c.660c》g突变的adh2消除化的编码序列和具有c.42c》g突变的adh900消除化的编码序列，其用于golden gate组装。前12个碱基对和最后15个碱基对不是编码序列的一部分，并且用于golden gate组装。
[0603]
[0604]
[0605][0606]
c)使巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株处于电感受态，如实施例1a)中所述。将bb3az_pgap_adh2_cyctt表达构建体和bb3az_pgap_adh900_cyctt表达构建体用asci(新英格兰生物实验室公司，美国)按照制造商的方案进行线性化并且用higel/pcr dna片段提取试剂盒(s
ü
d-laborbedarf gmbh，德国)纯化。将500ng线性化质粒转化到电感受态巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2中，如前面实施例1a)和1d)中所述。在具有25μg/ml博莱霉素的
ypd板上选择阳性转化体。通过用引物109_bb3an_ctrl_fwd和pgap_goi_rev_v2(表17)以基因组dna作为模板的pcr扩增来验证表达构建体的成功整合。产生的菌株被称为巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pgap_adh2_cyctt和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pgap_adh900_cyctt。
[0607]
d)用基因组dna纯化试剂盒(普洛麦格公司，美国)按照制造商的推荐分离出用于pcr扩增的基因组dna。用q5聚合酶(新英格兰生物实验室公司，美国)按照制造商的推荐完成pcr扩增反应。
[0608]
表17：聚合酶链式反应引物。
[0609]
引物名称dna序列5’至3’109_bb3an_ctrl_fwdttgatcttttctacggggtgg(seq id no:84)pgap_goi_rev_v2ggtgttttgaagtggtacgg(seq id no:85)
[0610]
实施例14：甲醇利用负型醇脱氢酶缺陷型菌株的无细胞提取物中醇脱氢酶活性的测量。
[0611]
为了在表型水平上检查醇脱氢酶的成功缺失，测量以乙醇作为底物的无细胞提取物中的醇脱氢酶活性。乙醇通常被认为是adh2的主要底物。
[0612]
a)在通过空气渗透膜密封的24孔板中的2ml ypd培养基中在25℃和280rpm下进行过夜培养。使用的菌株来自实施例12a)巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr、实施例12b)巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr adh900δ::kanmx和实施例1e)巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2。作为另外的对照，使用巴斯德毕赤酵母x33(赛默飞世尔科技公司，美国)和巴斯德毕赤酵母x33δadh2(nocon等人,2014)。
[0613]
b)通过将过夜培养物离心(16.000g，5min，4℃)并且将其重新悬浮在1ml磷酸盐缓冲盐水中来制备无细胞提取物。在第二离心步骤(16.000g，5min，4℃)后，将细胞重新悬浮在0.5ml细胞裂解缓冲液中，并且进行玻璃搅打(beat)。在核糖裂解仪(mpbiomedicals,inc.，美国)中通过以6m/s进行珠搅打3x 20秒并且在步骤之间在冰上冷却1分钟，将培养物裂解。裂解步骤后，将培养物离心(16.000g，5min，4℃)，并且将上清液转移到新鲜的eppendorf管中并且再次离心(16.000g，30min，4℃)以去除任何携带的细胞碎片。在第二离心步骤后，将上清液储存在-20℃直至使用。
[0614]
c)每50ml细胞裂解缓冲液由20mm hepes、420mm nacl、1.5mm mgcl2、10％甘油、1sigmafast
tm
蛋白酶抑制剂混合片剂(西格玛奥德里奇有限责任公司)组成。测定缓冲液由100mm mops、5mm mgso4、2mm nad
+
ph 8.9组成。
[0615]
d)通过pierce
tm
bca蛋白质测定(赛默科技公司，美国)按照制造商的推荐测量无细胞提取物的蛋白质浓度，并且对于所有样品统一调节至3.8mg/ml的共同浓度。
[0616]
e)在96孔板中进行醇脱氢酶活性测定。在酶标仪(tecan集团股份有限公司，瑞士)中通过在340nm处测量nadh的吸光度来进行测量。将温度设定在42℃。为了开始测定，将20μl无细胞提取物添加到测定缓冲液中并且平衡10至15分钟，然后添加1m乙醇作为底物。总最终体积为300μl。从添加底物乙醇后的最大线性吸收增加计算以mu/mg计的活性。一个活性单位对应于1μmol消耗的底物(nad
+
)/分钟。这是使用朗伯-比尔定律(lambert-beer law)和系数ε
nadh
＝6220m-1
cm-1
由吸收数据计算的。
[0617]
f)结果清楚地显示出ahd基因缺失对无细胞提取物的醇脱氢酶活性的影响(表
18)。通过缺失adh2基因，实现94％的活性降低。这另外通过巴斯德毕赤酵母x33菌株得到证实。通过还缺失第二醇脱氢酶基因adh900，观察到组合活性降低99％。
[0618]
表18：在作为底物的乙醇上无细胞提取物的醇脱氢酶活性。
[0619][0620]
实施例15：甲醇利用负型和醇脱氢酶缺陷型菌株的甲醇摄取速率的测量。
[0621]
为了确定甲醇摄取速率，在生物反应器中培养mut-和醇脱氢酶缺陷型菌株。测试的菌株是巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr、巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh900δ::kanmx和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr adh900δ::kanmx。使培养物生长直到一定的生物质浓度。然后应用甲醇脉冲并且在脉冲后立即和大约20小时后测量甲醇浓度。实验设置已在实施例7中详细描述。目标是确定醇脱氢酶缺陷型菌株的比甲醇摄取速率以及将其与实施例7中测量的甲醇摄取速率进行比较。
[0622]
a)将填充有300ml bsm培养基的反应器用15ml巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr(反应器ar2和ar4)和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh900δ::kanmx(反应器ar1和ar3)接种。目标起始od
600
是2。在由溶解氧尖峰指示的分批阶段结束时，以2.8ml/h开始50％(w/w)葡萄糖进料持续24小时以增加生物质。葡萄糖进料开始后两小时，给予50％(v/v)甲醇注射以使甲醇浓度增加至1.5％(测量浓度为ar1＝1.64％、ar2＝1.66％、ar3＝1.59％并且ar4＝1.67％)。这样做是为了诱导甲醇消耗。在葡萄糖进料阶段结束时，取用于细胞干重和hplc的样品。
[0623]
b)在葡萄糖进料阶段之后，将搅动和通气设定为恒定的750rpm和9.5sl/h。添加另外的50％甲醇脉冲以使浓度增加至1.5％，并且立即取hplc样品(测量浓度为ar1＝1.36％、ar2＝1.44％、ar3＝1.34％并且ar4＝1.45％)。在18.4小时后再次测量浓度并且用于确定比甲醇摄取速率(q
甲醇
)。
[0624]
c)开始单独的生物反应器培养以测量双adh缺失菌株巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr adh900δ::kanmx的摄取速率。如本实施例和实施例7中所解释进行培养。将巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 adh2δ::hphr adh900δ::kanmx接种到反应器cr3和cr4中。目标起始od
600
是2。在由溶解氧尖峰指示的分批阶段结束时，以2.4ml/h开始50％(w/w)葡萄糖进料持续24小时以增加生物质。葡萄糖进料开始后两小时，给予50％(v/v)甲醇注射以使甲醇浓度增加至1.5％(测量浓度为cr3＝1.50％并且cr4＝1.47％)。这样做是为了诱导甲醇消耗。在葡萄糖进料阶段结束时，取用于细胞干重和hplc的样品。
[0625]
d)在葡萄糖进料阶段之后，将搅动和通气设定为恒定的750rpm和9.5sl/h。添加另
外的50％甲醇脉冲以使浓度增加至1.5％，并且立即取hplc样品(测量浓度为cr3＝1.37％并且cr4＝1.49％)。在19.5小时后再次测量浓度并且用于确定比甲醇摄取速率(q
甲醇
)。
[0626]
e)如实施例7d)中计算比甲醇摄取速率。通过缺失adh2，实现了甲醇摄取速率的令人惊讶且显著的降低(表19)。甲醇的dc/dt对于ar2和ar4为0.07至0.06g l-1
h-1
，这仅略高于在实施例6中观察到的蒸发。相比之下，adh900缺失菌株的甲醇摄取速率没有减少，并且实际上略高于实施例7中巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2的测量摄取速率。这种差异可能归因于实施例7与本实施例之间的条件略有不同，差异是在甲醇脉冲后反应器体积和甲醇浓度略高。与adh2缺失菌株的已经低的摄取速率相比，双adh缺失菌株没有显示出可观察到的甲醇摄取速率减少。这些结果出乎意料地证实了adh2基因及其产物酶adh2在最大程度上负责对于巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2观察到的特征，并且在实施例7中的观察结果不是自发甲醇氧化或任何其他酶的混杂活性的结果。
[0627]
因此，得出结论，对于巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2中的甲醇摄取的主要负责基因和酶是adh2基因及其产物酶adh2。
[0628]
表19：adh缺失菌株的比甲醇摄取速率(q
甲醇
)和表观甲醇损失(dc/dt)的概述。*在19.5h时测量甲醇浓度。
[0629][0630][0631]
实施例16：甲醇利用负型和醇脱氢酶过表达菌株的甲醇摄取速率的测量。
[0632]
为了证实adh2是负责巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2中甲醇消耗的酶并且为了研究是否有可能用adh2或adh900基因的过表达增加甲醇摄取速率，在生物反应器培养中测量巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pgap_adh2_cyctt和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2bb3az_pgap_adh900_cyctt菌株的比甲醇摄取速率。如实施例7和15中所述进行实验。
[0633]
a)将填充有300ml bsm培养基的反应器用15ml巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2bb3az_pgap_adh2_cyctt(反应器r1和r3)和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2bb3az_
pgap_adh900_cyctt(r2和r4)接种。目标起始od
600
是2。在由溶解氧尖峰指示的分批阶段结束时，以2.8ml/h开始50％(w/w)葡萄糖进料持续24小时以增加生物质。葡萄糖进料开始后两小时，给予50％(v/v)甲醇注射以使甲醇浓度增加至1.5％(测量浓度为r1＝1.56％、r2＝1.53％、r3＝1.52％并且r4＝1.54％)。这样做是为了诱导甲醇消耗。在葡萄糖进料阶段结束时，取用于细胞干重和hplc的样品。
[0634]
b)在葡萄糖进料阶段之后，将搅动和通气设定为恒定的750rpm和9.5sl/h。添加另外的50％甲醇脉冲以使浓度增加至1.5％，并且立即取hplc样品(测量浓度为r1＝1.30％、r2＝1.30％、r3＝1.35％并且r4＝1.30％)。在4.1、20.1小时后再次测量浓度并且用于确定比甲醇摄取速率(q
甲醇
)。
[0635]
c)选择在4.1小时的另外采样时间点，因为预期有更高的甲醇摄取速率。在4.1小时的平均甲醇摄取速率对于adh2过表达菌株巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pgap_adh2_cyctt为7.72mg g-1
h-1
并且对于adh900过表达菌株巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pgap_adh900_cyctt为5.61mg g-1
h-1
。20.1小时后，平均摄取速率对于adh2过表达菌株降低至6.35mg g-1
h-1
并且对于adh900过表达菌株降低至5.16mg g-1
h-1
(表20)。如前面在实施例15e)中讨论的，在缺失adh900基因时可以观察到与亲本巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2没有显著差异，并且在过表达adh900基因时也是如此。另一方面，与adh900过表达菌株相比，adh2过表达菌株具有在4.1和21.7小时高37％和23％的摄取速率。进一步强调了出乎意料的发现，即adh2是负责甲醇消耗的酶，并且有可能在adh2基因过表达的情况下增加甲醇消耗。
[0636]
表20：adh过表达菌株的比甲醇摄取速率(q
甲醇
)和表观甲醇损失(dc/dt)的概述。
[0637][0638]
实施例17：具有用于adh2过表达的甲醇诱导型启动子的菌株的产生。
[0639]
为了研究甲醇诱导型adh2过表达的影响的目的，产生两个过表达构建体，其由控制adh2编码序列的表达的甲醇诱导型启动子p
aox1 pp7435_chr4(237941
…
238898)和p
fld1
pp7435_chr3(262922
…
263518)构成。adh2编码序列经修饰以消除编码序列中的bbsi和bsai限制性位点，而不影响基因产物的氨基酸序列(表16)。产生的菌株被定名为巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_paox1_adh2_cyctt和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2bb3az_pfld1_adh2_cyctt。
[0640]
a)使用如已经描述的golden gate组件产生表达构建体(prielhofer等人,2017)。
(1)如下组装表达构建体bb3az_paox1_adh2_cyctt。将adh2_gg_消除化的dna片段(表16)克隆到bb1_23骨架中，产生bb1_23_adh2。通过bb3az_14*(骨架)、bb1_23_adh2(编码序列)、bb1_12_paox1(启动子)、bb1_34_sccyc1tt(终止子)的golden gate组装产生表达构建体。(2)通过bb3az_14*(骨架)、bb1_23_adh2(编码序列)、bb1_12_pfld1(启动子)、bb1_34_sccyc1tt(终止子)的golden gate组装产生表达构建体bb3az_pfld1_adh2_cyctt。质粒和序列可在golden pics试剂盒#1000000133(addgene公司，美国)中获得。
[0641]
b)使巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株处于电感受态，如实施例1a)中所述。将bb3az_paox1_adh2_cyctt表达构建体和bb3az_pfld1_adh2_cyctt表达构建体用asci(新英格兰生物实验室公司，美国)按照制造商的方案进行线性化并且用higel/pcr dna片段提取试剂盒(s
ü
d-laborbedarf gmbh，德国)纯化。将500ng线性化质粒转化到电感受态巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2中，如前面实施例1a)和1d)中所述。在具有25μg/ml博莱霉素的ypd板上选择阳性转化体。通过用引物109_bb3an_ctrl_fwd和pgap_goi_rev_v2(表17)以基因组dna作为模板的pcr扩增来验证表达构建体的成功整合。产生的菌株被称为巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_paox1_adh2_cyctt和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pfld1_adh2_cyctt。
[0642]
c)用基因组dna纯化试剂盒(普洛麦格公司，美国)按照制造商的推荐分离出用于pcr扩增的基因组dna。用q5聚合酶(新英格兰生物实验室公司，美国)按照制造商的推荐完成pcr扩增反应。
[0643]
实施例18：具有用于ahd2过表达的甲醇诱导型启动子的甲醇利用负型菌株的比甲醇摄取速率的测量。
[0644]
为了研究用甲醇诱导型启动子的adh2过表达对比甲醇摄取速率的影响，如实施例7和实施例16中所述设置生物反应器培养。为此目的，使用实施例17中产生的菌株巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_paox1_adh2_cyctt和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pfld1_adh2_cyctt。
[0645]
a)将填充有300ml bsm培养基的反应器用15ml巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_paox1_adh2_cyctt(反应器r1和r2)和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pfld1_adh2_cyctt(r3和r4)接种。目标起始od
600
是2。在由溶解氧尖峰指示的分批阶段结束时，以2.8ml/h开始50％(w/w)葡萄糖进料持续24小时以增加生物质。葡萄糖进料开始后两小时，给予50％(v/v)甲醇注射以使甲醇浓度增加至1.5％(测量浓度为r1＝1.57％、r2＝1.57％、r3＝1.57％并且r4＝1.70％)。这样做是为了诱导甲醇消耗和甲醇诱导型启动子。在葡萄糖进料阶段结束时，取用于细胞干重和hplc的样品。
[0646]
b)在葡萄糖进料阶段之后，将搅动和通气设定为恒定的750rpm和9.5sl/h。添加另外的50％甲醇脉冲以使浓度增加至1.5％，并且立即取hplc样品(测量浓度为r1＝1.42％、r2＝1.39％、r3＝1.39％并且r4＝1.42％)。在4.2小时后再次测量浓度并且用于确定比甲醇摄取速率(q
甲醇
)。在初始脉冲几乎被消耗完后，应用第二甲醇脉冲并且立即取hplc样品(测量浓度为r1＝1.61％、r2＝1.65％、r3＝1.50％并且r4＝1.47％)。在6.2小时后再次测量浓度并且用于第二次确定比甲醇摄取速率(q
甲醇
)。
[0647]
c)使用两个甲醇脉冲确定比甲醇摄取速率(q
甲醇
)。第一脉冲与采样时间点之间的时间为4.2小时。第二甲醇脉冲与采样点之间的时间为6.2小时。第一脉冲后4.2小时后的平
均甲醇摄取速率对于p
fld1
adh2过表达菌株巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pfld1_adh2_cyctt为8.3mg g-1
h-1
并且对于p
aox1
adh2过表达菌株巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_paox1_adh2_cyctt为11.6mg g-1
h-1
(表21)。第二甲醇脉冲后6.2小时，平均摄取速率对于p
fld1
adh2过表达菌株增加至10.1mg g-1
h-1
并且对于p
aox1
adh2过表达菌株增加至13.8mg g-1
h-1
(表22)。此数据显示，当使用甲醇诱导型启动子时，较长的甲醇诱导时间会导致增加的adh2表达和比甲醇摄取速率。因此，在以甲醇作为唯一能量和碳源的培养基中，所述菌株可以随着时间的推移维持并且甚至增加比甲醇摄取速率。与实施例7中所述的巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt菌株相比，比甲醇摄取速率对于巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_pfld1_adh2_cyctt平均增加1.6倍并且对于巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 bb3az_paox1_adh2_cyctt平均增加2.3倍。
[0648]
表21：在第一甲醇脉冲后甲醇诱导型adh2过表达的情况下比甲醇摄取速率(q
甲醇
)的概述。
[0649][0650]
表22：在第二甲醇脉冲后甲醇诱导型adh2过表达的情况下比甲醇摄取速率(q
甲醇
)的概述。
[0651][0652]
实施例19：产生分泌重组蛋白的adh2过表达菌株的产生。
[0653]
为了研究adh2过表达和随之而来的比甲醇摄取速率增加是否对重组蛋白生产具有影响，将来自实施例3的产生hsa和vhh的巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2用p
aox1
adh2和p
fld1
adh2过表达构建体转化，并且用实施例4中所述的经调整的方案进行小规模筛选。
[0654]
a)使用如已经描述的golden gate组件完成过表达构建体(prielhofer等人,2017)。(1)通过bb3ak_14*(骨架)、来自实施例17的bb1_23_adh2(编码序列)、bb1_12_paox1(启动子)、bb1_34_sccyc1tt(终止子)的golden gate组装产生表达构建体bb3ak_paox1_adh2_cyctt。(2)通过bb3ak_14*(骨架)、来自实施例17的bb1_23_adh2(编码序列)、bb1_12_pfld1(启动子)、bb1_34_sccyc1tt(终止子)的golden gate组装产生表达构建体bb3ak_pfld1_adh2_cyctt。质粒和序列可在golden pics试剂盒#1000000133(addgene公司，美国)中获得。
[0655]
b)使巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pz30_paox1_αmf-vhh_cyctt菌株处于电感受态，如实施例1a)中所述。将bb3ak_paox1_adh2_cyctt表达构建体和bb3ak_pfld1_adh2_cyctt表达构建体用asci(新英格兰生物实验室公司，美国)按照制造商的方案进行线性化并且用higel/pcr dna片段提取试剂盒(s
ü
d-laborbedarf gmbh，德国)纯化。将500ng线性化质粒转化到电感受态巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pz30_paox1_αmf-vhh_cyctt，如前面实施例1a)和1d)中所述。在具有500μg/ml遗传霉素和25μg/ml博莱霉素的ypd板上针对巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pz30_paox1_αmf-vhh_cyctt_bb3ak_paox1_adh2_cyctt和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pz30_paox1_αmf-vhh_cyctt_bb3ak_pfld1_adh2_cyctt转化体选择阳性转化体。在具有500μg/ml遗传霉素和100μg/l诺尔丝菌素的ypd板中选择巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt_bb3ak_paox1_adh2_cyctt和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt_bb3ak_pfld1_adh2_cyctt转化体。每个转化选择多个克隆用于进一步筛选(实施例20)。产生的菌株命名为：巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 p
aox1
hsap
aox1
adh2、巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 p
aox1
hsap
fld1
adh2、巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 p
aox1
vhh p
aox1
adh2和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 p
aox1
vhh p
fld1
adh2。
[0656]
实施例20：小规模筛选产生分泌重组蛋白的adh2过表达菌株。
[0657]
在小规模筛选中测试来自实施例19中所述的转化体的多个克隆以研究adh2过表达对重组蛋白生产的影响。筛选程序改编自实施例4中所述的两次注射-扩展方案和标准方案。
[0658]
a)对于巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 p
aox1
hsap
aox1
adh2和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 p
aox1
hsa p
fld1
adh2的预培养，将克隆接种在具有500μg/ml遗传霉素和100μg/ml诺尔丝菌素的2ml ypd中，将巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 p
aox1
vhh p
aox1
adh2和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 p
aox1
vhh p
fld1
adh2克隆接种在500μg/ml遗传霉素和25μg/ml博莱霉素上。基于用于选择的抗生素抗性，将亲本菌株以两个重复接种在具有100μg/ml诺尔丝菌素或25μg/ml博莱霉素的ypd上。对于每种表达构建体，挑选十一个克隆用于筛选。将预培养物和筛选培养物在用空气渗透膜密封的24孔板中培养，并且在25℃下以280rpm进行孵育。将筛选培养物以8的起始光密度(od
600
)接种到2ml基本培养基(asmv6)中，其具有基于多糖溶液和酶的缓慢葡萄糖释放系统enpump200(enpresso gmbh，德国)以将培养物保持在葡萄糖极限内。将菌株与在接收的甲醇总量和孵育时间方面不同的两个不同甲醇进料程序进行比较(表23)。
[0659]
b)孵育期后，取出1ml每种培养物并且在预先称重的eppendorf管中离心。去除上清液，并且用caliper labchip gxii touch(珀金埃尔默公司，美国)按照制造商的说明测量蛋白质浓度。湿细胞重量通过称重具有细胞沉淀物的eppendorf管来确定，并且如下计算：重量(满)-重量(空)＝湿细胞重量(wcw)(g/l)。由此数据计算产率：产率(μg/g)＝蛋白质浓度/湿细胞重量。
[0660]
表23：用于测试实施例20中的转化菌株的分泌蛋白生产产率的筛选策略的概述。*第一注射是0.5％(v/v)甲醇。
[0661][0662]
c)结果总结在表24中。令人惊讶地，当与亲本mut-菌株相比时，过表达使蛋白质产率(μg/g)对于vhh增加最高达1.7倍并且对于hsa增加2.3倍。确实，证明adh2的过表达会改善巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2的重组蛋白生产。
[0663]
d)选择表现平均的菌株用于生物反应器培养。通过用引物109_bb3an_ctrl_fwd和pgap_goi_rev_v2(表17)以基因组dna作为模板的pcr扩增来验证表达构建体的成功整合。用基因组dna纯化试剂盒(普洛麦格公司，美国)按照制造商的推荐分离出用于pcr扩增的基因组dna。用q5聚合酶(新英格兰生物实验室公司，美国)
[0664]
按照制造商的推荐完成pcr扩增反应。
[0665]
表24：不同筛选条件下的以μg产物/g wcw计的平均分泌产物产率与标准偏差。*t-检验，与亲本菌株的统计学显著差异(p《0.05)。
[0666][0667]
实施例21：产生作为模型蛋白的hsa的具有adh2过表达的甲醇利用负型菌株。用策略3-具有葡萄糖/甲醇共进料阶段和分开的仅甲醇进料阶段的进料策略-培养。
[0668]
进行生物反应器培养以评价实施例19中产生并且实施例20中选择的甲醇利用负型adh2过表达菌株的重组蛋白生产能力。为了此目的，用如实施例10和实施例11中所述的策略3培养巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt bb3ak_paox1_adh2_cyctt(δaox1δaox2 p
aox1
hsa p
aox1
adh2)和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pn21_paox1_hsaopt_cyctt bb3ak_pfld1_adh2_cyctt(δaox1δaox2p
aox1
hsa p
fld1
adh2)菌株。
[0669]
a)此生物反应器培养分为三个阶段。(1)第一阶段是分批阶段。用生产菌株以2的起始od
600
接种反应器。如实施例7a)b)中所述进行接种。由溶解氧尖峰指示分批阶段的结束。(2)此时，第二阶段开始。第二阶段由50％(w/w)葡萄糖进料组成，以4.8ml/h持续25小时。在第二阶段开始时，应用50％(v/v)甲醇脉冲以使甲醇浓度增加至1.5％(v/v)的目标，并且开始随后的甲醇进料以抵消甲醇消耗、蒸发和被葡萄糖进料的稀释。(3)第三阶段由仅甲醇进料组成，持续19.6(r1、r2)和21.6(r5、r6)小时。如实施例6d)中所述，用hplc在线测量甲醇浓度。如有必要，添加另外的补偿脉冲。如实施例8和9b)中以每小时间隔计算甲醇进料。在反应器r1、r2、r5和r6中的每一个中使用的菌株鉴定在表25中。
[0670]
b)过程和生产率数据可以在表26和表27中找到。反应器r1、r2、r5和r6的整个培养过程中的最大和最小甲醇浓度范围为8.0g/l至13.6g/l。反应器r1、r2和r5、r6产生hsa作为模型蛋白。与实施例10相比，阶段3中在68.7小时的比生产率(q
p
)显示出在p
aox1
或p
fld1
的情况下adh2过表达的正面影响(表28、表29)。对于实施例10时间点45.02至69.58小时计算q
p
的加权平均值，以便更容易比较。实施例10从时间点45.02至69.58h的q
p
平均为40.9μg g-1
h-1
。在本实施例中p
aox1
adh2过表达反应器(r1、r2)从时间点49.1至68.7小时的q
p
平均为84.3μg g-1
h-1
。与实施例10相比，这是2倍的增加(表28)。在相似的时间范围(47.1至68.7小时)的p
fld1
adh2过表达(r5、r6)显示平均q
p
为71μg g-1
h-1
。这代表1.7倍的q
p
增加(表29)。在时间点68.7小时的体积生产率对于p
aox1
adh2过表达增加1.21倍(表30)并且对于p
fld1
adh2过表达增加1.13(表31)。在此实施例中的增加的q
p
和体积生产率证明了巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株中的adh2过表达对重组蛋白生产的益处。
[0671]
表25：实施例21和实施例22中使用的菌株的概述。
[0672][0673][0674]
表26：来自实施例21的生物反应器培养过程数据和在p
aox1
adh2过表达的情况下hsa的比生产率(q
p
)。*代表甲醇脉冲后的对照样品。
[0675]
[0676]
表27：来自实施例21的生物反应器培养过程数据和在p
fld1
adh2过表达的情况下hsa的比生产率(q
p
)。*代表甲醇脉冲后的对照样品。
[0677][0678]
表28：来自实施例10的产生hsa的甲醇利用负型菌株的比生产率(q
p
)与来自实施例21第3阶段的p
aox1
adh2过表达菌株的比较。
[0679][0680]
表29：来自实施例10的产生hsa的甲醇利用负型菌株的比生产率(q
p
)与来自实施例21第3阶段的p
fld1
adh2过表达菌株的比较。
[0681][0682]
表30：来自实施例10的产生hsa的甲醇利用负型菌株的体积生产率与来自实施例21的p
aox1
adh2过表达菌株的比较。*对于生物质体积的校正重组浓度(c
cp
)，c
cp
＝c
p
*(1-c
x
*fc)，fc＝0.0033。
[0683][0684][0685]
表31：来自实施例10的产生hsa的甲醇利用负型菌株的体积生产率与来自实施例21的p
fld1
adh2过表达菌株的比较。*对于生物质体积的校正重组浓度(c
cp
)，c
cp
＝c
p
*(1-c
x
*fc)，fc＝0.0033。
[0686][0687]
实施例22：产生作为模型蛋白的vhh的具有adh2过表达的甲醇利用负型菌株。用策略3-具有葡萄糖/甲醇共进料阶段和分开的仅甲醇进料阶段的进料策略-培养。
[0688]
进行生物反应器培养以评价实施例19中产生并且实施例20中选择的甲醇利用负型adh2过表达菌株的重组蛋白生产能力。为此目的，用如实施例10和实施例11中所述的策略3培养巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pz30_paox1_vhh_cyctt bb3ak_paox1_adh2_cyctt(δaox1δaox2 p
aox1
vhh p
aox1
adh2)和巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2 ppm2pz30_paox1_vhh_cyctt bb3ak_pfld1_adh2_cyctt(δaox1δaox2p
aox1
vhh p
fld1
adh2)菌株。
[0689]
a)此生物反应器培养分为三个阶段。(1)第一阶段是分批阶段。用生产菌株以2的起始od
600
接种反应器。如实施例7a)b)中所述进行接种。由溶解氧尖峰指示分批阶段的结束。(2)此时，第二阶段开始。第二阶段由50％(w/w)葡萄糖进料组成，以4.8ml/h持续25小时。在第二阶段开始时，应用50％(v/v)甲醇脉冲以使甲醇浓度增加至1.5％(v/v)的目标，并且开始随后的甲醇进料以抵消甲醇消耗、蒸发和被葡萄糖进料的稀释。(3)第三阶段由仅甲醇进料组成，持续43.6(r3、r4)和44.6(r7、r8)小时。如实施例6d)中所述，用hplc在线测量甲醇浓度。如有必要，添加另外的补偿脉冲。如实施例8和9b)中以每小时间隔计算甲醇进料。在每个反应器r3、r4、r7和r8中使用的菌株可以在表25中找到。
[0690]
b)过程和生产率数据可以在表32和表33中找到。反应器r3、r4、r7和r8的整个培养过程中的最大和最小甲醇浓度范围为8.6g/l至14.4g/l。反应器r3、r4和r7、r8产生vhh作为模型蛋白。与实施例11相比，adh2过表达对比生产率(q
p
)具有正面影响。为了更容易比较，计算实施例11的第二阶段(时间点20.0至53.6小时)的q
p
的加权平均值。比较显示，对于第二阶段的q
p
，p
aox1
adh2过表达(r3、r4)具有1.71倍增加并且p
fld1
adh2过表达(r7、r8)具有1.78倍增加(表34、表35)。在第三阶段的后期时间点，改善甚至更大。在时间点92.7和91.7，q
p
增加3.76倍(p
aox1
adh2过表达)和3.86倍(p
fld1
adh2过表达)(表34、表35)。另外，在两种情况下，与实施例11中的亲本菌株相比，体积生产率提高至少1.9倍(表35、表36)。在此实施例中的增加的q
p
和体积生产率证明了巴斯德毕赤酵母δaox1δaox2菌株中的adh2过表达对重组蛋白生产的益处。
[0691]
表32：来自实施例22的生物反应器培养过程数据和在p
aox1
adh2过表达的情况下vhh的比生产率(q
p
)。*代表甲醇脉冲后的对照样品。
[0692][0693]
表33：来自实施例22的生物反应器培养过程数据和在p
fld1
adh2过表达的情况下vhh的比生产率(q
p
)。*代表甲醇脉冲后的对照样品。
[0694][0695][0696]
表34：来自实施例11的产生vhh的甲醇利用负型菌株的比生产率(q
p
)与来自实施例22的p
aox1
adh2过表达菌株的比较。
[0697][0698]
表35：来自实施例11的产生vhh的甲醇利用负型菌株的比生产率(q
p
)与来自实施例22的p
fld1
adh2过表达菌株的比较。
[0699][0700][0701]
表36：来自实施例11的产生vhh的甲醇利用负型菌株的体积生产率与来自实施例22的p
aox1
adh2过表达菌株的比较。*对于生物质体积的校正重组浓度(c
cp
)，c
cp
＝c
p
*(1-c
x
*fc)，fc＝0.0033。
[0702][0703]
表37：来自实施例11的产生vhh的甲醇利用负型菌株的体积生产率与来自实施例22的p
fld1
adh2过表达菌株的比较。*对于生物质体积的校正重组浓度(c
cp
)，c
cp
＝c
p
*(1-c
x
*fc)，fc＝0.0033。
[0704][0705]
表38：菌株巴斯德毕赤酵母cbs7435(gasser,steiger和mattanovich,2015)中的甲醇诱导型启动子及其相应染色体位置
[0706]
[0707]
[0708]
[0709]
[0710]
[0711]
[0712]
[0713]
push cellulase secretion by pichia pastoris beyond existing benchmarks.journal of biotechnology，191，187-195.https：//doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.08.035
[0725]
nocon，j.，steiger，m.g.，pfeffer，m.，sohn，s.b.，kim，t.y.，maurer，m.，...mattanovich，d.(2014).model based engineering of pichia pastoris central metabolism enhances recombinant protein production.metabolic engineering，24，129-138.https：//doi.org/10.1016/j.ymben.2014.05.011
[0726]
prielhofer，r.，barrero，j.j.，steuer，s.，gassler，t.，zahrl，r.，baumann，k.，...marx，h.(2017).goldenpics：a golden gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast pichia pastoris.bmc systems biology，11(1).https：//doi.org/10.1186/s12918-017-0492-3
[0727]
prielhofer，r.，maurer，m.，klein，j.，wenger，j.，kiziak，c.，gasser，b.，&mattanovich，d.(2013).induction without methanol：novel regulated promoters enable high-level expression in pichia pastoris.microbial cell factories，12(1)，5.https：//doi.org/10.1186/1475-2859-12-5
[0728]
schwarzhans，j.-p.，wibberg，d.，winkler，a.，luttermann，t.，kalinowski，j.，&friehs，k.(2016).integration event induced changes in recombinant protein productivity in pichia pastoris discovered by whole genome sequencing and derived vector optimization.microbial cell factories，15，84.https：//doi.org/10.1186/s12934-016-0486-7
[0729]
stadlmayr，g.，a.，rothm
ü
ller，m.，maurer，m.，sauer，m.，mattanovich，d.，&gasser，b.(2010).identification and characterisation of novel pichia pastoris promoters for heterologous protein production.journal of biotechnology，150(4)，519-529.https：//doi.org/10.1016/j.jbiotec.2010.09.957