专利名称：人白细胞介素-10的纯化的制作方法
背景技术：
白细胞介素-10(IL-10)，一种最近发现的淋巴因子，起初被描述为γ-干扰素合成的抑制剂，并假定为是免疫应答体液组的主要介质[Fioretino，D.F.et al.，J.Exp.Med.1702081(1989)和Moore et al.，K.W.，et al.，Science2481230-1234(1990)]。两组通常相互排斥的免疫应答为体液(抗体传递的)和延迟型过敏。
假定这两种不同的免疫应答可以由两类表明截然不同细胞因子分泌模式的辅助T细胞克隆，即Th1和Th2辅助T细胞而产生[Moore，见前；Vieira，P.et al，Proc.Nat.Acad.Sci.USA Vol881172(1991)]。鼠Th1细胞克隆分泌γ-干扰素和IL-2和优先诱导延迟型过敏应答，而Th2细胞克隆分泌IL-4、IL-5和IL-10且对体液应答提供支持[Fiorentino et al.，见前]。可得到免疫应答的对比，因为Th1细胞克隆分泌的γ-干扰素抑制Th2克隆在体外的繁殖，而Th2细胞分泌的IL-10抑制Th1细胞克隆分泌的细胞因子[Fiorentino et al.，见前和Moore et al.，见前文]。因此这两种T辅助细胞类型可以相互抑制并且为两种不同的免疫应答提供理论基础。
IL-10业已从鼠和人T细胞克隆和定序[Moore et al.，见前，Vieira et al.，见前文]。两种序列均含有编码带18个氨基酸的N-末端疏水前导序列的178个氨基酸多肽的开放解读框架，且具有73％同源的氨基酸序列。
生物学活性IL-10如分析凝胶过滤测定的是一个二聚体。通常，根据其在非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上以单体迁移，表明该二聚体为非共价键合。重组人IL-10可由原核和真核两种表达体系表达。
真核表达体系中生产的重组人IL-10的N-末端分析表明小百分率的IL-10多肽有最初的两个N-末端氨基酸残基缺损。该截尾肽称作△2IL-10多肽，或简称△2。因此全长链称作△0，表示没有氨基酸缺失。因此，生物学活性的真核表达的IL-10可以表现为三种不同的二聚体。第一种生物学活性二聚体和主要形式为△0△0，一种同二聚体，其中两种二聚体多肽均具有全长链的氨基酸。第二种IL-10二聚体为△0△2，一种异二聚体，其中多肽链之一具有全长链的氨基酸，第二链△2具有最初两个N-末端氨基酸缺失。第三种IL-10二聚体为△2△2，一种同二聚体，其中两种二聚体多肽链均具有起初两个N-末端氨基酸残基缺失。因而需要一种方法来纯化IL-10，特别是需要一种将不同的IL-10二聚体各自分离的方法。
由原核表达系统表达的含在内含体中的IL-10必须变性，重折叠，并且从含有宿主蛋白，IL-10改良变异体和其变异体的异二聚体的污染物中纯化。再则，在原核体系中，该IL-10单体可以在一或多个赖氨酸残基上乙酰化。如果一个乙酰化单体结合到另一个乙酰化单体上则产生出一个乙酰化的同二聚体。然而如果一个非乙酰化单体结合到另一个非乙酰化单体上，则产生出一个非乙酰化的同二聚体。如果一个乙酰化单体结合到一个非乙酰化单体上则产生出一个异二聚体。再则，IL-10通常以非共价键合的同二聚体产生。然而，在内含体的截尾，IL-10的重折期间，可以产生共价键合的同二聚体，即在非还原SDS-PAGE上以二聚体移动，但在还原条件下则以单体移动。这可能是由两单体间形成的一或多个分子间二硫键造成的。因此，需要从宿主蛋白污染物中纯化IL-10以获得没有乙酰化的同二聚体，异二聚体变异体和共价二聚体的基本上纯的非共价键合的二聚体IL-10。
按照其作为潜在免疫应答介质的作用和其作为γ-干扰素合成抑制剂的活性，IL-10会在自身免疫性疾病或移植排异上有临床应用。然而，在临床药盒中，非常希望IL-10是一种基本上没有其它污染宿主和介质蛋白或多肽的高纯状态。因此，需要一种完成这些目标的纯化IL-10的方法。发明概要本发明通过提供一种纯化含在溶液中的IL-10的方法来填补这一需要，该方法包含(a)将含IL-10的溶液进行阳离子交换色谱，由此得含IL-10的级份；(b)将来源于步骤(a)的含IL-10级份进行阴离子交换色谱，由此得含IL-10的级份；(c)将来源于步骤(b)的含IL-10级份进行羟磷灰石色谱，由此得含单一的被分离的IL-10二聚体的级份；和(d)将来源于步骤(c)的含IL-10级份进行凝胶过滤色谱，由此得没有高和低分子量不纯物的含IL-10级份。
该IL-10的纯化方法可用于在细菌或真核表达体系中表达的IL-10。
本发明还提供一种包括将级份在二聚体相互分离的条件下进行羟磷灰石色谱，将含在蛋白级份中的含有二聚体混合物的不同IL-10二聚体分离的方法。
本发明还提供一种包括将蛋白级份在不同蛋白二聚体相互分离的条件下进行羟磷灰石色谱，将含在蛋白级份中的不同蛋白二聚体分离的方法，其中该不同二聚体具有不同的N-末端氨基酸序列。
本发明还提供一种包括将蛋白级份在蛋白变异体相互分离的条件下进行羟磷灰石色谱，将含在蛋白级份中的蛋白变异体分离的方法，其中该蛋白变异体具有不同的N-末端氨基酸序列。
本发明还进一步提供一种包括将溶液在非乙酰化同二聚体与IL-10的乙酰化二聚体分离的条件下进行阴离子交换色谱，将含在溶液中的IL-10非乙酰化同二聚体与IL-10的乙酰化的同二聚体和乙酰化异二聚体分离的方法。发明描述本文中引述的所有参考文献均全文合并于此作为参考。
如本文中所用的，“白细胞介素-10”或“IL-10”可以是人IL-10(hIL-10)或鼠IL-10。人IL-10定义为这样一种蛋白，它(a)具有与已知成熟(即没有隐匿前导序列)hIL-10基本相同的氨基酸序列，如美国专利申请号07/917,806,1992年7月20日申请，其相应于国际申请号PCT/US90/03554，公开号WO91/00349中所公开的，和(b)具有与天然hIL-10相同的生物学活性。
IL-10可以从能分泌该蛋白的活化T细胞培养基获得。然而，优选通过采用编码IL-10多肽的被分离核酸的重组技术获得。通常的分子生物学方法描述于，例如，Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Loboratory Manual，Cold Spring HarborPublish.，Cold Spring Harbor，New York，2ded.1989和Ausubelet al.，(eds.)Current Protocols in Molecular Biology.Green/Wiley，New York(1987和定期续篇)。适合的序列可以从基因组库或cDNA库得到。可以采用聚合酶链反应(PCR)技术。参见，例如，PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，1990，Innis et al.(Ed.)，Academic Press，New York，New York。
库由从适合细胞提取的核酸构建。参见，例如，国际申请公开号WO91/00349，它公开了制备IL-10的重组方法。有用的基因序列可在例如各种序列数据库中找到，例如，用于核酸的GenBank和EMBL库，用于蛋白质PIR和Swiss-Prot库，C/OIntelligenetics，Mountain View，California，或者GeneticsComputer Group，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，Madison，Wisconsin，这些并入本文作为参考。
包含编码人IL-10(hIL-10)顺序的克隆已保藏于设在马里兰州洛克维尔的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号68191和68192。如果采用表达载体，通过用核酸杂交法或者编码蛋白的免疫学测定来实现包藏编码IL-10序列的其它克隆的鉴定。以存贮序列为基础的寡核苷酸探针公开于国际申请公开号WO91/00349。用于鉴定该顺序的寡核苷酸探针也可从其它种的相关基因保存区制备。另外，可以采用基于IL-10氨基酸顺序的简并探针。
各种表达载体可用来表达编码IL-10的DNA。在原核或真核细胞中用于重组蛋白表达的常规载体都可以使用。优选的载体包括pcD载体，描述于Okayama et al.，Mol.Cell.Bio.Vol.3280-289(1983)；和Takebe et al.，Mol.Cell.Bio.Vol.8466-472(1988)。其它的SV40基哺乳动物表达载体包括Kaufman elal.，Mol.Cell.Bio.Vol.21304-1319(1982)和USP4,675,285中公开的那些。这些SV40基载体特别用在COS7猴细胞(ATCCNo.CRL1651)，以及其它哺乳动物细胞如鼠L细胞和CHO细胞。
可以用标准的转染方法来生产表达大量多肽的真核细胞系。本发明的方法是一种纯化被细胞上清液中的真核细胞表达的IL-10的方法，所述蛋白质在上述上清液中被表达。真核细胞系包括哺乳动物，酵母和昆虫细胞系。例示的哺乳动物系包括COS-7细胞，鼠L细胞和中华仓鼠卵(CHO)细胞。参见Sambrook el al.，见前文和Ausubel et al.，见前文。
再则，本发明的方法提供一种纯化由基因转化细菌，特别是E.Coli，生产的IL-10的方法。如本文中所采用的，术语“转化细菌”是指业已通过基因工程来生产哺乳动物蛋白的细菌。这种基因工程通常将表达载体引入细菌。该表达载体能够相对于细菌基因组中的基因自主复制和蛋白表达。假定编码所需蛋白的核苷酸顺序是已知的或是另外可得到的，则构建细胞表达是本领域已熟知的。例如，DeBoer在USP4,551,433中公开了用在细菌表达载体中的启动子；Goeddel等在USP4,601,980和Riggs在USP4,431,739中公开了用E.coli表达体系生产哺乳动物蛋白；和Riggs见前文，Ferretti等Proc.Natl.Acad.Sci.83599(1986)，Sproat等，Nucleic Acid Research132959(1985)和Mullenbach等，J.Biol.Chem.261719(1986)公开了怎样构建在细菌中表达的合成基因。许多细菌表达载体可从市场和通过设在马里兰州洛克维尔的美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到。
本发明的方法包括按顺序使用阳离子交换、阴离子交换、羟磷灰石和凝胶过滤色谱。为获取高纯度和最大产率，四步色谱的每一步都在pH、导电率、缓冲组合物、流速和柱尺寸上选择和优化。用来测定此纯度和产率优化作用的分析方法为Western即迹法，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电瀛泳(SDS-PAGE)Laemmli，U.K.，Nature227680(1970)，酶连免疫吸附测定(ELISA)值，280nm和260nm紫外吸收和蛋白质浓度测定[(Bradford，M.，Anal.Biochem.，72248(1976)]。
再则，为有效和迅速大规模操作以及考虑产品纯度和产率，对色谱步骤的次序作了优化。此包括1)第一步骤(阳离子交换)期间产品浓缩以减少体积处理；2)第二步骤(阴离子交换)的流经方式应使此快速步骤的产品可即刻装载到下一个柱上而无多余的步骤；3)去除前两个步骤期间的几乎所有污染蛋白，这样在第三个柱(羟磷灰石)中拆分IL-10形式时不受这些其它蛋白的干扰；和4)除了分离不同分子量的痕量污染物和IL-10单体外，凝胶过滤色谱的缓冲液交换使得在所需缓冲液中获得的最终产品IL-10适于进一步的医药制剂。
首先采用阳离子交换色谱步骤是由于IL-10很好地吸附在阳离子交换树脂上。可以采用任一种阳离子交换基如羧甲基，硫代丙基和磺酸盐。阳离子交换基可以固定在任何固相载体上，包括但不限于纤维素，葡聚糖，琼脂和聚苯乙烯。优选的阳离子交换基为固定在琼脂装填的载体底物上的磺酸盐，如S-SEPHAROSE Fast Flow(Pharmacia产，Piscataway，N.J.)。为在IL-10上产生足够的正电荷，平衡缓冲液的pH应低于IL-10的等电点7.8，对于S-SEPHAROSE来说，优选pH6.5。这样使得IL-10蛋白对阳离子交换基良好吸附。
如果IL-10由哺乳动物细胞培养表达体系生产，优化条件使得80-90％的污染蛋白，特别是白蛋白这种主要的污染蛋白，不结合到色谱柱上。将要装载的蛋白量可根据厂家提供的信息实验测定。采用一个5×28cmS-SEPHAROSEFast Flow柱，可以1.1cm/min的流速加入大约100mg蛋白/ml底体积。上清液装载后，将柱用分段洗脱或线性梯度盐溶液展开，对于S-SEPHAROSE柱优选70-300mM NaCl线性梯度。IL-10在浓度约150mM NaCl，分离峰A280，大概17mS下洗脱下来。理想的是接着浓缩含IL-10的级份，并通过例如用PELLICON，10K膜透析。
如果在细菌表达体系内含体中生产IL-10，该IL-10通常变性而后重折叠。然后将含有重折叠IL-10的溶液施用到如上所述的阳离子交换树脂上。优选条件使80-90％的污染蛋白不结合到树脂上。将要装载的蛋白量可根据厂家提供的信息实验测定。采用一个12×36cm S-SEPHAROSEFast Flow柱，可以1cm/min的流速加入大约15mg蛋白/ml底体积。上清液装载后，将柱用分段洗脱或线性梯度盐溶液展开，对于S-SEPHAROSE柱优选65-400mM NaCl线性梯度。IL-10在浓度约150mMNaCl，分离峰A280，大概17mS洗脱出来。理想的是接着浓缩含IL-10级份，并通过例如用PELLICON，10K膜透析。
将来自阳离子交换色谱的含IL-10级份进行阴离子交换色谱，基本上去除存留的宿主或细胞培养蛋白污染物。可采用任何阴离子交换基。实例有季氨乙基，混合胺或其它中等强度碱或弱碱交换基。委氨乙基是优选的阴离子交换基。季氨乙基可以固定在葡聚糖，纤维素，琼脂或丙烯酸载体底物上。优选载体为琼脂。理想的QAE琼脂阴离子交换树脂是Q-SEPHAROSE(Pharmacia，Piscataway，N.J.)。
由哺乳动物细胞培养体系中生产的IL-10不吸附在最佳pH8.0-8.3的QAE阴离子交换树脂上。因此，如果mg蛋白/ml底体积数低于4，IL-10通过QAE柱而大多数污染蛋白被吸附。
能用反相高压液相色谱(HPLC)通过首先分离IL-10来测定级份中IL-10的乙酰化作用。然后可以进行完整蛋白或胰蛋白酶消化片断的质谱。如果IL-10或片断乙酰化，则质谱分析会表明IL-10或其片断质量的增加等同于乙酰基的质量。此外，如果IL-10乙酰化，胰蛋白酶消化片断的N-末端顺序分析证实一个峰与乙酰化赖氨酸标准物对应。当含蛋白的溶液是在导电率1.0-1.5和pH8.7时，原核体系中生产的非乙酰化IL-10通过时只弱吸附于阴离子交换树脂。乙酰化二聚体和污染宿主蛋白更紧密地吸附于柱上。
将从阴离子交换柱获得的含IL-10蛋白级份进行羟磷灰石色谱以便分离级份中存在的IL-10的不同二聚物形式。这点可以由速流法做到，该法中阴离子交换柱直接安置在羟磷灰石柱上，这样从阴离子交换柱流出的级份当它们从阴离子交换柱出来时即刻装载到羟磷灰石柱上。
如果IL-10是由哺乳动物细胞培养体系生产，则羟磷灰石柱用pH约8.1的标准盐溶液平衡。适合这种目的的缓冲液由20mM Tris-Cl，和20mM NaCl组成，pH8.1。将该含IL-10的级份装载到羟磷灰石柱上，并优选用20底体积的约pH8.0的150mM磷酸钾缓冲液线性梯度洗脱。洗脱起初用约浓度6％的KPO4缓冲液，逐渐增加直到达约75％的浓度。也可以相同浓度水平使用NaPO4。△0△0 IL-10二聚体在150mM KPO4缓冲液浓度约20-25％时洗脱出来。另二种二聚体在150mM KPO4缓冲液浓度约30-35％时洗脱出来。然后△0△2可从△2△2分离，优选通过双倍长度的柱，并使用和再使用所得级份直至△0△2和△2△2以不同级份流出。采用羟磷灰石色谱，一同存在于含IL-10级份中的不同IL-10二聚体可以相互分离。不同二聚体的确已分离的结果可以由N-末端氨基酸残基序列分析测定。
如果IL-10是在原核表达体系中生产，则截尾二聚体很少。然而，非共价键合IL-10二聚体必须与共价键合的IL-10二聚体分离开。这点可由羟磷灰石色谱做到。羟磷灰石柱用pH约7.4的标准盐溶液平衡。用于此目的的适合缓冲液由20mM Tris-Cl，和20mMNaCl组成，pH7.4。将含IL-10的级份装载到羟磷灰石柱上并优选用20底体积的pH7.4的150mM磷酸钠缓冲液线性梯度洗脱。洗脱起初用约浓度5％的NaPO4缓冲液并逐渐增加直到达浓度约100％。也可以相同浓度水平使用KPO4。非共价键合二聚体首先在7-10mS洗脱出来，共价键合二聚体峰在约12mS。
接着将从羟磷灰石柱获得的被分离的含IL-10二聚体级份进行凝胶过滤。凝胶过滤用来分离包括IL-10单体的高和低分子量不纯物。两种特别有用的凝胶是SEPHACRYL S-200HR，它具有5kDa至约250kDa的蛋白质级份范围，和SEPHACRYL S-100，它具有1至100kDa的蛋白质级份范围。其它的具有约1kDa至600kDa的蛋白质级份范围的凝胶也可以被使用。
可用羟磷灰石色谱分离在N-末端氨基酸顺序不同的蛋白质变异体形式。蛋白，单聚或寡聚，可以纯化但仍保留由于变异体缺失-或多个N-末端氨基酸而致的异源性。这些变异体可由羟磷灰石色谱分离。为了实现这些分离，测定了许多试验变数。首先是洗脱必需的磷酸盐浓度，和磷酸盐浓度梯度。第二类要测的变数是柱长，蛋白载量，pH，净电导率和低量的二价阳离子。某种变化条件下的再色谱似乎改善变异体形式的产率和纯度。
下列实施例用来说明但不限定本发明。
实施例1纯化来源于CHO细胞系培养基的人IL-10用含IL-10基因的载体转染中华仓鼠卵(CHO)细胞，并在添加5％NUSERUM V和HBCHO的Iscove′s ModifiedDulbecco′s Medium(IMDM)中生长。IMDM是一种含盐、缓冲液、维生素、氨基酸和葡萄糖的碱基培养基(Sigma，St.Louis，Missouri)。NUSERUM V是一种含25％新生牛血清，激素生长因子和其它营养素的培养基添加剂(Collaborative Research)。HBCHO是一种含牛血清白蛋白、胰岛素、铁传递蛋白、胎球蛋白、脂肪酸、乙醇胺和硒的无血清添加剂(Irvine Scientific)。该转染的CHO细胞在37℃ pH7.2的细胞培养基中生长。生长五天后，抽出总量177升的细胞培养上清液液体，进行回流微过滤并用超滤法浓缩至约17.6升。然后用20mM MES(2-[N-吗啉]乙磺酸)，65mM NaCl，pH4，透析比CHO细胞培养上清液。然后将所得上清液液体进行下列色谱程序，所有这些操作均在4℃下进行。
阳离子交换色谱将浓缩的经透析的CHO细胞上清液液缩物装载到用20mMMES，70mM NaCl pH6.5平衡的5×28cm S-SEPHAROSEFast Flow柱上。大约100mg蛋白/ml底体积以1.1cm/min的流速加入。该柱用8.5底体积的平衡缓冲液冲洗，接着用13底体积，70-300mM NaCl梯度液以降低的流速0.6cm/min洗脱。hIL-10在分离峰A280，大概17mS它相应于约150mM NaCl处洗脱，它是在16-20mS洗脱的主要蛋白。将含hIL-10的级份浓缩并用由20mM Tris-Cl，20mM NaCl构成的，pH8.1的缓冲液A透析(PELLICON，10K膜)。
采用S-SEPHAROSE的阳离子交换色谱产生良好的吸附，因而选作第一纯化步骤。使用条件如上述。80-90％的污染蛋白不结合到树脂上。虽然hIL-10占初始蛋白的1％，但它是在16-20mS洗脱的主要蛋白，并纯化了50倍。见下面的表1。通过评价多种色谱的280和260nm的紫外吸收、蛋白浓度、ELISA值、SDS-PAGE，和Western即迹结果，测定pH、导电率、流速和柱尺寸的最佳条件。
阴离子交换色谱将从阳离子交换色谱步骤得到的浓缩的经透析的含IL-10级份装载到用缓冲液A平衡的5×13cm Q-SEPHAROSEFastFlow柱上。以0.5cm/min的流速装载约3.5mg/ml底体积的蛋白。然后用缓冲液A冲洗柱子直到A280处吸收最小。不吸附在Q-SEPHAROSE上的蛋白含IL-10，将其集中，直接装载到羟磷灰石柱上。
人IL-10对各种阴离子交换柱亲合力小，在pH达8.1和导电率低至4mS表现最小结合。如果mg蛋白/ml底体积保持低于4，则充经方式的Q-SEPHAROSE色谱使hIL-10直接通过柱子，而多数污染蛋白被吸附。由于羟磷灰石色谱前没有Q-SEPHAROSE的缓冲调节，这两个柱可以串联连接，这样Q-SEPHAROSE柱的流出物就直接装载到羟磷灰石柱上。
羟磷灰石色谱将由Q-SEPHAROSE柱得的含IL-10级份装载到2.6×26cm羟磷灰石柱上，并用缓冲液A平衡以分离存在于级份中的IL-10二聚体。采用的羟磷灰石是由Pantax生产且由American International Chemical Inc.销售的陶瓷磷灰石。陶瓷磷灰石是由加热即烧结羟磷灰石晶体成珠而形成的。标准的即未烧结的羟磷灰石(Biorad)也可接受。以接近2.5mg/ml底体积以流速0.6cm/min装载蛋白。用5底体积的94％缓冲液A和6％缓冲液B混合物冲洗柱子。缓冲液B由50mM KPO4组成，pH8.0。用从6％至75％的缓冲液B线性梯度洗脱IL-10。△0△0二聚体在大概20-25％浓度的缓冲液B下洗脱出来。△0△2和△2△2二聚体在大概30-35％浓度的缓冲液B下洗脱出来。
凝胶过滤色谱含△0△0 IL-10二聚体(达～20mg/ml)的分离浓缩的羟磷灰石集中液装载到用由20mM Tris-Cl，150mM NaCl组成的，pH8.1的缓冲液C平衡和洗脱的SEPHACRYLS-200HR或SEPHACRYLS-100HR柱(2.6×85cm)上。样品装载体积小于底体积的4％且流速为0.1cm/min。将峰级份集中并在-20℃贮藏。
不论SEPHACRYLS-200HR还是SEPHACRYLS-100HR中的凝胶过滤色谱均揭示hIL-10表现出与一种二聚体形式一致的分子量。△0△0是(0.2-20mg/ml底体积)装载的所有蛋白浓缩液的占优势形式。少量(＜5％)的hIL-10单体作为A280洗脱曲线的拖尾肩偶尔可见，这些级份排除在集中液外。
综合纯化过程产出大概每升细胞培养基1.1mg至少98％的纯△0△0人IL-10。纯度由十二烷基硫酸钠—聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，Laemmli，U.K.，Nature，227680(1970)。此外，不论反相(C4)还是筛析ZORBEX250HPLC色谱均只显示一单峰。进行的每一纯化步骤示于下表中，其中结果为三次纯化，每次过大概175升CHO细胞上清液(含5％Nu-Serum V)的平均值。
表1CHO hIL-10的纯化总蛋白步骤吸收度 h.IL-10a产率a 纯度b(A280单位)(mg) (mg) (％) (％)细胞培养55,00057,000600 1001.1S-Sepharose 680 890 430 72 48Q-Sepharose 190 360 290 48 81羟磷灰石130 200 210 35 92Sephacryl S-200 73180 200 33 98a根据ELISA测试的hIL-10浓度和产率。
b对于细胞培养浓缩物，S-Sepharose集中液和Q-Sepharose集中液，纯度测定为mg hIL-10(由ELSA测定)/mg总蛋白(由Bradford测试见前测定)×100。
对于羟磷灰石集中液和Sephacryl S-200集中液，纯度通过在不同蛋白量的带强度的比较由SDS-PAGE测定。在此技术中，已知量的0.005-25μg范围的样品在SDS-PAGE凝胶不同的跑道进行测定。高装载中见的污染物相对量通过与在低装载见的IL-10带强度的比较而测定。
实施例2纯化来源于E.coli的人IL-10
将大肠杆菌(E.coli)用含有编码和表达重组人白细胞介素(rhuIL-10)基因的表达质粒转化。该质粒载有转录rhu IL-10的强的杂交tac启动子[Zurawski，S.M.et al.，J.Immunol.1373354-3360(1986)]。包括转录终止子的Lpp3′编码和非编码区，位于rhu IL-10编码区的下游区。由pINI IIompA衍生出来。Lpp基因的该区被认为导致其对mRNA上游区的稳定性[Ghrayeb，J.et al.EMBO J.，32437-2442(1984)]。该质粒载有由pvu208(一种由pCl0DF13衍生的复制控制突出变体)衍生的复制热诱导原点[Hakkart，M.J.J.et al.183326-332(1981)]。曾报道在提高的温度下，例如42℃，载有此复制原点的不同质粒的质粒复制数从每染色体约30份增至相等于几百份复制产物[Andreoli，P.M.，et al.，J.Bacteriol，135612-621(1978)]。该质粒载有源于pBR332的质粒保持抗四环素基因[Sutcliffe，J.G.C.S.H.Symp.Quant.Biol.4377-90(1978)]。表达构建导致rhIL-10作为不溶内含体在细胞内生产。将被转化的E.coli在含20g/L胰化胨，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl和10mg/L四环素的琼脂上平板培养。从琼脂板上随机采集一单个的分离好的菌落并在第二块琼脂板上再划线。
将来源于刚再划线琼脂板的两个菌落悬浮在含30g/L酪蛋白氨基酸，20g/L酵母提取物，5g/L KPO4[一元碱]，20g/L甘油，lg/LMgSO4，pH7的1ml LYM-1培养其中制备主细胞库。然后用此接种在300ml折流烧瓶中的100ml含10mg/L四环素的LYM-1肉汤，[LYM-1/Tc10]，再将其在30℃温育并用旋转振荡器以每分钟300转(PRM)摇动直至细胞密度达～400的klett540(早对数期)。该培养物与40％甘油以1∶1混合(V/V)，得终甘油浓度20％。然后一毫升一份配入预贴标签低温管瓶中，在液氮下快速冷冻，使用前在-80℃的冰箱中保存。
将一管主细胞库在室温下空气中融解制备工作细胞库，然后接种入在300ml折流烧瓶中的100ml LYM-1/Tc10培养基中，再将其在30℃培养并用旋转振荡器以300RPM摇动直至培养物达～400的klett(早对数)。接着此培养物按1∶1与40％甘油混合。然后一毫升一份分配入预贴标签的冷冻管瓶中，液氮下快速冷冻，并在-80℃冰箱中贮存。
将1.5ml冷冻管的工作母液在室温下融解。将大概0.5ml工作母液转入含500ml LYM-1/Tc10培养基的2000ml(烧瓶中。在接种前一刻加入四环素)。烧瓶置于旋转振荡器上并在30℃以300RPM摇动。6.5-7小时后从烧瓶中取出一样品作klett540测定。培养物具有200-300的klett540值。接着用2000ml烧瓶的内含物接种含800升LYM-3/Tc10培养基的1000升发酵桶。LYM-3/Tc10培养基由30g/LHyCase P乳酪消化物(sheffield)，20g/LD型酵母提取物(Bio Springer)，15g/L单碱磷酸钾(Monsanto)，0.5ml/L 30％的SAG-471悬浮液(UnionCarbide)，20g/l甘油99.7％(Univer)，1g/l硫酸镁·7H2O(PQ)，10mg/l四环素(Sigma)，2ml/l由2ml/l硫酸，15g/l柠檬酸钠，13.5g/l六水氯化铁组成的柠檬钠母液组成。培养基的pH用50％NaOH溶液和75％H3PO4溶液调节至约7。发酵桶中的接种培养基温度保持在30℃±0.5℃直到达1000±100klett540，然后升温至38℃±0.5℃保持14小时。通过搅拌将发酵桶中溶解氧浓度保持在大于40％饱和的水平。
温度提高到38℃后通过降低搅拌和冷却培养基至5℃-15℃收获发酵物。采用内含CSA-16连续除淤渣离心机以大概每分钟5-10升(1pm)的进料流速离心批料。调节流速以获得清澈的离心分离物。采用一种全除沉积物和一部分除去沉积物的方法(滚动时间设定为0.95秒)来回收800升发酵物。离心步骤中回收到40±2kg细胞片状沉淀物。
该40kg离心步骤中回收的细胞片状沉淀物用Gaulin M12匀浆器在7000-8000psi压力下操作相等于6次匀化。这点通过将再循环批料以流率大概140分钟101pm从存储罐经匀浆器和甘油冷却热变换器再回到存储罐的循环来完成。140分钟匀化后，提取一匀浆样品并在位相显微镜下检查。这样做是为了测评细胞破碎程度。如果未观察到大于95％的破碎度，如由显微镜评估估计的，则需继续匀化。
匀浆的细胞通过将匀浆物与等体积的4M胍缓冲液混合来失活。胍缓冲液由6.05g/l TRIZMA-BASE(Tris[羟甲基]氨基甲烷)(Sigma)，1.90g/l EDTA二钠盐二水合物(Sigma)，58.4g/lNaCl USP(Mallinckrodt)和382g/l胍HCl(Sigma)。将再悬浮液在10-15℃缓慢搅拌下保持30分钟。然后将失活的再悬浮液以流率每分钟500ml和离心速度1700rpm用Sharples AS 26SP离心。将在此步骤中回收的含内含体片状沉淀物在-10℃下冷冻。内含体是含有除hIL-10外，各种E.coli宿主蛋白，核酸和其它纤维碎片的聚集体。
IL-10的展开将在-10℃贮存的内含体片状沉淀物在2-10℃的冷室中融解三天。片状沉淀物破碎并加入20升的展开缓冲液中。该展开缓冲液由50mM TRIZMA(Tris[羟甲基]氨基甲烷)(Sigma)，7M胍HCl和4mM二硫苏糖醇(DTT)组成，pH8.5。用polyfron匀浆器剧烈搅拦内含体片状沉淀物以形成细密的悬浮液。接着在2～10℃缓慢搅拌3小时使悬浮液进一步溶解。
IL-10的重折叠将溶解蛋白质溶液用重折叠缓冲液稀释大概25倍。该重折叠缓冲液由50mM TRIZMA，0.12M胍HCl，0.05mM谷胱甘肽(还原态)组成，pH8.5。稀释的重折叠溶液即刻用过滤澄清，然后加入氧化的谷胱甘肽溶液使其最终浓度为0.45mM并继续重折叠10-24小时。
浓缩/透析重折叠步骤结束时，在超滤前用0.45μm过滤器过滤澄清该溶液。此外，可放置一与超滤器相配的过滤器以确保超滤期间的澄清度。接着将含此重折叠IL-10的溶液浓缩约10倍。此采用带10,000标定分子量PLGC膜的超滤体系MilliporePELLICON超滤器完成。接着透析浓缩物以降低浓缩物导电率至大概6mS。透析缓冲液由pH8.5，20mM TRIS，20mM NaCl组成。
阳离子交换色谱通过加入1M BIS-TRIS和4N HCl将含重折叠hIL-10的浓缩溶液调节至20mM BIS-TRIS，pH6.5。接着过滤澄清溶液。接着将含有大概1.2mg蛋白/ml的澄清加料溶液以1cm/min的流速加到12升(12cm×36cm直径)S-SEPHAROSEFast Flow硫酸盐柱(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)上。该柱已用10底体积的pH6.5，20mM BIS-TRIS，0.065M NaCl缓冲液以1cm/min的流速预平衡过。用20柱体积梯度范围，0.065-0.4MNaCl，20mM BIS-TRIS，pH6.5缓冲液以0.5cm/min的流率进行洗脱。洗脱分布图的hIL-10峰级份用A280测定并用典型的pH和导电率范围核准。含hIL-10的级份在11-18mS，100-170mM NaCl处洗脱，收集到一起以用于下一步操作。
阴离子交换色谱将含有hIL-10的来源于阳离子交换色谱的收集的级份用带10,000标定分子量PLGC膜的超滤体系MilliporePELLICON超滤器浓缩至0.5柱体积。浓缩物然后用10mMTRIS缓冲液pH8.7透析至大概1.5mS。将透析的浓缩物pH用HCl或NaOH调节至pH8.7。将含大概13mg/ml蛋白的溶液以流率0.5cm/min加入到6升(18cm直径×23.5cm)季铵柱Q-SEPHAROSEFast Flow(Pharmacia)上。该柱已用10mMTRIS，8mM NaCl，pH8.7缓冲液预平衡。hIL-10与含在馏份中不纯物相比对树脂有不同的吸引力，且在常液洗脱下分离和10mM TRIS，8mM NaCl，pH8.7缓冲液一起收集在流出物中。乙酰化同二聚物和乙酰化异二聚物对树脂的吸附更强，因此与非乙酰化同二聚体分离。如A280测定的洗脱曲线的非乙酰化hIL-10峰级份被集中以用于下一步操作。
羟磷灰石色谱将由阴离子交换色谱步骤得的含hIL-10集中物加入到用20mM TRIS，20mM NaCl，pH7.4缓冲液预平衡的4升(26cm×14cm直径)羟磷灰石柱(例如，瓷磷灰石，BioradMACROPREP)上。用减少20mM TRIS缓冲液的量从100％至95％和增加pH7.4，0.15M磷酸钠缓冲液0％至5％的水平大概4柱体积进行柱冲洗。通过用17底体积洗脱梯度从5％至100％增加该磷酸盐缓冲液的百分比浓度进行洗脱。非共价键合的二聚体在7-10mS洗脱，而共价键合的二聚体峰现于12mS。如由A280测定的该hIL-10峰级份被集中以用于下一步操作。
凝胶过滤色谱将来源于羟磷灰石操作步骤的含非乙酰化非共价键合的IL-10二聚体集中物用含10,000标定分子量膜的超滤体系浓缩。浓缩液加到用10mM TRIS缓冲液，pH7.4预平衡的14.8升(96cm×14cm直径)SEPHACRYLS-200HR凝胶过滤柱中用pH7.4，10mM TRIS缓冲液洗脱柱子。如A280测定的洗脱曲线的hIL-10峰级份被集中以用于下一步操作。凝胶过滤集中液经0.2μm过滤器过滤。滤液即最终纯化的大容积药液，贮存在-20℃下。
无论SEPHACRYLS-200HR或是SEPHACRYLS-100HR中的凝胶过滤色谱均揭示hIL-10显示与一种二聚体形式一致的分子量。非乙酰化非共价键合二聚体为(0.2-20mg/ml底体积)装载的所有蛋白浓缩物的占优势形式。少量(＜5％)的hIL-10单体作为A280洗脱曲线上的拖尾肩偶尔可见，这些级份排除在集中液外。
进行的每一纯化步骤示于下面表2中。
表2E.coli表达的hIL-10的纯化总蛋白步骤 吸收度 hIL-10a产率a 纯度a(A280单位) (mg) (mg) (％) (％)重折叠b183,000161,000 44,800 100 455-Sepharose 21,700 42,000 28,900 6581Q-Sepharose 6,860 18,900 17,300 3999羟磷灰石 5,670 16,500 13,700 3199SephacrylS-200 4,950 14,400 12,000 2799a根据反相HPLC分析的浓度、产率和纯度。b浓缩，透析和pH调节后。
实施例3重折叠人IL-10的疏水作用色谱作为透析重折叠IL-10的替代，可用下列方法去除重折叠和变性缓冲液。将在E.coli表达的含人IL-10内含体用10∶1(v/w)的展开缓冲液比内含体的比例再悬浮。展开缓冲液由6M盐酸胍(Gdn HCl)，4mM二硫苏糖醇(DTT)，50mM Tris pH8.5，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，和1mM苯甲基次硫酸氟化物(PMSF)组成。含内含体的缓冲液在4℃搅拌三小时培养，生产展开的变性人IL-10。
将展开变性IL-10稀释100倍入含50mM Tris pH8.5，1mMEDTA，0.5M终浓度Gdn HCl，4.17mM还原谷胱甘肽，0.83mM氧化谷胱甘肽，2mM苯甲脒的重折叠缓冲液并在4℃培养17小时。
重折叠后，混合物经0.45μm过滤器过滤，带至25％硫酸铵浓缩物并再过滤。将滤液从线性流率1cm/min以每ml树脂0.25至0.5克内含量的比率加入到Butyl-Toyopearl 650M疏水作用(Toso Haas)柱上(用25％硫酸铵，20mM Tris pH8.5预平衡)。在此步骤中，IL-10结合到柱上而许多蛋白质和大多数非蛋白污染物如重折叠过程试剂如谷胱甘肽和Gdn HCl，低分子量污染物，E.coli细胞成分片断等特有的重折叠混合物流过该柱。然后结合的人IL-10用20mM pH8.5，20-50mM NaCl常液洗脱。收集到21底体积级份。人IL-10开始洗脱2底体积入常液梯度液。通常收集2～15级份，然后疏水作用集中液可作进一步操作作进一步纯化。
虽然本发明结合上面给出的具体实施方案作了描述，但其许多替代，改良和变化对本领域普通技术人员是显而易见的。所有的这些替代，改良和变化均确定为落入本发明的精神实质和范围内，本发明只受权利要求的限制。
权利要求
1.一种纯化溶液中人白细胞介素-10(IL-10)的方法，包括(a)将含IL-10的溶液进行阳离子交换色谱，由此得含IL-10的级份；(b)将来源于步骤(a)的含IL-10级份进行阴离子交换色谱，由此得含IL-10的级份；(c)将来源于步骤(b)的含IL-10级份进行羟磷灰石色谱，由此得含IL-10单一分离二聚体的级分。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)的阳离子交换色谱柱由固定在载体底物上的磺酸盐交换基构成。
3.权利要求2的方法，其中载体底物为琼脂。
4.权利要求1的方法，其中阴离子交换色谱柱由固定在载体底物上的季氨乙基交换基构成。
5.权利要求4的方法，其中载体底物为琼脂。
6.权利要求1的方法还包括将由权利要求1步骤(c)得到的含IL-10级份加入凝胶色谱柱以获得基本上没有高和低分子量不纯物的二聚物IL-10。
7.权利要求6的方法，其中凝胶具有1至600KDa的级份范围。
8.权利要求1的方法，其中IL-10由原核表达体系生产，在纯化前由内含体变性和重折叠。
9.权利要求1的方法，其中IL-10在细胞培养基中由原核细胞分泌。
10.一种分离存在于含IL-10的蛋白级份中的不同IL-10二聚体的方法，包括在不同的IL-10二聚体相互分离的条件下进行含IL-10级份的羟磷灰石色谱。
11.权利要求10的方法，其中存在于蛋白级份中的IL-10二聚体为△0△0，△0△2和△2△2IL-10二聚体，且收集△0△0二聚体。
12.权利要求10的方法，其中存在的IL-10二聚体为非共价键合IL-10二聚体和共价键合IL-10二聚体，其中收集非共价键合IL-10二聚体。
13.一种含在蛋白级份中的不同二聚体，其中不同二聚体具有不同N-末端氨基酸顺序的分离方法，包括在不同的蛋白二聚体相互分离的条件下进行蛋白级份的羟磷灰石色谱。
14.一种含有蛋白级份中的不同蛋白变异体，其中蛋白变异体具有不同的N-末端氨基酸顺序的分离方法，包括在蛋白变异体相互分离的条件下进行蛋白级份的羟磷灰石色谱。
15.一种将含在溶液中的非乙酰化IL-10同二聚体与乙酰化IL-10同二聚体和与乙酰化IL-10异二聚体分离的方法，包括在非乙酰化同二聚体与乙酰化同二聚体和与乙酰化异二聚体分离的条件下，将溶液加入阴离子交换色谱。
全文摘要
本发明公开了一种纯化人白细胞介质-10(IL-10)的方法，该方法包括将含IL-10的溶液进行阳离子交换色谱，阴离子交换色谱，羟磷灰石色谱和凝胶过滤色谱。本发明还包括一种通过将蛋白级份进行羟磷灰石色谱而将存在于蛋白级份中的不同IL-10二聚体相互分离的方法。本发明还包括通过将蛋白级份进行羟磷灰石色谱而将存在于蛋白级份中的N-末端氨基酸序列不同的蛋白质变异体相互分离的方法。
文档编号C07K1/18GK1119018SQ94191392
公开日1996年3月20日 申请日期1994年3月3日 优先权日1993年3月5日
发明者G·维里坎普, S·坎农-卡尔森, J·唐 申请人:先灵公司