3，1-苯并噁嗪-4-酮为原料，经与与氘代溴苯格式试剂反应、水解、酰化、环和、甲基化后得到稳定地西泮-d5和地西泮-d8。上述几种方法均存在合成步骤长，且制备稳定同位素标记格式试剂条件要求苛刻，技术难度大，使用剧毒且致癌的甲基化试剂硫酸二甲酯或碘甲烷等缺点。
5.因此，亟需开发一种反应路线短、操作简单、条件温和、避免使用剧毒甲基化试剂且总收率高、成本低廉的稳定同位素标记地西泮的制备方法，以满足该化合物在我国食品安全检测方面的日益增长的应用需求。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种适用于食品安全检测用稳定同位素标记地西泮的制备方法。该合成方法原料易得、反应路线短、操作简单、条件温和、避免使用有毒及致癌的甲基化试剂；最终产品总收率高，化学纯度高，同位素丰度不稀释，有效降低了产品成本。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：1.一种稳定同位素标记地西泮内标试剂的制备方法，该稳定同位素标记的地西泮内标试剂的化学结构如式(labeled-diazepam)所示：
[0008][0009]
其中r为h或d，*为
12
c或
13
c；其特征在于，其制备步骤总路线为：
[0010][0011]
其中r为h或d，*为
12
c或
13
c，制备步骤如下：
[0012]
(1)在催化剂、配体、添加剂、有机溶剂存在条件下，加入稳定同位素标记苯硼酸，
然后加入2-氨基-5-氯苯甲腈，在30℃～120℃条件下，反应12～48小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记2-氨基-5-氯二苯甲酮；
[0013]
该步骤反应如下所示：
[0014][0015]
其中稳定同位素标记苯硼酸的化学结构如式(i)所示，稳定同位素标记2-氨基-5-氯二苯甲酮的化学结构如式(ii)所示，其中r为h或d，*为
12
c或
13
c；
[0016]
(2)将稳定同位素标记2-氨基-5-氯二苯甲酮溶于有机溶剂中，加入氯乙酰氯，在20℃～80℃条件下，反应1～10小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记2-氯乙酰胺基-5-氯二苯甲酮；
[0017]
该步骤反应如下所示：
[0018][0019]
其中稳定同位素标记2-氯乙酰胺基-5-氯二苯甲酮的化学结构如式(ⅲ)所示，其中r为h或d，*为
12
c或
13
c；
[0020]
(3)将稳定同位素标记2-氯乙酰胺基-5-氯二苯甲酮溶于有机溶剂中，加入乌洛托品和铵盐，在30℃～120℃条件下反应1～8小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液旋干，加入水，用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2h-1,4-苯并二氮-2-酮；
[0021]
该步骤反应如下所示：
[0022][0023]
其中稳定同位素标记7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2h-1,4-苯并二氮-2-酮的化学结构如式(ⅳ)所示，其中r为h或d，*为
12
c或
13
c；
[0024]
(4)将稳定同位素标记7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2h-1,4-苯并二氮-2-酮溶于有机溶剂中，加入对甲苯磺酸甲酯和缚酸剂，在0℃～100℃条件下反应2～12小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，过滤后加入水，用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到纯品得到稳定同位素标记地西泮。
[0025]
该步骤反应如下所示：
[0026][0027]
其中稳定同位素标记地西泮的化学结构如式(labeled-diazepam)所示，其中r为h或d，*为
12
c或
13
c。
[0028]
所述步骤(1)中，催化剂为醋酸钯、氯化钯、双(三苯基膦)二氯化钯、四(三苯基膦)钯、双(二苯基膦苯基醚)二氯化钯、双(二苯基膦二茂铁)二氯化钯、乙酰丙酮钯、三氟乙酸钯、双(二苯基磷)乙烷二氯化钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、三(二亚苄基丙酮)二钯氯仿加合物中的一种或几种；配体为2,2
’‑
联吡啶、4,4
’‑
二甲基-2,2
’‑
联吡啶、5,5
’‑
二甲基-2,2
’‑
联吡啶、4,4
’‑
二甲氧基-2,2
’‑
联吡啶、1,10-菲罗啉、4,7-二甲基-1,10-菲罗啉、4,7-二苯基-1,10-菲罗啉中的一种或几种；添加剂为盐酸、硫酸、冰醋酸、甲酸、三氟乙酸、二氯乙酸、甲烷磺酸、对甲苯磺酸、苯甲酸中的一种或几种；溶剂为四氢呋喃、二氧六环、甲苯、二甲苯、2-甲基四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、苯、氯苯中的一种或几种；稳定同位素标记的苯硼酸为氘标记的苯硼酸、
13
c标记的苯硼酸或氘和
13
c双标记的苯硼酸；反应温度为30℃～120℃；反应时间为12～48小时。
[0029]
所述步骤(2)中，有机溶剂为四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、苯、甲苯、二甲苯、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺中的一种或几种；反应温度为20℃～80℃；反应时间为1～10小
时。
[0030]
所述步骤(3)中，有机溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇中的一种或几种；所用铵盐为氯化铵、甲酸胺、乙酸铵、硫酸铵中的一种或几种；反应温度为30℃～120℃；反应时间为1～8小时。
[0031]
所述步骤(4)中，有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、n，n-二甲基甲酰胺、甲苯、四氢呋喃、二氧六环中的一种或几种；缚酸剂为三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、三乙醇胺、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾、碳酸铯中的一种或几种；反应温度为0℃～100℃；反应时间为2～12小时。
[0032]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：该合成方法原料简单易得、合成步骤短、操作简单、反应条件温和、并且避免使用剧毒及致癌的甲基化试剂，有效降低了人员健康及环境污染风险。本制备方法得到的食品安全检测用稳定同位素标记硝西泮对我国相关的食品安全监管检测工作具有重要意义。
[0033]
本发明的临床治疗药物监测用稳定同位素标记奥沙西泮内标试剂的制备方法所使用的原料简单易得、反应条件温和、最终产物化学纯度高、总收率高，有效降低了人员健康及环境污染风险，且同位素丰度基本上不稀释。该稳定同位素标记地西泮制备路线及方法均未有文献报道，制备的稳定同位素标记地西泮化学纯度大于98％，同位素丰度大于98％。本制备方法得到的稳定同位素标记地西泮满足液相色谱串联质谱法检测用内标试剂的要求，对我国相关的食品安全监管检测工作具有重要意义。
附图说明：
[0034]
图1：2-氨基-5-氯二苯甲酮-d5的1h nmr图
[0035]
图2：2-氨基-5-氯二苯甲酮-d5的lc-ms图
[0036]
图3：2-氯乙酰胺基-5-氯二苯甲酮(苯基-d5)的1h nmr图
[0037]
图4：7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2h-1,4-苯并二氮-2-酮(苯基-d5)的1h nmr图
[0038]
图5：7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2h-1,4-苯并二氮-2-酮(苯基-d5)的lc-ms图
[0039]
图6：地西泮(苯基-d5)的1h nmr图
[0040]
图7：地西泮(苯基-d5)的
13
c nmr图
[0041]
图8：地西泮(苯基-d5)的hrms图
[0042]
图9：地西泮(苯基-d5)的uplc图
具体实施方式
[0043]
下面结合实施例及其附图进一步叙述本发明，但它并不是对本发明的范围的任何限制。
[0044]
实施例1：2-氨基-5-氯二苯甲酮(苯基-d5)制备
[0045][0046]
在500ml三口瓶中，加入氘代苯硼酸(12.7g，0.1mol)、2-氨基-5-氯二苯甲酮(7.63g，0.05mol)、催化剂四(三苯基膦)钯(2.89g，2.5mmol)、配体4,4
’‑
二甲基-2,2
’‑
联吡啶(920mg，5mmol)、添加剂三氟乙酸(57g，0.5mol)和四氢呋喃：水＝1：1的混合溶剂(250ml)；在90℃下反应24小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应液冷却至室温，加入200ml水，用乙酸乙酯(3
×
300ml)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记2-氨基-5-氯二苯甲酮(苯基-d5)(10.9g，收率92％)。1h nmr(dmso-d6，600mhz)：δ7.34(dd，1h)，7.21(s，2h)，7.19(d，1h)，6.90(d，1h)，参见附图1；lc-ms(esi+)237[m+h]
+
，参见附图2。
[0047]
实施例2：2-氯乙酰胺基-5-氯二苯甲酮(苯基-d5)的制备
[0048][0049]
在100ml三口瓶中，加入2-氨基-5-氯二苯甲酮(苯基-d5)(2.37g，10mmol)、氯乙酰氯(1.69g，15mmol)和干燥的二氧六环(20ml)；充入氮气，在20℃条件下反应12小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，加入20ml水，用乙酸乙酯(3
×
30ml)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记2-氯乙酰胺基-5-氯二苯甲酮(苯基-d5)(2.97g，收率95％)。1h nmr(dmso-d6，600mhz)：δ10.50(s，1h)，7.70(d，2h)，7.44(t，1h)，4.06(s，1h)，参见附图3。
[0050]
实施例3：7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2h-1,4-苯并二氮-2-酮(苯基-d5)的制备
[0051][0052]
在50ml三口瓶中，加入稳定同位素标记2-氯乙酰胺基-5-氯二苯甲酮(苯基-d5)(3.13g，10mmol)、乌洛托品(2.80g，20mmol)、氯化铵(1.07g，20mmol)、甲醇(20ml)；在氮气保护下，加热至回流，并在该温度反应24小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，减压蒸馏除去
溶剂，加入20ml水，用乙酸乙酯(3
×
30ml)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2h-1,4-苯并二氮-2-酮(苯基-d5)(2.97g，收率95％)。1h nmr(dmso-d6，600mhz)：δ9.41(s，1h)，7.45(dd，1h)，7.30(dd，1h)，7.15(dd，1h)，参见附图4；lc-ms(esi+)276[m+h]
+
，参见附图5。
[0053]
实施例4：地西泮(苯基-d5)的制备
[0054][0055]
在100ml三口瓶中，加入稳定同位素标记7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2h-1,4-苯并二氮-2-酮(苯基-d5)(1.38g，5mmol)、对甲苯磺酸甲酯(1.12g，6mmol)、n，n-二异丙基乙胺(1.29g，10mmol)、二氯甲烷(20ml)；在氮气保护下，40℃条件下反应8小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，加入30ml水，用二氯甲烷(3
×
30ml)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记地西泮(苯基-d5)(1.32g，收率91％)。1hnmr(dmso-d6，600mhz)：δ7.75(dd，j＝24hz，1h)，7.64(d，j＝18hz，1h)，7.23(d，j＝6hz，1h)，4.60(d，j＝18hz，1h)，3.81(d，j＝18hz，1h)，3.31(s，1h)，详见附图6；
13
c nmr(dmso-d6，150mhz)：δ169.68，168.51，143.05，138.23，131.91，129.94，129.34，128.22，124.35，57.15，34.77，详见附图7；hrms(esi+)290.10947[m+h]，详见附图8；hplc测得化学纯度＝99.36％，详见附图9。同位素丰度＝98.70％d，详见表1。
[0056]
表1地西泮-d5的同位素丰度
[0057][0058]
质量标准满足食品安全检测用液相色谱串联质谱法所需稳定同位素内标试剂要求。
[0059]
13
c标记的稳定同位素标记地西泮合成步骤同上述实施例中稳定同位素标记地西泮(苯基-d5)的合成路线。
[0060]
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。