k l,huang d f,song f p.2013,appl microbiol biotechnol,97:9705-9713)。
7.单价bt杀虫基因在应用中会面临毒力有限、杀虫谱窄、害虫产生抗性问题，研究者利用两种或者两种以上bt杀虫基因组合应用来达到扩大杀虫谱和抗性治理的效果。但是不同的bt基因组合由于作用受体不同，会产生增效和拮抗不同的结果，张杰研究组发现bt蛋白cry1ai和cry9aa、cry1ea和cry9aa具有协同增效作用，而cry1ai和cry1ea组合无明显的增效作用(蔡吉林，束长龙，宋福平，黄勃，张杰.2013，植物保护，39(1):66-70)；yang等研究发现vip3aa16与cry1组合对东方黏虫的杀虫活性有组合增效作用，而vip3ca与cry1和cry2组合均未发现增效作用(yang j,quan y,sivaprasath p,shabbir m,wang z,ferr
é
j，he k.2018,toxins,10:454)。选择具有协同增效作用基因组合是创制新一代抗虫植物的新的基因来源。


技术实现要素：

8.针对上述领域中的需求，本发明提供cry2ah-vp和cry9ee两个对鳞翅目高毒力杀虫蛋白基因组合在对鳞翅目害虫防治中的应用，通过对cry2ah-vp和cry9ee基因进行密码子优化并合成新的dna序列，构建植物表达载体转化玉米，通过基因聚合的方法将cry2ah-vp和cry9ee基因组合在一起，实验表明，cry2ah-vp和cry9ee基因协同表达赋予玉米高抗黏虫、玉米螟、cry1a类抗性玉米螟的效果，在害虫抗性治理中有应用前景。
9.cry2ah-vp基因核苷酸序列如seq id no.3所示。
10.植物表达载体为pc2hbvp，其骨架载体是pcambia3300。
11.所述植物表达载体pc2hbvp，其结构如图1所示。
12.cry9ee基因核苷酸序列如seq id no.4所示。
13.所述植物表达载体为pc9eg，其骨架载体是pcambia2300。
14.所述植物表达载体pc9eg，其结构如图2所示。
15.cry2ah-vp和cry9ee蛋白组合在抗虫植物中应用，其中cry2ah-vp蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示，cry9ee蛋白的氨基酸序列如seq id no.6示。
16.所述的应用，为将含有cry2ah-vp基因和cry9ee基因的表达载体转化植物，使其表达cry2ah-vp和cry9ee蛋白，从而使转化植物具有抗虫的特性。
17.为将分别含有cry2ah-vp基因和cry9ee基因的表达载体的分别转化不同植物，使不同植物分别表达cry2ah-vp和cry9ee蛋白，然后再通过杂交方法将cry2ah-vp和cry9ee基因聚合到同一植物中，使杂交植物表达cry2ah-vp和cry9ee蛋白，从而使杂交植物具有抗虫的特性。
18.所述含有cry2ah-vp基因的表述载体中cry2ah-vp基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述含有cry9ee基因的表述载体为上述载体。
19.所述含有cry2ah-vp基因的表述载体植物为pc2hbvp，其骨架载体为pcambia3300。
20.所述抗虫为抗鳞翅目害虫。
21.所述转化的方法为农杆菌介导法，所述植物为玉米，但不限于玉米。
22.前期己对cry2ah(seq id no.1)基因进行核苷酸序列的密码子优化及突变，本发明对cry9ee(seq id no.2)的核苷酸序列进行了密码子优化，通过人工合成的方式合成了新基因cry2ah-vp(seq id no.3)和cry9ee(seq id no.4)，分别构建含有cry2ah-vp和
cry9ee的植物表达载体pc2hbvp和pc9eg，利用农杆菌介导法转入玉米中，通过pcr鉴定及抗虫性实验，分别筛选得到转cry2ah-vp基因玉米事件2hvb5及转cry9ee基因玉米事件9eg1。将两个转基因事件通过杂交方法将cry2ah-vp和cry9ee基因聚合到同一玉米植株中，pcr检测结果表明cry2ah-vp、cry9ee基因已整合到玉米基因组中。抗虫性实验结果显示cry2ah-vp和cry9ee基因组合的转基因玉米对黏虫、玉米螟，尤其是对cry1ab抗性玉米螟、cry1ac抗性玉米螟都有很好的杀虫活性，接虫3天后黏虫、玉米螟、cry1ab抗性玉米螟、cry1ac抗性玉米螟全部死亡。
23.cry2ah-vp和cry9ee基因的组合应用对黏虫、玉米螟、抗性玉米螟具有很好的杀虫活性，这将有助于降低害虫抗性上升的风险，组合应用的转基因玉米将会是玉米抗虫育种和害虫防治良好的种质资源，在玉米抗虫育种上有很好的商业化前景。
附图说明
24.图1植物表达载体pc2hbvp构建示意图。
25.图2植物表达载体pc9eg构建示意图。
26.图3转pc2hbvp载体玉米的cry2ah-vp基因pcr检测图
27.其中m为dna分子量标准super marker；ck+：以质粒pc2hbvp为模板扩增产物；ck-：是以非转基因玉米基因组dna为模板扩增的产物；0：空白，以水为模板扩增产物；1-5：部分转cry2ah-vp基因玉米基因组dna为模板扩增产物。
28.图4转pc9eg载体玉米cry9ee基因的pcr检测
29.其中m为dna分子量标准super marker；ck+：以质粒pc9eg为模板扩增产物；ck-：是以非转基因玉米基因组dna为模板扩增的产物；0：空白，以水为模板扩增产物；1-5：部分转cry9ee基因玉米基因组dna为模板扩增产物。
30.图5cry2ah-vp和cry9ee基因组合的转基因玉米pcr检测。
31.其中cry2ah-vp基因(a)、bar基因(b)、cry9ee基因(c)、gat基因(d)；
32.其中m为dna分子量标准super marker；ck+：以质粒pc2hbvp或pc9eg为模板扩增产物；ck-：是以非转基因玉米基因组dna为模板扩增的产物；0：空白，以水为模板扩增产物；1-3：以cry2ah-vp和cry9ee基因组合的转基因玉米基因组dna为模板扩增产物。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
34.下面所涉及的生物材料在本技术人的实验室均有保藏，可以对外发放。
35.1、bt cry2ah-vp和cry9ee基因的密码子改造和优化
36.bt cry2ah(genbank no.acl13555.1)是从国内分离的bt菌株中克隆的基因，基因的编码区有1899bp，核酸序列见seq id no.1，其编码的蛋白质由632个氨基酸组成。cry2ah-vp突变体蛋白是将cry2ah1蛋白354位缬氨酸(val)后增加一个脯氨酸(pro)，核苷酸序列上1062bp位后增加3个碱基ccc，编码脯氨酸，优化后的cry2ah-vp核苷酸序列见seq id no.3，氨基酸序列见seq id no.5。
37.bt cry9ee(genbank no.ade60738.1)是从苏云金芽胞杆菌t03b001菌株中克隆得到的，基因的编码区有3471bp，核酸序列见seq id no.2，其编码的蛋白质由1156个氨基酸
组成。通过对cry9ee蛋白序列结构域分析，存在三个保守的结构域：86-293位氨基酸为结构域ⅰ(endotoxin_n)、302-508位氨基酸为结构域ⅱ(endotoxin_m)和510-657位氨基酸为结构域ⅲ(endotoxin_c)，是活性必须区段。在本发明中选择bt cry9ee基因的1-734位氨基酸的编码序列(2202bp)，按照植物偏好的密码子对其进行优化。原始cry9ee基因(2202bp)gc含量39.2％，改造后基因的gc含量为63.5％，与原始cry9ee核酸序列的相似性为66.53％，优化后的cry9ee核酸序列见seq id no.4，氨基酸序列见seq id no.6。
38.2、植物表达载体的构建
39.含有cry2ah-vp基因的植物表达载体pc2hbvp包含玉米ubiquitin启动子、优化的cry2ah-vp基因及nos终止子，构建流程在专利“cry2ah-vp基因在抗黏虫中的应用”(专利号：zl201910191397.x)中已进行了详细说明，pc2hbvp载体示意图见图1，该载体含有bar基因和cry2ah-vp基因。
40.人工合成优化后的cry9ee基因，同时在cry9ee基因上游增加了增强基因表达的omk序列。puc57-un是一个中间载体，载体中含有一个ubiquitin启动子和一个nos终止子(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)，合成的omk-cry9ee片段通过bamhi和kpni酶切连入puc57-un载体，通过hindiii和ecori酶切将cry9ee表达盒连入pcgat载体中。pcgat中间载体是将人工合成优化后的草甘膦乙酰化酶gat基因上游增加了增强基因表达的omk序列，商用载体pcambia2300通过xhoi酶切去掉t-dna中的nptii基因，将合成的omk-gat片段通过无缝克隆的方式插入到pcambia2300中获得的载体(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)。含cry9ee基因的表达盒与pcgat相连构建获得最终载体pc9eg，载体示意图见图2，该载体含有草甘膦乙酰转移酶基因gat和杀虫基因cry9ee。
41.3、cry2ah-vp和cry9ee转基因玉米的获得
42.本发明将载体pc2hbvp和pc9eg通过冻融法分别转化到农杆菌eha105中，pcr进行鉴定。以新鲜剥离的1.2mm左右的玉米幼胚为材料，将幼胚放到侵染培养基中一个小时后，用侵染培养基洗一次，再浸入到添加100μm乙酰丁香酮的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，放到共培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。再将幼胚转移至恢复培养基上培养10天至诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织先去芽后再转移到含有相应筛选剂的筛选培养基上，每两周继代一次，经过6周的筛选将抗性愈伤组织转移到再生培养基上见光分化，见光约一周后，开始出现绿色的芽点，将愈伤块进行切分使绿色的芽点分开并转移到再生培养基上培养，利于主茎的生长，待主茎伸长至3～4cm时，将其转移至再生培养基上诱导生根，待玉米植株长得粗壮且根系发达后，将其转移至温室小花盆中生长。继续培养两周后，待转化苗生长状态良好后转移至温室，待雌穗吐丝后，用纸袋套住，等雄穗散粉后进行授粉，并收获果实。通过玉米转化，获得转pc2hbvp载体植株31株，获得转pc9eg载体植株91株。利用pcr方法对转化植株进行验证，引物序列见表1。以20μl反应混合物中含有100ng的dna模板，引物各0.1μm，10μl 2
×
taq mastermix(dye)，ddh2o补足至20μl。cry2ah-vp反应条件为：94℃ 5min，(94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s)30个循环，72℃ 5min。cry9ee反应条件为：94℃ 5min，(94℃ 30s，56.9℃ 30s，72℃ 30s)30个循环，72℃ 5min。转cry2ah-vp基因玉米pcr检测结果见图3，转cry9ee基因玉米pcr检测结果见图4。结果显示外源基因cry2ah-vp或者cry9ee基因已经导入玉米基因组中。
43.所述培养基：
44.侵染培养液：n6盐和n6维生素(chu等，science sinica，1975，18:659-668)，1.5mg/l 2,4-d，0.7/l g脯氨酸，68.4g/l蔗糖，36g/l葡萄糖(ph 5.2)，过滤灭菌，于4℃储存；使用前加入已过滤灭菌的乙酰丁香酮(as)，终浓度为100μm；
45.共培养培养基：n6盐和n6维生素，1.5mg/l 2,4-d，0.7g/l脯氨酸，30g/l蔗糖，3g/l植物凝胶(ph 5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/l的硝酸银，100μm的as，300mg/l的半胱氨酸；
46.恢复培养基：n6盐和n6维生素，1.5mg/l 2,4-d，0.7g/l脯氨酸，30g/l蔗糖，0.5g/l mes，4g/l植物凝胶(ph 5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/l的硝酸银和200mg/l的羧苄青霉素；
47.筛选培养基：恢复培养基加入筛选剂1mm草甘膦；
48.再生培养基：ms盐和ms维生素，30g/l蔗糖，100mg/l肌醇，3g/l植物凝胶(ph5.8)，高压灭菌。
49.所述玉米幼胚为新鲜剥离的1.2mm长的幼胚。
50.所述农杆菌菌液中添加有100μm乙酰丁香酮。
51.表1 pcr所用引物序列
[0052][0053]
4、cry2ah-vp和cry9ee转基因抗虫玉米的筛选
[0054]
获得的cry2ah-vp和cry9ee转基因玉米材料播种后，玉米生长到六叶期时，进行室内生物测定。测定转基因玉米植株对黏虫、敏感玉米螟幼虫的杀虫活性。黏虫和敏感玉米螟幼虫的室内生物测定使用24孔培养皿，取1cm2大小的玉米叶片放在24个孔内，每个孔内放入一头初孵幼虫，每天记录活虫、死虫的数量。每种处理进行三次生物重复，自交系郑58材料的叶片作为对照。筛选得到抗虫性好的转cry2ah-vp基因玉米材料2hvb5和转cry9ee基因玉米材料9eg1。虫测结果显示，接虫4天后，2hvb5材料的黏虫校正死亡率100％，接虫5天后，2hvb5材料的玉米螟校正死亡率100％；接虫4天后，9eg1材料的玉米螟全部死亡；9eg1材料对黏虫的杀虫活性低于2hvb5材料，接虫5天后的黏虫校正死亡率为53.56％，接虫6天后仍有个别试虫存活(表2)。通过室内生物活性鉴定表明2hvb5对黏虫和玉米螟有很好的杀虫活性、9eg1材料对玉米螟有很好的杀虫活性。
[0055]
表2 2hvb5和9eg1对玉米螟和黏虫的校正死亡率统计
[0056][0057]
5、2hvb5和9eg1的杂交组合及检测
[0058]
bt cry2ah-vp基因和cry9ee基因分属于cry2类和cry9类基因，氨基酸序列相似性为9.07％。将转基因玉米2hvb5和9eg1通过杂交的方法进行组合，得到含有cry2ah-vp和cry9ee两个基因的2hvb5/9eg1组合材料。对2hvb5/9eg1材料分别用cry2ah-vp、bar、cry9ee和gat基因的特异性引物进行pcr检测，引物序列见表1。以20μl反应混合物中含有100ng的dna模板，引物各0.1μm，10μl 2
×
taq mastermix(dye)，ddh2o补足至20μl。cry2ah-vp反应条件为：94℃ 5min，(94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s)30个循环，72℃ 5min。bar反应条件为：94℃ 5min，(94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 20s)30个循环，72℃ 5min。cry9ee反应条件为：94℃ 5min，(94℃ 30s，56.9℃ 30s，72℃ 30s)30个循环，72℃ 5min。gat反应条件为：94℃ 5min，(94℃ 30s，58.5℃ 30s，72℃ 20s)30个循环，72℃ 5min。pcr检测结果见图5。结果显示2hvb5/9eg1材料中cry2ah-vp、bar、cry9ee和gat基因均能被检测到，表明外源基因已整合到同一材料中。
[0059]
对pcr检测含有4个基因的2hvb5/9eg1材料进行室内生物测定，检测cry2ah-vp和cry9ee基因组合的2hvb5/9eg1材料对黏虫、玉米螟、cry1ab抗性玉米螟和cry1ac抗性玉米螟幼虫的杀虫活性。虫测结果见表3，接虫3天后，2hvb5/9eg1材料的黏虫、玉米螟、cry1ab抗性玉米螟、cry1ac抗性玉米螟的校正死亡率均为100％，表明cry2ah-vp和cry9ee基因组合对黏虫、玉米螟、cry1ab抗性玉米螟、cry1ac抗性玉米螟具有很高的杀虫活性。单独含有cry2ah-vp基因的2hvb5与单独含有cry9ee基因的9eg1虽然对玉米螟有很好的杀虫活性，但是在接虫3天后仍有个别虫存活，在4天或者5天后试虫全部死亡。统计学分析结果表明2hvb5/9eg1、2hvb5和9eg1三个材料对玉米螟的校正死亡率具有极显著差异(2hvb5/9eg1》9eg1》2hvb5)。2hvb5材料对黏虫具有很好的杀虫活性，接虫3天后黏虫的校正死亡率为94.38％，9eg1材料对黏虫的杀虫活性一般，接虫3天后黏虫的校正死亡率为39.49％，统计学分析结果表明2hvb5/9eg1、2hvb5和9eg1三个材料对黏虫的校正死亡率具有极显著差异(2hvb5/9eg1》2hvb5》9eg1)。2hvb5和9eg1材料对cry1ab、cry1ac抗性玉米螟都具有很好的杀虫活性，统计学分析结果表明2hvb5/9eg1对cry1ab抗性玉米螟的校正死亡率与9eg1材料有显著差异，与2hvb5材料有极显著差异，9eg1与2hvb5材料无显著差异；2hvb5/9eg1对cry1ac抗性玉米螟的校正死亡率与9eg1材料无显著差异，与2hvb5材料有极显著差异，9eg1与2hvb5材料有显著差异。
[0060]
表3 2hvb5/9eg1材料对黏虫、玉米螟及抗性玉米螟的校正死亡率统计
[0061][0062]
注：大写字母标示显著性水平差异(p《0.05)，小写字母标示极显著水平差异(p《0.01)
[0063]
实验结果表明cry2ah-vp和cry9ee基因组合应用对黏虫、玉米螟，尤其是抗性玉米螟具有高杀虫活性，且优于单一基因。cry2ah-vp和cry9ee基因组合可用于抗虫玉米育种，对于玉米害虫防治及抗性治理具有非常重要的意义，有很好的产业化前景。