gga-mir-146a-5p的抑制物在制备抗j亚群禽白血病病毒感染药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及病毒学和分子生物学领域,具体涉及gga-mir-146a-5p的抑制物在制备抗j亚群禽白血病病毒感染药物中的应用。
背景技术：
2.j亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup j,alv-j)，是致癌性逆转录病毒，于1988年由英国科学家payne及其同事等发现并分离。据报道alv-j是一外源性白血病病毒与内源性e亚群病毒囊膜基因的重组体，在鸡群中可以通过垂直传播和水平传播。我国于1999年首次分离到alv-j，近年来alv-j的宿主范围逐步扩大可以感染我国各品系鸡群，并造成严重危害，已成为我国各种类型鸡群中危害最严重的alv流行亚群。近年来，甚至在其他禽类体内也检测到了alv-j阳性感染。由于alv-j导致鸡的免疫抑制、生长迟缓及多种肿瘤，其传播率也远高于其他alv亚群，并且动物机体对该病毒表现出免疫耐受，并且目前尚无有效疫苗和药物对其进行防治，从而使其控制和根除变得更加困难，因此需要开发针对alv-j防治的新措施。
3.microrna(mirna)是一种非编码rna，长度约为21-23个核苷酸左右，通过直接结合mrna并影响翻译效率或mrna丰度来控制蛋白水平。mirna依靠其成熟体发挥作用。mirna的成熟需要多个步骤，首先在聚合酶的作用下先转录为pri-microrna,大多数mirna的转录是由rna聚合酶ⅱ所介导的。pri-microrna通过两次剪切形成成熟体的mirna。当mirna与靶mrna几乎完全互补时可以导致靶mrna的降解，此现象常见于植物；而在动物中，mirna与靶mrna互补程度较低，可以在不影响靶mrna的表达下抑制翻译。有大量研究表明，mirna参与了动植物各种的生理病理过程，包括发育的调节、细胞的增殖分化与免疫活动的调节、病毒感染的发生发展等几乎所有生命活动。
4.病毒侵入机体后，mirna在病毒与宿主的互作过程中发挥着重要的调节作用。病毒与宿主都可以编码mirna，病毒所编码的mirna有利于帮助病毒规避宿主的免疫反应，而宿主所编码mirna的则对病毒的入侵有着促进或抑制的作用。由于目前尚无有效疫苗和药物对alv-j进行防治，因此开发一种可以有效抑制alv-j复制的mirna抑制物具有潜在的临床应用价值。
技术实现要素：
5.本发明的发明人针对现有技术存在的空白之处，提供了一种gga-mir-146a-5p的抑制物在制备抗alv-j病毒感染药物中的应用，该抑制物为gga-mir-146a-5p的互补序列，其核苷酸序列如seq id no:1所示，该抑制物可以阻断alv-j在细胞中的复制与增殖，可作为alv-j复制抑制剂应用，还可以制备成试剂盒和药物等配合净化应用。为抗alv-j的研究提供了新的思路和理论基础。
6.发明人首先研究了alv-j感染df-1后细胞中gga-mir-146a-5p的表达情况，结果显
146a-5pmimics在蛋白水平促进alv-j的复制。
具体实施方式
20.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法或直接交由基因公司完成；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
21.实施例1 alv-j感染显著上调df-1细胞中gga-mir-146a-5p的表达
22.(1)alv-j感染df-1细胞
23.将生长良好的df-1细胞从细胞瓶中消化下来以1
×
105均匀的铺板，当细胞生长到汇合度达70％时，将alv-j(毒株nx0101 genbank accession number dq115805.1，本领域常用毒株)病毒液置于冰上融化，用[moi]＝1的alv-j感染细胞，同时设未接毒的对照(mock)组，病毒感作1.5h后弃掉病毒液，补充含1％fbs的dmem维持液维持细胞的生长，于37℃5％co2条件下培养，于接毒后72h收集细胞。
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(2)总rna提取，mirna第一链cdna的合成及荧光定量pcr
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使用trnzol试剂(购自北京tiangen公司)提取总rna，对于df-1细胞直接在培养板中加入trnzol universal试剂裂解细胞，对于组织取50mg组织加入1ml trnzol universal试剂，用匀浆仪进行匀浆处理。使用mircute增强型mirna cdna第一链合成试剂盒(购自北京tiangen公司)进行mirna反转录，每20ml体系中加入1ng rna；反转录程序为42℃60min，95℃3min。将反转录得到的cdna作为模板，使用mirna增强型mirna荧光定量检测试剂盒(sybr green)(购自北京tiangen公司)通过qpcr检测gga-mir-146a-5p的相对表达量，按照试剂盒说明书配置反应体系和设定反应程序。
[0026]
实验中的每个样品均设置3个重复，以u6为内参基因，其中u6的上游引物序列见seq id no:3(ctcgcttcggcagcaca),下游引物序列见seq id no:4(aacgcttcacgaatttgcgt)；gga-mir-146a-5p上游引物序列见seq id no:5(gtgagaactgaattccatgggtt)，下游引物为试剂盒中通用下游引物，用2-δδct
法比较相对表达水平，结果如图1所示alv-j感染显著上调了df-1细胞中gga-mir-146a-5p的表达。
[0027]
为了进一步研究gga-mir-146a-5p模拟物和抑制物与alv-j复制的关系，接下来的实施例将对gga-mir-146a-5p模拟物和抑制物与alv-j复制的关系进行研究。
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实施例2 gga-mir-146a-5p抑制物和模拟物对alv-j复制的影响
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为了检测gga-mir-146a-5p模拟物转染是否会影响alv-j的复制，我们合成了gga-mir-146a-5p的模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor),
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gga-mir-146a-5p抑制物(inhibitor),其核苷酸序列如seq id no:1所示(aacccauggaauucaguucuca，由吉玛公司合成)，
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gga-mir-146a-5p模拟物(mimics),其核苷酸序列如seq id no:2所示(ugagaacugaauuccauggguu，由吉玛公司合成)；
[0032]
df-1细胞转染inhibitor或mimics 24h后接种alv-j，病毒感染48h后，收集细胞，提取细胞的蛋白质和rna，通过western blot及qrt-pcr的方法分别从蛋白和rna的水平检测alv-j的表达量。
[0033]
(1)gga-mir-146a-5p抑制物和模拟物转染
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gga-mir-146a-5p抑制物和模拟物转染前一天，将生长良好的df-1细胞从细胞瓶中消化下来并通过细胞计数板对细胞悬液进行计数，以每孔1
×
105均匀的铺板，当细胞的汇合度达到70％时进行转染。按照lipofectamine 3000(购自美国invitrogen公司)的转染方法，将gga-mir-146a-5p抑制剂或模拟物与lipofectamine 3000共同孵育制备混合液，将混合液加入细胞含10％fbs(胎牛血清，购自美国gibico公司)的dmem培养基(高糖型，购自美国hyclone公司)中，37℃5％co2条件下培养24h。
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(2)alv-j感染
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将alv-j(毒株nx0101 genbank accession number dq115805.1)病毒液置于冰上融化，df-1细胞转染24h后，用[moi]＝1的alv-j感染细胞，感染48h后收集细胞，使用trizol试剂(购自美国invitrogen公司)提取细胞总rna。
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(3)alv-j rna定量检测
[0038]
rna的反转录步骤依据fastking gdna dispelling rt supermix试剂盒(购自北京tiangen公司)说明书进行，每20ml体系中加入1ng rna；反转录程序为42℃15min，95℃3min。将反转录得到的cdna作为模板，使用real-time pcr试剂盒(购自takara公司)通过qpcr检测alv-j病毒载量。按照试剂盒说明书配置反应体系和设定反应程序。
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实验中的每个样品均设置3个重复，以gapdh为内参基因，用2-δδct
法比较相对表达水平。gapdh的上游引物序列见seq id no:6(gaacatcatcccagcgtcca)，下游引物序列见seq id no:7(cggcaggtcaggtcaacaac)；alv-j gp85上游引物序上游引物序列见seq id no:8(tgcgtgcgtggttattatttc)，下游引物序列见seq id no:9(aatggtgaggtcgctgactgt)。
[0040]
(4)alv-j蛋白定量检测
[0041]
利用western blot方法检测各组细胞内alv-j囊膜蛋白gp85的表达水平，内参基因选择β-actin，具体步骤如下：
[0042]
对于细胞样品：细胞用预冷的pbs洗涤三次，在ripa解液中加入pmsf，使得其终浓度为1mm。在冰上用裂解液裂解细胞约5min，用移液器反复吹打，充分裂解后收集到ep管中；4℃，12000
×
g离心5min，取上清，bca法测量蛋白浓度。蛋白变性：取适量的蛋白样品，加入5
×
的sds蛋白质上样缓冲液，混匀后于100℃水浴中变性5min；
[0043]
配制合适浓度的分离胶与浓缩胶，在电泳槽中加入足量1
×
的电泳缓冲液；每孔加入蛋白样品20g；蛋白marker加入10l；接通电源，浓缩胶处使用80v电压电泳30min，待染料进入分离胶与浓缩胶的分界线时，调整电压将至110v电泳1.5h左右，至溴酚蓝指示剂至分离胶的底部，关闭电源；
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电泳结束后撬开玻璃板，取下凝胶。根据目的蛋白大小，切取适宜的胶块。将pvdf膜剪至如凝胶大小并在在甲醇中活化约1min，然后置于电转缓冲液中浸泡约5min；按三明治法安装转印装置：即负极夹-海绵垫-三层滤纸-凝胶-pvdf膜-三层滤纸-海绵垫-正极夹，确保凝胶与pvdf膜之间没有气泡；将转印装置置于转移槽，使用快速转膜液(购自新赛美公司)400ma恒流转膜30min，将蛋白转至pvdf膜上。
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转膜结束后取下pvdf膜，tbst缓冲液漂洗5min，使用含5％脱脂奶粉的tbst溶液37℃封闭2h；封闭结束后，tbst缓冲液洗涤3次，每次10min。用特异性单克隆抗体4℃孵育过夜，tbst缓冲液洗涤3次，每次10min。加入hrp标记的羊抗鼠igg二抗，37℃孵育1h,tbst缓冲
液洗涤3次。
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曝光显色:避光条件下配制适量显影液，a液：b液＝1：1，用显影液覆盖整张膜，在ecl化学发光显影仪中检测蛋白信号。
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结果如下：与转染inhibitor阴性对照组相比在df-1细胞中转染gga-mir-146a-5pinhibitor后可以在rna水平显著抑制alv-j的复制(如图2所示)，同时在蛋白水平也显著抑制了alv-j的复制(如图3所示)。与转染mimics阴性对照组相比在df-1细胞中转染gga-mir-146a-5p mimics后可以在rna水平显著促进alv-j的复制(如图4所示)，同时在蛋白水平也显著促进了alv-j的复制(如图5所示)。说明gga-mir-146a-5p抑制物(inhibitor)有抑制alv-j复制的功能，可作为alv-j复制抑制剂应用，还可以制备成试剂盒和药物等配合净化应用，为抗alv-j的研究提供了新的思路和理论基础。