1.本发明属于微藻生物学领域与海洋生物学领域，具体涉及一种通过人为加富营养，使得夜光藻快速增殖，在短时间内得到大量藻细胞的培养方法。


背景技术：

[0002]“蓝眼泪”景观是由于海洋中夜光藻、海荧等生物大量繁殖或者聚集导致的海水荧光的自然现象。在福建平潭——厦门一带近岸海域，“蓝眼泪”已经成为知名的旅游景观，每年3月底到5月初，吸引着大量的游客前去“追光”，对当地的旅游产业的建设有着积极的意义。夜光藻（noctiluca scintillans）在近海大量繁殖与聚集是当地“蓝眼泪”现象的主要原因。该藻是一种世界范围内广泛分布的甲藻，可以分成完全影异养生活的红色夜光藻（rns）与和光合微藻共生、营兼性异养生活的绿色夜光藻（gns），我国海岸常见的为红色夜光藻，该藻也是引发平潭等地“蓝眼泪”现象的主要原因种。
[0003]
夜光藻属于甲藻门夜光藻科，藻体近圆形，直径150~2000 μm，细胞壁透明，细胞内原生质淡红色。该藻有一长一短两条鞭毛，藻体受到刺激（如晃动、震动、海浪等）时会发出短暂的蓝绿色荧光（波长500 nm，持续时间100 ms），大规模繁殖或聚集的夜光藻在海浪或者人为的作用下受到刺激就会发出荧光，这就是“蓝眼泪”景观的形成原因。虽然夜光藻藻华被认定为是一种有害藻华，但是夜光藻本身并不产毒，其荧光的特性不仅能够形成“蓝眼泪”景观，自身也有一定的经济价值。但是夜光藻类并不像青岛的小型水母（同样是一种生态问题）一样，能够形成水族箱类似的商品促进当地的旅游发展，这是因为夜光藻只有在较高密度的情况下，发出的荧光才是清晰而强烈的，然而目前并没有一种能够较好的快速培养夜光藻的方法，导致无法将该物种商品化。目前对于夜光藻的培养只停留在实验室条件下小体积培养。吴玉霖等在“夜光藻的室内培养（海洋与湖沼1994年第25卷第2期）”提到可以用扁藻（platymonas sp.）作为饵料，通过连续给料的方式，在20天的时间内将夜光藻的种群密度从0.75 cells/ml提升到 6 cells/ml，该方式需要连续提供饵料，操作较为繁琐，并且夜光藻生长率也并不高。而徐韧在“夜光藻的实验室培养及对其带触手二分裂现象的观察（水产学报1995年第19卷第3期）”也提到了扁藻可以作为夜光藻的饵料，但是在为期6天的培养过程中夜光藻的种群密度并没有显著的提升。曹新宇在“温度和盐度对夜光藻种群密度增长的影响（大连海洋大学学报2021年的356卷第1期）”采用杜氏盐藻培养夜光藻，在12 ℃连续培养20天，夜光藻由1 cells/ml提升到 15 cells/ml，同样有着耗时长，增长率低的特点。如何在短时间内快速的得到大量的夜光藻个体，目前并没有相关的技术进行阐述。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供一种在短时间（8-10天）内，获高密度夜光藻的培养方法，具体的是通过提供低水平的营养盐添加，通过“无机营养——饵料藻——夜光藻”的链条，一次性在短时间内获得高密度夜光藻的方法。
[0005]
为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种夜光藻快速增殖培养方法，包括以下步骤：（1）夜光藻饵料选取亚心形扁藻，扁藻使用f/2海水培养基培养7天至指数后期（1.0
ꢀ‑ꢀ
1.5
ꢀ×
10
6 cells/ml）备用。其中f/2海水培养基配方如下：nano
3 ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
75 mg/l；nah2po3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5 mg/l；fecl3·
6h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.15 mg/l；na2edfa
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4.36 mg/l；cuso4·
5h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀ
9.8 μg/l；znso4·
7h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀ
22 μg/l；mncl2·
4h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.18 mg/l；cocl2·
6h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10 μg/l；na2moo4·
2h2o
ꢀꢀꢀ
6.3 μg/l；维生素b1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1 mg/l；维生素b12
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5
ꢀµ
g/l；维生素h
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1 mg/l。
[0006]
（2）使用f/8海水培养基将夜光藻和步骤（1）的指数后期的亚心形扁藻稀释成终浓度分别为1 cells/ml与10000 cells/ml的混合培养体系，然后置于温度20
±
1℃，光照2650
±
100 lux，光照周期l∶d=14 h∶10 h 的条件下进行培养，每天定时（早晚）轻轻摇匀两次，培养8-10天即可得到密度在100 cells/ml以上的夜光藻。
[0007]
所述f/8培养基配方是上述f/2培养基使用三倍体积的无菌海水稀释即为f/8海水培养基；其中无菌海水的制备：自然海水经0.22 μm滤膜过滤后，121℃ 25 min高温灭菌。
[0008]
有益效果：（1）本发明通过一次性添加饵料藻和无机营养的方式培养夜光藻，操作简单方便，易于执行。
[0009]
（2）本发明采用提供低浓度营养（f/8海水培养基）的方式，刺激夜光藻的饵料藻生长，为夜光藻提供持续的营养供给，同时又不会因为提供的无机营养太多，导致饵料藻大量繁殖抑制夜光藻的生长，这样就能够在短时间内获得大量高密度的夜光藻。
附图说明
[0010]
图1为不同营养条件下，夜光藻和扁藻的种群密度增长曲线图，其中a为f/2；b为f/4（f/2培养基使用等体积的无菌海水稀释）；c为f/8（f/2培养基使用三倍体积的无菌海水稀释）；d为f/16（f/2培养基使用七倍体积的无菌海水稀释）；e为f/32（f/2培养基使用十五倍体积的无菌海水稀释）；f为空白海水对照。
具体实施方式
[0011]
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
[0012]
实施例1一种夜光藻快速增殖培养方法，包括以下步骤：
（1）夜光藻饵料选取亚心形扁藻，扁藻使用f/2海水培养基培养7天至指数后期（1.0
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1.5
×
10
6 cells/ml）备用。其中f/2海水培养基配方如下：nano
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75 mg/l；nah2po3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5 mg/l；fecl3·
6h2o
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3.15 mg/l；na2edfa
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4.36 mg/l；cuso4·
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9.8 μg/l；znso4·
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22 μg/l；mncl2·
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0.18 mg/l；cocl2·
6h2o
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10 μg/l；na2moo4·
2h2o
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6.3 μg/l；维生素b1
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0.1 mg/l；维生素b12
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g/l；维生素h
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0.1 mg/l。
[0013]
（2）使用f/8海水培养基将夜光藻和步骤（1）的指数后期的亚心形扁藻稀释成终浓度分别为1 cells/ml与10000 cells/ml的混合培养体系，然后置于温度20
±
1℃，光照2650
±
100 lux，光照周期l∶d=14 h∶12 h 的条件下进行培养，每天定时（早晚）轻轻摇匀两次，培养8-10天即可得到密度在100 cells/ml以上的夜光藻。
[0014]
所述f/8培养基配方是上述f/2培养基使用三倍体积的无菌海水稀释即为f/8海水培养基；其中无菌海水的制备：自然海水经0.22 μm滤膜过滤后，121℃ 25 min高温灭菌。
[0015]
图1的结果表明，夜光藻和扁藻的共培养体系随着营养盐浓度的变化而变化。营养盐浓度上升，夜光藻生长速率呈现逐渐增加的趋势，最高藻密度逐渐上升。该趋势随着营养盐密度达到f/8达到顶峰，而后逐渐下降，当营养盐处于较高密度的时候（f/2或f/4），夜光藻的生长逐渐受到大量繁殖的扁藻的抑制。这表明中水平的营养盐加富对夜光藻-扁藻共培养体系中夜光藻的增长更为有利。
[0016]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。