5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用
1.本技术是2018年07月13日提交的，申请号为201810772331.5，发明名称为“5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及5-氨基乙酰丙酸合成酶的突变体及其宿主细胞和应用。


背景技术：

3.5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，ala)是生物体合成血红素、叶绿素、vb12等四吡咯化合物的前体，广泛存在于动物、植物和微生物中。ala在医药、农业、饲料和保健食品等领域应用广泛，是极具开发价值的高附加值生物基化学品。目前ala主要通过化学合成法生产，原料成本和污染物排放量高，导致其生产成本高昂，限制了其在农业、饲料等领域的规模化应用。近年来，通过微生物发酵生产ala已经得到了产业化应用。ala的生物合成途径主要有两条，一条是在ala合成酶的作用下以琥珀酰coa和甘氨酸为前体合成ala，称为c4途径，另一条是以谷氨酰trna为前体通过两步反应合成ala，称为c5途径。由于只涉及一步酶促催化反应，目前c4途径被广泛用于ala高产工程菌株的构建。
4.ala合成酶是c4途径合成ala以及四吡咯化合物的关键酶和限速酶，其酶学性质的好坏直接影响ala合成的效率。近年来，包括放射形土壤杆菌(agrobacterium radiobacter，cn1322132c)、嗜酸柏拉红菌(rhodoblastus acidophilus，cn1974758b)、类球红细菌(rhodobacter sphaeroides，cn103146694b)、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris，cn103981203b)等大量不同来源的ala合成酶被克隆鉴定并用于ala高产菌株的构建。然而，上述ala合成酶均为不同生物体内天然存在的酶源，本身酶学性质存在热稳定性差(meng et al.biotechnology letters,2015,37(11):2247-2253)等问题，限制了其在工业微生物领域中的应用。嗜热菌来源的ala合成酶虽然具有较高的热稳定性，但是其比活力或底物亲和力则大幅低于上述常用的ala合成酶，(meng et al.biotechnology letters,2015,37(11):2247-2253)难以在工程菌中应用。
5.近年来，随着酶工程和蛋白质工程技术的快速发展，通过理性设计提高酶的催化活性等性质已被广泛应用。但是目前关于在ala合成酶的理性设计和改造方面的研究并不多，仅有的报道主要涉及真核生物来源的ala合成酶，turbeville等将两个小鼠来源的ala合成酶融合表达后可提高其催化效率(turbeville et al.archives of biochemistry&biophysics,2011,511(1):107-117)，lendrihas等通过构建小鼠红细胞中ala合成酶ii的突变体库，筛选得到了酶活提高的ala合成酶突变体(lendrihas et al.journal of biological chemistry,2010,285(18):13704)。上述研究虽然获得了酶活提高的ala合成酶，但并未研究突变酶的热稳定性，且没有用于ala的生物合成。
6.此外，作为ala合成过程中的关键酶，ala合成酶活性的提高可以加快工程菌ala合成的催化效率，减少自身蛋白合成和降解过程中能量的损耗，进而提升工程菌的稳定性和
生产性能，降低ala生产成本，对促进ala在农牧等领域的应用有重要的价值。
7.因此，本领域急需开发活性高的ala合成酶，以实现ala的低成本生物法生产。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种各性能得到全面提升的ala合成酶，以及利用得到的ala合成酶进行ala生产的方法。
9.在第一方面，本发明提供一种ala合成酶，
10.a)所述ala合成酶的氨基酸序列中在对应于seq id no:1所示氨基酸序列的以下一个或多个位点的氨基酸残基发生突变：第15位、第29位、第39位、第176位、第206位、第236位、第293位、第304位；
11.b)具有a)所限定的序列，但在上述位点之外通过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ala合成酶功能的由a)衍生的ala合成酶；或
12.c)具有a)所限定的序列，经过在a)所限定的序列的任一端的一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的缺失或添加，优选添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ala合成酶功能的由a)衍生的ala合成酶。
13.在优选的实施方式中，与氨基酸序列如seq id no:1所示的ala合成酶相比，所述ala合成酶的比活力升高30％以上，优选升高50％以上，更优选升高100％以上，最优选升高150％以上。
14.在具体的实施方式中，a’)所述ala合成酶的氨基酸序列在对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第15位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：lys、arg、asn、gln，优选lys或arg；
15.或第29位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：gln、arg、lys、asn、tyr，优选gln或arg或tyr；
16.或第39位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、phe、arg、lys、asn、gln，优选tyr或phe或arg；
17.或第176位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：asn、lys、asp、gln、arg，优选asn或lys或asp；
18.或第206位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、phe、lys、arg、asn、gln，优选tyr或phe；
19.或第236位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：asp、asn、arg、lys、gln，优选asp或asn或arg；
20.或第293位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、lys、arg、asn、gln，优选tyr；
21.或第304位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：met、gln、lys、arg、asn，优选met或gln；
22.b’)具有a)所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，
且基本具有a)所限定的ala合成酶功能的由a)衍生的ala合成酶；或
23.c’)具有a)所限定的序列，经过在a)所限定的序列的任一端的一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的缺失或添加，优选添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ala合成酶功能的由a)衍生的ala合成酶。
24.在优选的实施方式中，所述ala合成酶在对应于seq id no:1所示的氨基酸序列，第15位的氨基酸残基为lys或arg；或第29位的氨基酸残基为gln或arg或tyr；或第39位的氨基酸残基为tyr或phe或arg；第176位的氨基酸残基为asn或lys或asp；或第206位的氨基酸残基为tyr或phe；或第236位的氨基酸残基为asp或asn或arg；或第293位的氨基酸残基为tyr；或第304位的氨基酸残基为met或gln。
25.在优选的实施方式中，所述ala合成酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，并且在第15位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：lys、arg、asn、gln，优选lys或arg；
26.或第29位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：gln、arg、lys、asn、tyr，优选gln或arg或tyr；
27.或第39位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、phe、arg、lys、asn、gln，优选tyr或phe或arg；
28.或第176位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：asn、lys、asp、gln、arg，优选asn或lys或asp；
29.或第206位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、phe、lys、arg、asn、gln，优选tyr或phe；
30.或第236位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：asp、asn、arg、lys、gln，优选asp或asn或arg；
31.或第293位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、lys、arg、asn、gln，优选tyr；
32.或第304位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：met、gln、lys、arg、asn，优选met或gln；
33.在优选的实施方式中，所述ala合成酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，并且在第15位的氨基酸残基为lys或arg；或第29位的氨基酸残基为优选gln或arg或tyr；或第39位的氨基酸残基为tyr或phe或arg；第176位的氨基酸残基为asn或lys或asp；或第206位的氨基酸残基为tyr或phe；或第236位的氨基酸残基为asp或asn或arg；或第293位的氨基酸残基为tyr；或第304位的氨基酸残基为met或gln。
34.在优选的实施方式中，本发明包括在上述位点具有所述氨基酸残基突变，且与上述ala合成酶具有90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的序列相同性或同源性的ala合成酶。
35.在优选的实施方式中，在导入宿主细胞后，与氨基酸序列如seq id no:1所示的ala合成酶相比，所述的ala合成酶造成ala产量提高10％以上，优选30％以上，更优选50％以上。
36.在第二方面，本发明提供第一方面所述的ala合成酶的编码核酸序列。
37.在第三方面，本发明提供包含第一方面所述的ala合成酶编码核酸序列的表达载
体。
38.在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第一方面所述的ala合成酶。
39.在优选的实施方式中，所述宿主细胞包含第三方面所述的表达载体或在其基因组中整合有第二方面所述的编码核酸序列。
40.在进一步的优选实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)；更优选大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
41.在第五方面，本发明提供第一方面所述的ala合成酶、或第二方面所述的编码核酸序列、或第三方面所述的表达载体、或第四方面所述的宿主细胞在生产ala中的应用。
42.在第六方面，本发明提供一种制备ala的方法，所述方法包括以下步骤：
43.a.培养第四方面所述的宿主细胞，使之产生ala；和
44.b.任选从培养液中分离步骤a产生的ala。
45.在第七方面，本发明提供一种制备ala的方法，所述方法包括以下步骤：
46.a.利用第一方面所述的ala合成酶，催化从琥珀酰coa和甘氨酸合成ala；和
47.b.任选从以上反应体系中分离ala。
48.在第八方面，本发明提供第一方面所述的ala合成酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
49.a.得到第一方面所述的ala合成酶的编码序列；
50.b.将a得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；
51.c.培养b得到的宿主细胞；
52.d.从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ala合成酶。
53.在优选的实施方式中，所述对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第15位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：lys、arg、asn、gln，优选lys或arg；
54.或第29位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：gln、arg、lys、asn、tyr，优选gln或arg或tyr；
55.或第39位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、phe、arg、lys、asn、gln，优选tyr或phe或arg；
56.或第176位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：asn、lys、asp、gln、arg，优选asn或lys或asp；
57.或第206位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、phe、lys、arg、asn、gln，优选tyr或phe；
58.或第236位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：asp、asn、arg、lys、gln，优选asp或asn或arg；
59.或第293位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、lys、arg、asn、gln，优选tyr；
60.或第304位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：met、gln、lys、arg、asn，优选met或gln；
61.在优选的实施方式中，所述方法还包括测定得到的ala合成酶的活性提高。
62.在第九方面，本发明提供改造ala合成酶以便提高其活性的方法，所述方法包括以下步骤：
63.a.将待改造的ala合成酶的氨基酸序列与seq id no:1所示氨基酸序列作比对；和
64.b.改造所述待改造ala合成酶的编码序列，使得编码的氨基酸序列中对应于seq id no:1所示氨基酸序列的一个或多个以下位点的氨基酸残基发生突变：第15位、第29位、第39位、第176位、第206位、第236位、第293位、第304位；
65.c.将b得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；
66.d.培养c得到的宿主细胞；和
67.e.从步骤d得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ala合成酶。
68.在优选的实施方式中，第15位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：lys、arg、asn、gln，优选lys或arg；
69.或第29位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：gln、arg、lys、asn、tyr，优选gln或arg或tyr；
70.或第39位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、phe、arg、lys、asn、gln，优选tyr或phe或arg；
71.或第176位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：asn、lys、asp、gln、arg，优选asn或lys或asp；
72.或第206位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、phe、lys、arg、asn、gln，优选tyr或phe；
73.或第236位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：asp、asn、arg、lys、gln，优选asp或asn或arg；
74.或第293位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、lys、arg、asn、gln，优选tyr；
75.或第304位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：met、gln、lys、arg、asn，优选met或gln。
76.在优选的实施方式中，所述方法还包括测定得到的ala合成酶的活性提高。
77.在优选的实施方式中，经改造的ala合成酶不仅活性得到提高，其在胞内进行ala生产得到的ala产量也明显提高。
78.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
79.发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现对来源于沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)的seq id no:1所示氨基酸序列(mnyeayfrrqld glhregryrvfadlerhagsfprathhrpegagdvtvwcsndylgmgqhpavltamhealdscgagaggtrniagtnhyhvlleqelaalhgkesallftsgyvsnwaslstlasrmpgcvilsdelnhasmiegirhsrsetrifahndprdlerkladldphapklvafesvysmdgdiapiaeicdvadahnamtyldevhgvglygpngggiadregishrltiiegtlakafgvvggyiagssavcdfvrsfasgfifstspppavaagalasirhlrassaererhqdrvarlrarldqagvahm
pnpshivpvmvgdaalckqisdelisrygiyvqpinyptvprgterlritpspqhtdadiehlvqalseiwtrvglakaa)的第15位、第29位、第39位、第176位、第206位、第236位、第293位或第304位的氨基酸残基进行突变，获得的ala合成酶不仅提高了酶活性，并且提高了ala的产量，从而提升了所述ala合成酶在生产ala中的应用价值。在此基础上完成了本发明。
80.表述“保持初始功能”是指基因或者蛋白质的突变体具备对应于初始基因或者蛋白质的功能(如活性或者性质)的功能。用于基因的表述“保持初始功能”是指基因的突变体编码保持初始功能的蛋白质。也就是说，ala合成酶突变体基因的“保持初始功能”是指该基因的突变体编码具有ala合成酶活性的蛋白质，而ala合成酶突变体“保持初始功能”的表述是指该突变蛋白具有ala合成酶的活性。ala合成酶的活性指该蛋白具有催化从琥珀酰coa和甘氨酸合成ala合成的活性。
81.本发明的ala合成酶
82.本文所用的术语“本发明的ala合成酶”和“本发明的多肽”可互换使用，并具有本领域普通技术人员通常理解的含义，均是指具有催化从琥珀酰coa和甘氨酸合成ala合成的活性。
83.本发明的ala合成酶是通过对seq id no:1所示氨基酸序列进行突变得到，得到的突变体不仅具备优异的活性，而且可以实质性提高ala的产量。具体地说，与氨基酸序列如seq id no:1所示的ala合成酶相比，本发明的ala合成酶的比活力升高30％以上，优选升高50％以上，更优选升高100％以上，最优选升高150％以上；而在导入宿主细胞后，本发明的ala合成酶造成ala产量提高10％以上，优选30％以上，更优选50％以上。
84.本发明的ala合成酶可以来源于各物种，包括但不限于放射形土壤杆菌(agrobacterium radiobacter)、嗜酸柏拉红菌(rhodoblastus acidophilus)、类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)；优选沼泽红假单胞菌。
85.具体地说，本发明的ala合成酶的氨基酸序列在对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第15位、第29位、第39位、第176位、第206位、第236位、第293位或第304位发生突变。本领域技术人员知晓，为提升活性而对野生型多肽进行突变，找到能实现所需目的的位点更为重要。因此，基于本发明的教导，本领域技术人员会对seq id no:1所示氨基酸序列的第15位、第29位、第39位、第176位、第206位、第236位、第293位或第304位的氨基酸残基或某氨基酸序列中对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第第15位、第29位、第39位、第176位、第206位、第236位、第293位或第304位的氨基酸残基进行突变，并检测突变体的相关活性。在具体的实施方式中，本发明的ala合成酶在对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第15位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：lys、arg、asn、gln，优选lys或arg；
86.或第29位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：gln、arg、lys、asn、tyr，优选gln或arg或tyr；
87.或第39位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、phe、arg、lys、asn、gln，优选tyr或phe或arg；
88.或第176位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：asn、lys、asp、gln、arg，优选asn或lys或asp；
89.或第206位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、phe、lys、arg、asn、gln，优
选tyr或phe；
90.或第236位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：asp、asn、arg、lys、gln，优选asp或asn或arg；
91.或第293位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：tyr、lys、arg、asn、gln，优选tyr；
92.或第304位的氨基酸残基选自以下氨基酸的一种：met、gln、lys、arg、asn，优选met或gln。
93.此外，本领域普通技术人员也不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基(包括残基的取代、缺失、插入、添加)基本上不会改变多肽初始的生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见watson等，molecular biology of the gene，第四版，1987，the benjamin/cummings pub.co.p224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换(包括残基的取代、缺失、插入、添加)并且确保所得多肽仍保持其初始功能。
94.因此，对本发明的ala合成酶作进一步突变而得到仍具备ala合成酶的功能和活性的进一步突变体是显而易见的。例如，本领域技术人员公知在多肽的任一端增加或减少数个氨基酸残基，例如优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基不会影响得到的突变体的功能。例如，为便于纯化，技术人员往往在得到的蛋白的任一端带上6
×
his标签，而这种蛋白与不具备6
×
his标签的蛋白具有相同的功能。
95.同时，本领域的技术人员都知道在上述取代、缺失、插入和添加一个或几个氨基酸残基并保持多肽初始功能的突变称为保守突变，而保守突变中的典型代表是保守取代，保守取代是下述突变，其中，如果取代位点是芳香族氨基酸，则在phe、trp和tyr之间相互取代；如果是疏水性氨基酸，则在leu、ile和val中相互取代；若果它是极性氨基酸，则在gln和asn之间相互取代；如果它是碱性氨基酸，则在lys、arg和his中相互取代；如果它是酸性氨基酸，则在asp和glu之间相互取代；如果它是具有羟基的氨基酸，则在ser和thr之间相互取代。具体而言，被视为保守取代的氨基酸残基之间的取代如下表所示。
96.初始残基代表性的取代残基优选的取代残基ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleu
phe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu
97.即，如果初始氨基酸残基是ala，那么可以在val、leu、ile之间相互取代，优先的取代残基是val。因此，本发明应包括本发明的ala合成酶的保守性突变体。这些保守性突变体可以根据，例如上表所示进行氨基酸替换而产生。
98.本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸，即ala合成酶基因。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
99.ala合成酶基因可以是在严格的条件下与seq id no:1所示氨基酸序列制备的探针，例如与seq id no:1所示氨基酸序列的部分或者整个序列互补的序列杂交的dma，只要保持其初始功能即可。所述“严格的条件”是指可形成所谓的特异性杂交且未形成非特异性杂交的条件。例如，同源性较高的dna，例如具有80％以上同源性的dna彼此杂交，同源性低于80％的dna彼此不杂交的条件，或者通常的southern杂交的清洗条件，即在相当于60℃、1*ssc、0.1％sds、优选60℃、0.1*ssc、0.1％sds，更优选68℃、0.1*ssc、0.1％sds的盐浓度及温度下清洗1次、优选2-3次的条件。
100.此外，由于密码子的简并性因宿主而异，ala合成酶基因中的任意密码子可以用相应的等价密码子替换，也就是说，ala合成酶基因可以是由于遗传密码的简并性而在上面例如的任何ala合成酶基因的突变。例如，ala合成酶基因可以是经修饰的基因，使得其具有根据要使用的宿主中密码子频率的最佳密码子。
101.因此，在具体的实施方式中，所述ala合成酶基因可以是与编码seq id no:1所示氨基酸序列的dna同源性或序列相同性在90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的dna。
102.因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”；“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”和“由
……
构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0103]“对应于”[0104]
本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基”而言，如果在seq id no:1所示氨基酸序列的一端加上6
×
his标签，那么所得突变体中对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第40位就可能是第46位。再如，如果在seq id no:1所示氨基酸序列的n末端位置处缺失一个残基时，那么所得突变体中对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第40位就可能是第39位。此外，若在seq id no:1所示氨基酸序列的任意位置插入一个氨基酸残基而其功能未改变的情况下，所得突变体中对应于seq id no:1所示
氨基酸序列的第40位就可能是39位或者41位。
[0105]
在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的同源性。因此，与本发明的具体ala合成酶具有90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的序列相同性或同源性，并且在上述位点具有所述氨基酸残基突变的ala合成酶也包括在本发明的保护范围内。
[0106]
任意氨基酸序列与seq id no:1所示氨基酸序列的对应于位置可以通过氨基酸序列之间的比对确定。本领域普通技术人员公知的测定比对方法包括但不限于：计算机分子生物学(computational molecular biology)，lesk，a.m.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(biocomputing:informatics and genome projects)，smith，d.w.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(computer analysis of sequence data)，第一部分，griffin，a.m.和griffin，h.g.编，humana press，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(sequence analysis in molecular biology)，von heinje，g.，学术出版社，1987和序列分析引物(sequence analysis primer)，gribskov，m.与devereux，j.编m stockton press，纽约，1991和carillo，h.与lipman，d.，siam j.applied math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：gcg程序包(devereux，j.等，1984)、blastp、blastn和fasta(altschul，s，f.等，1990)。公众可从ncbi和其它来源得到blastx程序(blast手册，altschul，s.等，ncbi nlm nih bethesda，md.20894；altschul，s.等，1990)。熟知的smith waterman算法也可用于测定相同性。
[0107]
宿主细胞
[0108]
本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够产生本发明ala合成酶的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的ala合成酶能在该宿主细胞中表达。
[0109]
例如，适用于本发明的宿主细胞来自(但不限于)大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)；更优选大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
[0110]
固定化酶
[0111]
本文所用的术语“固定化酶”具有本领域普通技术人员常规理解的含义。具体地说，该术语表示水溶性酶经物理或化学方法处理后，使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中形成溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。
[0112]
固定化的酶仍具有酶活性，在催化反应中以固相状态作用于底物。酶经固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
[0113]
本领域普通技术人员鉴于本文的教导，不难将本发明的ala合成酶处理成固定化酶或以全细胞催化的形式，用于催化从甘氨酸和琥珀酰coa产生ala。
[0114]
本发明的应用与优点
[0115]
1.本发明的ala合成酶可以在工业上应用以实现低成本产生ala；
29y，pet21a-29k，pet21a-39y，pet21a-39f，pet21a-39r，pet21a-176n，pet21a-176k，pet21a-176d，pet21a-206y，pet21a-206f，pet21a-236d，pet21a-236n，pet21a-236r，pet21a-293y，pet21a-304m和pet21a-304q。
[0130]
表1.引物序列
[0131]
[0132][0133]
实施例2.ala合成酶突变酶的表达与酶学性质的检测
[0134]
分别将实施例1中构建的表达载体转化至e.coli bl21(de3)，获得重组菌株bl21(de3)/pet21a-hema、bl21(de3)/pet21a-15k、bl21(de3)/pet21a-15r、bl21(de3)/pet21a-29q、bl21(de3)/pet21a-29r、bl21(de3)/pet21a-29y、bl21(de3)/pet21a-29k、bl21(de3)/pet21a-39y、bl21(de3)/pet21a-39f、bl21(de3)/pet21a-39r、bl21(de3)/pet21a-176n、bl21(de3)/pet21a-176k、bl21(de3)/pet21a-176d、bl21(de3)/pet21a-206y、bl21(de3)/pet21a-206f、bl21(de3)/pet21a-236d、bl21(de3)/pet21a-236n、bl21(de3)/pet21a-236r、bl21(de3)/pet21a-293y、bl21(de3)/pet21a-304m和bl21(de3)/pet21a-304q，用于不同酶的表达和酶学性质检测。
[0135]
将上述重组菌单菌落分别接种5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃，220rpm培养12h。转接装有100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基的500ml三角瓶，37℃，220rpm培养od
600
至0.6-0.8后加入终浓度为0.1mm的iptg，20℃诱导培养22h后收集细胞并保存与-80℃。菌体破碎及粗酶活性测定步骤如下：
[0136]
(1)将已经离心收集，-80℃保存菌体(od
600
＝25)用1ml tris-hcl buffer(ph7.5，含100mm nacl)重悬；
[0137]
(2)mp破碎细胞：6m/s，30s，破碎7次；
[0138]
(3)将上一步得到的细胞破碎液离心，收集上清。
[0139]
(4)蛋白浓度测定参照说明书使用thermo scientific公司的bca蛋白定量试剂盒完成。
[0140]
酶活力测定：测定反应在总体积为200μl的50mm tris-hcl缓冲液(ph 7.5，含100mm nacl)体系中进行，酶反应体系中各组分如表2所示。加入10μl细胞破碎上清液，金属浴中37℃震荡反应6min后向体系中加入100μl的10％三氯乙酸溶液终止反应。之后检测酶反应体系中ala的生成量。ala的检测方法如“材料与方法”部分所述。各突变体的粗酶比活力如表3所示。
[0141]
注：粗酶比活力+定义为：37℃时，每分钟内产生1μmol ala所需的野生型hema的蛋白量。与野生型hema的粗酶比活力相比较，提升0-50％的比活力定义为+，提升50％-100％的比活力定义为++，提升100％-150％的比活力定义为+++。
[0142]
表2.ala合成酶活性测定反应体系中各组分浓度
[0143]
组分加入体积甘氨酸(1m)40μl琥珀酰辅酶a(10mm)5μl
磷酸吡哆醛(10mm)2μlala合成酶(150μg/ml)10μltris-hcl(50mm,ph 7.5，含100mm nacl)143μl
[0144]
表3.ala合成酶突变体
[0145]
ala合成酶粗酶比活力hema+15k++15r++29q++29r++29y++29k++39y++39f++39r++176n++176k++176d++206y++206f++236d++236n++236r++293y+304m+++304q+
[0146]
实施例3.ala合成酶突变酶在ala合成中的应用
[0147]
将实施例2中的重组菌的甘油管保藏菌分别接种5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始od为0.05转接装有30ml发酵培养基的250ml三角瓶，37℃，220rpm培养2.5h后加入终浓度为0.05mm的iptg，诱导培养9.5h后收集发酵液，检测ala的浓度。其中摇瓶发酵培养基配方为：葡萄糖15g/l，酵母粉2.0g/l，na2hpo4·
12h2o 17.1g/l，kh2po
4 3.0g/l，nacl 0.5g/l，nh4cl 1.0g/l，mgso
4 2.0mm，cacl
2 0.1mm，甘氨酸4g/l，调ph至7.0。氨苄青霉素终浓度为100μg/ml。ala的检测和葡萄糖分析方法如“材料与方法”部分所述。经检测，与hema野生型菌株相比，各个重组菌株的ala产量存在一定的差异，如表4所示，设hema野生型菌株的ala产量为1。
[0148]
表4.ala合成酶突变酶对ala合成的影响
[0149][0150]
讨论：本发明人在seq id no:1所示氨基酸序列中找到了多个位点，这些位点的氨基酸残基突变后得到的突变体的ala合成酶活性显著提高。在将这些突变体导入宿主细胞后，发现这些突变体在胞内同样显著提高了ala的产量。
[0151]
因此，本发明的ala合成酶突变体为进一步获得活性提高、ala产量提升的ala合成酶奠定了全新的物质基础，从而能够具备显著的经济价值。
[0152]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。