一种产酸菌jc-h及其应用与产酸菌jc-h的培养、鉴定方法
技术领域
1.本发明属于环境微生物技术领域，涉及一种产酸菌jc-h及其应用，还涉及该产酸菌jc-h的培养、鉴定方法。


背景技术：

2.矿产资源是人类生产、生活以及社会经济快速发展的物质基础，也是保障国家安全、维护国家发展利益的战略性资源。但是，不合理的开采会造成开采区及周围自然环境的极大破坏，每年的金属及非金属尾矿排放量达3亿吨，尾矿的累积堆存量近200亿吨。矿区中尾矿、废渣堆积在自然环境中，使尾矿中重金属渗透到土壤环境中的种类和数量也随之增多，不断向周边环境释放重金属，给当地自然生态环境和生产生活带来了较大的生态健康风险。近年来，我国发生的重金属污染事件也是屡见不鲜，如血铅事件、镉米事件等问，也使得重金属污染越来越受到广泛关注。
3.当前针对矿区重金属污染土壤资源进行修复的过程中，主要使用的是物理修复、化学修复和生物修复。在实际修复过程中：物理方法主要有换土客土、热处理法、电动修复等方法，然而物理方法一般需要花费大量的人力、物力、财力等，且一般仅限于小面积的重金属污染处理；化学方法主要有浸提、改良剂固定化、沉淀、离子交换等方法，化学修复方法虽然操作简单，也可以原位修复，但普遍会带来二次污染，甚至破坏土壤结构，且耗费较大。因此，这几种方法在技术上、经济上难以实现，也难以为公众所接受，面对大规模的重金属污染更是难以应用。而生物修复生物方法被认为是环境重金属污染治理的最具前景的新方法，重金属的生物修复就是利用生物作用，削减、净化环境中的重金属或降低重金属的毒性。
4.迄今为止，微生物修复正在引起国内外专家的关注，所以研究利用微生物修复矿区重金属污染土壤具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种产酸菌jc-h及其应用与产酸菌jc-h的培养、鉴定方法，为生物产酸并改良尾矿随意处理导致周边区域重金属污染土壤问题提供了菌种资源。
6.本发明所采用的技术方案是，一种产酸菌jc-h，该菌株命名为：黑曲霉(aspergillus niger)jc-h，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：21424。
7.产酸菌jc-h的培养方法，具体为：
8.步骤1、菌株的分离培养
9.采集受重金属污染严重的土壤作为样品；
10.制备查式培养基：将蔗糖30g、nano
3 3g、k2hpo
4 1g、kcl 0.5g，feso4·
7h2o 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1l，混合后，于121℃高温灭菌20min，接着倒平板待其凝固，制成无菌的查式培养基，用来进行分离培养；
11.将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3-5d；
12.步骤2、鉴别产酸菌株
13.制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入查式固体培养基中，在121℃高温灭菌20min，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
14.将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落，划线培养于产酸鉴别培养基；
15.培养3-5d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑选具有产酸能力的菌株多次接种于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；
16.当添加重金属的查式培养基中，添加zn
2+
浓度≤300mg/l，或pb
2+
浓度≤2000mg/l，或cd
2+
浓度≤300mg/l对产酸菌jc-h的产酸效果基本无影响。
17.产酸菌jc-h在产酸中的应用，利用发酵培养基测定产酸菌jc-h的产酸效率，所述发酵培养基采用蔗糖100g，nano
3 1.5g，kh2po
4 0.5g，kcl 0.025g，mgso4·
7h2o 0.025g，酵母浸膏1.6g，调节ph为6，于121℃灭菌20min；
18.向培养后产酸菌jc-h培养基中加入无菌水，用无菌涂布棒，轻轻刮菌落表面，获得菌株孢子，再通过血球计数板观察孢子数量，加无菌水，将菌株孢子稀释，按3.6
×
106个/50ml的比例加入发酵培养基，于30℃、160rpm的转数下在恒温振荡培养箱中进行培养。
19.产酸菌jc-h的鉴定方法，包括：利用18s rrna基因序列对菌种鉴定和发酵液中有机酸含量的测定。
20.利用18s rrna基因序列对菌种鉴定具体为：
21.目标菌株18s rrna基因序列的pcr扩增：
22.通过真菌通用引物its1(5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
)和its4(5
′‑
tcctccgcttattgatatgc-3
′
)进行pcr扩增。在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目标菌株的18srrna基因序列。
23.发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定具体为：
24.首先进行0.1mol/l naoh标准溶液、1％酚酞指示剂的配置。然后准确吸取10ml样品发酵液，转移到100ml容量瓶中，加蒸馏水至100ml刻度并摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20ml放入100ml三角瓶中，加入1％酚酞2滴，用0.1mol/l naoh标准溶液滴定至初显粉色在0.5min内不褪色为终点，记下naoh用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗naoh的含量。
25.本发明的有益效果是：
26.产酸菌jc-h的耐重金属效果：
27.当添加重金属的查式培养基中，采用打孔器接菌的方式，于30℃培养真菌，观察其菌株抑制率。抑制率(％)＝(空白平板直径-重金属平板直径)/(空白直径-3mm)。当添加重金属zn
2+
浓度高于300mg/l，或pb
2+
浓度高于2000mg/l，或cd
2+
浓度高于300mg/l时，才会对产酸菌jc-h产生严重抑制作用。
28.产酸菌jc-h的耐重金属胁迫的产酸能力：
29.未进行重金属处理时，产酸菌jc-h培养液初始ph值为5.44，产酸菌jc-h培养48h后
培养液ph值降至最小值4.86，菌株培养液ph值下降了0.58；重金属胁迫下，随重金属浓度的增加，产酸菌jc-h的初始培养液ph值降低、ph的变化幅度变小，培养液在发酵后期出现ph上升趋势。在重金属pb胁迫时，产酸菌jc-h在200mg/lpb
2+
处理该菌株27h后培养液ph值下降了0.53；重金属zn胁迫时，产酸菌jc-h在100mg/lzn
2+
处理该菌株24h后培养液ph值下降了0.87，说明低浓度的zn
2+
对菌株产酸具有促进作用，但随着重金属添加量的升高，菌株产酸能力也下降；在重金属cd胁迫时，产酸菌jc-h在50mg/l cd
2+
处理该菌株63h后培养液ph值下降了0.75，说明低浓度的zn
2+
、cd
2+
对菌株产酸具有促进作用，但随着重金属添加量的升高，菌株产酸能力也下降；
30.在不同重金属浓度下产酸菌jc-h仍具有产酸能力。本发明的产酸菌jc-h的筛选与鉴定方法，能够为生物产酸提供菌种资源。
附图说明
31.图1是本发明的产酸菌图；
32.图2是本发明产酸菌基于18s rrna基因序列构建的系统发育树；
33.图3是本发明产酸菌的生长曲线；
34.图4是本发明产酸菌的不同发酵时期培养基中ph变化图；
35.图5是本发明中不同浓度重金属zn、cd、pb对产酸菌生长的影响；
36.图6是本发明中不同浓度重金属pb对产酸菌ph的影响；
37.图7是本发明中不同浓度重金属cd对产酸菌ph的影响；
38.图8是本发明中不同浓度重金属zn对产酸菌ph的影响；
39.图9不同温度对产酸菌jc-h发酵液ph的影响图；
40.图10不同温度对产酸菌jc-h发酵液消耗naoh量的影响图；
41.图11不同初始ph对产酸菌jc-h发酵液ph的影响图；
42.图12不同初始ph对产酸菌jc-h发酵液消耗naoh量的影响图；
43.图13不同转速对产酸菌jc-h发酵液ph的影响图；
44.图14不同转速对产酸菌jc-h发酵液消耗naoh量的影响图。
45.保藏信息：产酸菌已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no：21424。命名为：黑曲霉(aspergillus niger)jc-h。
具体实施方式
46.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
47.一种产酸菌jc-h，该菌株命名为：黑曲霉(aspergillus niger)jc-h，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：21424。
48.产酸菌jc-h的培养方法，具体为：
49.步骤1、菌株的分离培养
50.采集受重金属污染严重的土壤作为样品；目的是从中分离具有产酸能力的微生物。
51.制备查式培养基：将蔗糖30g、nano
3 3g、k2hpo
4 1g、kcl 0.5g，feso4·
7h2o 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1l，接着倒平板待其凝固，制成无菌分离培养基备用；
52.将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，具体的：将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3-5d。吸取不同梯度的土壤悬液需换用不同的吸管。
53.取稀释后的土壤悬液0.5ml；用无菌涂布棒均匀涂布土壤悬液于查式培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3-5d；
54.步骤2、鉴别产酸菌株
55.制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入查式培养基，在121℃高温灭菌20min，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
56.将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落划线培养于产酸鉴别培养基；
57.培养3-5d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑取具有产酸能力的菌株多次划线于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；获得单一产酸菌株之后保藏于4℃冰箱中，待后续实验使用。
58.菌株形态观察和生理生化
59.菌落表面呈圆形，中间黑色呈厚绒毛状，菌丝为黑褐色，长有大量黑褐色孢子。显微镜下观察，菌丝发达，多分枝；分生孢子梗细长，分生孢子头为穗球形，上面有大量分生孢子，分生孢子梗末端有球形顶囊。
60.如图2所示，产酸菌jc-h基于18s rrna基因序列构建的系统发育树，简介获得步骤：
61.系统进化分析：将测序结果与genbank上已登录的基因序列进行比对，发现与黑曲霉(aspergillus niger)同源性最高，为100％。利用mega 5软件进行多序列比对分析，neighbor-joining法构建系统发育树。综合生理生化特征和分子生物学特性，确定产酸菌jc-h为黑曲霉(aspergillus niger)。
62.如图3可知，产酸菌jc-h在查式液体培养基中生长延滞期较短，对数生长期为2-3.5d，在培养到3.5d后处于生长的平稳期。生长3.5d以后菌株的生物量达到0.11g
·
ml-1
。产酸菌jc-h在培养0-5d时，ph变化幅度为5.44降低至4.86，菌株培养液ph值下降了0.58；48h后发酵液ph逐渐上升。
63.产酸菌jc-h在产酸中的应用，将产酸菌jc-h孢子以3.6
×
106个/50ml的比例加入发酵培养基进行恒温震荡培养，于温度为30℃、ph为6、160rpm条件下产酸效率最高。
64.重金属胁迫下，随重金属浓度的增加，产酸菌jc-h的初始培养液ph值降低、ph的变化幅度变小，培养液在发酵后期出现ph上升趋势。在重金属pb胁迫时，产酸菌jc-h在200mg/l pb
2+
处理该菌株27h后培养液ph值下降了0.53；重金属zn胁迫时，产酸菌jc-h在100mg/l zn
2+
处理该菌株24h后培养液ph值下降了0.87，说明低浓度的zn
2+
对菌株产酸具有促进作用，但随着重金属添加量的升高，菌株产酸能力也下降；在重金属cd胁迫时，产酸菌jc-h在50mg/l cd
2+
处理该菌株63h后培养液ph值下降了0.75，说明低浓度的cd
2+
对菌株产酸具有促进作用，但随着重金属添加量的升高，菌株产酸能力也下降；
65.产酸菌jc-h的鉴定方法，包括：利用18s rrna基因序列对菌种鉴定和发酵培养基
的发酵液中有机酸含量的测定。
66.利用18s rrna基因序列对菌种鉴定具体为：
67.目标菌株18s rrna基因序列的pcr扩增：
68.通过真菌通用引物its1(5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
)和its4(5
′‑
tcctccgcttattgatatc-3
′
)进行pcr扩增。在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目标菌株的18s rrna基因序列。
69.发酵培养基的发酵液中有机酸含量的测定具体为：
70.首先进行0.1mol/l naoh标准溶液、1％酚酞指示剂的配置。然后准确吸取10ml样品发酵液，转移到100ml容量瓶中，加蒸馏水至100ml刻度并摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20ml放入100ml三角瓶中，加入1％酚酞2滴，用0.1mol/l naoh标准溶液滴定至初显粉色在0.5min内不褪色为终点，记下naoh用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗naoh的含量。
71.产酸菌jc-h对重金属cd、pb和zn的耐受性：
72.通过观测产酸菌jc-h在不同浓度的cd
2+
、pb
2+
和zn
2+
平板上培养10d后的菌落直径大小，考察这两株产酸真菌对重金属的耐受性。随着重金属离子浓度的增加，产酸菌jc-h受到不同程度的抑制情况，cd
2+
浓度为100mg/l时对产酸菌jc-h的抑菌率达到了80％左右，显著抑制真菌生长，cd
2+
浓度在400、500mg/l时完全抑制；在pb
2+
浓度为200、300mg/l时，对产酸菌jc-h的抑制效果较少，当pb
2+
在高浓度2000mg/l的时候抑制率达到80％以上；在zn
2+
浓度上升至400mg/l时对菌株jc-h的抑菌率达到了95％。
73.产酸菌jc-h在未添加重金属的发酵培养基中初始ph值为5.44，然后ph逐渐下降，48h后上升。随重金属浓度的增加，菌株jc-h的初始培养液ph值降低、ph变化幅度变小、到达最低ph时间延长，培养液在发酵后期出现ph上升趋势。重金属pb胁迫时，ph值降幅最大者为菌株jc-h，在pb浓度为200mg/l处理该菌株27h后培养液ph值下降了0.53；重金属cd胁迫时，在cd浓度为50mg/l处理该菌株63h后培养液ph下降了0.75；重金属zn胁迫时，在zn浓度为100mg/l处理该菌株30h后培养液ph值下降了0.83。
74.说明产酸菌jc-h耐重金属效果pb
2+
》zn
2+
》cd
2+
。耐不同重金属时产酸菌jc-h仍具有产酸能力。
75.采用单因素实验法分析不同温度、初始发酵液ph及转速对菌株发酵产酸的影响情况。
76.发酵培养基采用蔗糖100g，nano
3 1.5g，kh2po
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.025g，kcl 0.025g，酵母浸膏1.6g，蒸馏水1l，ph调至5，121℃灭菌20min；按3.6
×
106个/50ml的比例加入发酵培养基中，在恒温振荡培养箱中以160rpm，保持30℃培养；
77.1.温度
78.温度设置梯度为25℃、28℃、30℃、32℃和35℃，分别测定不同温度下发酵液中ph的变化与发酵液naoh的消耗量，来确定最佳产酸的温度条件。
79.如图8-9所示，当培养温度为30℃时，发酵液ph下降能力最大，且消耗naoh量最多，所以当培养温度达到30℃的时候产酸菌jc-h产酸能力最强。
80.2.ph
81.初始发酵液ph设置梯度为4、5、6、7和8，分别测定不同初始发酵液ph下发酵液中ph
的变化与发酵液naoh的消耗量，来确定最佳产酸的初始发酵液ph条件。
82.如图10-11所示，当培养初始发酵液ph为6时，发酵液ph下降能力最大，且消耗naoh量最多，所以当培养初始发酵液ph达到6的时候产酸菌jc-h产酸能力最强。
83.3.转速
84.转速设置梯度为100rpm、120rpm、140rpm、160rpm和180rpm，分别测定不同转速下发酵液中ph的变化与发酵液naoh的消耗量，来确定最佳产酸的转速条件。
85.如图12-13所示，当培养转速为160rpm时，发酵液ph下降能力最大，且消耗naoh量最多，所以当培养初始发酵液转速达到160rpm的时候产酸菌jc-h产酸能力最强。