1.本发明涉及利用肌集钙蛋白(csq)标签(calsequestrin-tag)的蛋白质的表达、水溶化及纯化方法，提供包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白的融合蛋白、包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列的核酸、包含上述核酸的表达载体、利用上述表达载体转化的细胞以及利用肌集钙蛋白标签的靶蛋白的表达、水溶化及纯化方法。本发明利用肌集钙蛋白标签增加了广泛用于药品及化妆品的蛋白质的表达及水溶化，并使蛋白质容易被钙分离，从而有望降低蛋白质材料及药品成本。


背景技术：

2.近来，随着基因工程及生物学的发展，有许多尝试大量生产或获得特定蛋白质来用于各种产业及疾病的治疗等。因此，大力研发用于获取所需的蛋白质的蛋白质组合技术、大量生产技术及纯化技术等。通常，人类所需的靶蛋白可通过培养利用表达其的载体转化的细胞来表达并生产所需的蛋白质。根据情况，这种蛋白质可在真核细胞、原核细胞等表达，在特殊情况下，可在转基因植物或转基因动物中表达。例如，尝试在分泌乳汁的转基因动物中表达，并通过转基因动物的乳汁获取靶蛋白等的方法。在此情况下，可从细胞培养物或乳汁分离纯化蛋白质。
3.在没有单独的通过分泌获取靶蛋白方法的动植物或微生物中表达蛋白质的情况下，首先需要从贮藏器官或细胞内部提取蛋白质的过程。这种从转化细胞获取靶蛋白的作业并不容易。因此，为了容易获取，广泛使用将靶蛋白重组为包含标签(tag)的形态而非天然型的方法。为了纯化而利用标签的方法为各种蛋白质纯化技术中示出非常高的效率的方法之一，在此情况下使用的标签大致分为肽标签和蛋白质标签。肽标签由短氨基酸组成，代表性地有组氨酸标签(his-tag，histidine-tag)，尤其，广泛使用六聚组氨酸标签(hexahistidine tag，his6-tag)。组氨酸肽具有与镍具有特异性化学亲和力，包含相应标签的融合蛋白可通过包含镍的柱以高纯度纯化。蛋白质标签为为了利用与特定成分结合的蛋白质地结构域所具有的特征等而包含相应结构域等的标签。代表性地有谷胱甘肽s转移酶标签(gst-tag，glutathione s-transferase-tag)。谷胱甘肽s转移酶标签可通过作为谷胱甘肽s转移酶的底物的谷胱甘肽固定介质的柱以高纯度纯化。
4.因此，本发明人努力研发新标签而容易获取靶蛋白，结果确认在将肌集钙蛋白标签与靶蛋白融合的情况下，使靶蛋白容易表达、水溶化及纯化，从而完成了本发明。
5.现有文献
6.韩国公开专利第10-2014-0026781号


技术实现要素：

7.技术问题
8.本发明的目的在于，提供包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白的融合蛋白。
9.本发明的再一目的在于，提供包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列的核酸以及包
含上述核酸的表达载体。在图1示出本发明的重组表达载体的示意图。
10.本发明的另一目的在于，提供利用上述表达载体转化的细胞。
11.本发明的又一目的在于，提供利用肌集钙蛋白标签的靶蛋白的表达及纯化方法。在图2示出本发明的靶蛋白的表达及纯化方法的一例。
12.技术方案
13.本发明涉及用于提高靶蛋白的表达及水溶化的包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白的融合蛋白。
14.上述肌集钙蛋白标签可被由seq id no:1或seq id no:2组成的氨基酸编码。
15.上述上述肌集钙蛋白标签可被由seq id no:4或seq id no:4组成的核苷酸序列编码。
16.上述肌集钙蛋白标签及靶蛋白可通过由氨基酸序列组成的水解酶分解肽融合，上述氨基酸序列选自由seq id no:5至seq id no:8组成的组中。
17.本发明的特征在于，上述靶蛋白选自由高分子蛋白质、糖蛋白、细胞因子、生长因子、血液制剂、疫苗、激素、酶及抗体组成的组中。例如，上述靶蛋白可选自由白细胞介素2(interleukin-2)、血液因子vii、血液因子viii、血液因子ix、免疫球蛋白、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，hrp)、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、集落刺激因子(gm-csf)、人纤连蛋白额外结构域b(human fibronectin extra domain b，ebd)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，bmp)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，fgf)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)、神经生长因子(nerve growth factor，ngf)、表皮生长因子(epidermal growth factor，egf)、胰岛素生长因子(insulinlike growth factor，igf)、转化生长因子-α及转化生长因子-β(trans-forming growth factor-αand
–
β，tgf-α,-β)、脑源性神经营养因子(brain-derived neutrophic factor，bdnf)、血小板源性生长因子(plateletderived growth factor，pdgf)、胎盘生长因子(placental growth factor，pigf)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，hgf)、成纤维细胞生长因子-1及成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor 1 and 2，fgf-1,-2)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，kgf)、胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，glp-1)、exendin、生长激素抑制素(somatostatin)、黄体生成素释放激素(lhrh，luteinizing hormone-releasing hormone)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone)、生长激素释放激素(growth hormone-releasing hormone)、催产素(oxytocin)、胸腺肽α-1(thymosin alpha-1)、促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin-releasing factor)、降血钙素(calcitonin)、比伐卢定(bivalirudin)、血管加压素(vasopressin)、磷脂酶激活蛋白(plap)、胰岛素、肿瘤坏死因子(tnf)、促卵泡激素、促甲状腺激素、抗利尿激素、色素激素、甲状旁腺激素、促黄体激素、降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，cgpr)、脑啡肽(enkephalin)、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑分泌因子、催乳素、慢性促性腺激素、组织纤溶酶原激活剂、生长激素释放肽(growth hormone releasing peptide，ghpr)、胸腺体液因子(thymic humoral factor，thf)、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺甙脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、二磷酸腺苷酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂
酶及葡萄糖醛酸酶组成的组中。
18.上述靶蛋白可被选自由seq id no:9至seq id no:19组成的组中的氨基酸编码。
19.本发明还涉及包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列的核酸。
20.本发明还涉及包含上述核酸的表达载体。
21.本发明还涉及利用上述表达载体转化的细胞。
22.上述细胞可以为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、假单胞菌属、酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵巢细胞株(cho，chinese hamster ovary)、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、3t3、rin、mdck细胞株或植物细胞。
23.本发明还涉及利用肌集钙蛋白标签的靶蛋白的表达及纯化方法，其包括：步骤a)，制备包含核酸的表达载体，上述核酸编码融合蛋白；步骤b)，将上述表达载体转导至宿主细胞来获取转化体；步骤c)，从上述转化体表达包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白的融合蛋白；步骤d)，利用钙从表达的上述转化体沉淀包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白的融合蛋白；以及步骤e)，利用水解酶从融合蛋白分离靶蛋白。
24.发明的效果
25.根据本发明的利用肌集钙蛋白标签的靶蛋白的表达、水溶化及纯化方法，由于肌集钙蛋白的高表达及高水溶性，可使表达不佳或聚集良好的蛋白质在水溶液状态下表达，通过钙沉淀来无需柱也可容易分离纯化，从而有望降低蛋白质材料及药品成本。
附图说明
26.图1示出本发明的重组表达载体的示意图。
27.图2示出本发明的靶蛋白的表达及纯化方法的示意图。
28.图3示出根据实施例1在肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒(csq1tev)或肌集钙蛋白1凝血酶(csq1thrombin)载体克隆(cloning)edb靶蛋白基因的结果。
29.图4示出根据实施例1对肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-edb(csq1tev-edb)、肌集钙蛋白1凝血酶-edb(csq1thrombin-edb)蛋白质的纯化结果与利用作为现有的商用标签的组氨酸标签(his tag)和谷胱甘肽s转移酶融合蛋白质纯化edb的结果进行比较的图。在edb14蛋白的情况下，虽可利用组氨酸标签或谷胱甘肽s转移酶标签表达，但靶蛋白并不在上清液(supernatant)中，大部分凝聚为沉淀物(pellet)而不溶，但在利用肌集钙蛋白标签的edb14、edb21、edb26蛋白的情况下，一部分虽凝聚为沉淀物，但约30％～50％以上的水溶性蛋白质存在于上清液(s)中，从而确认可洗脱靶蛋白。
30.图5示出根据实施例1利用烟草蚀纹病毒蛋白酶(tev protease)切割肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-edb蛋白质的结果。确认利用烟草蚀纹病毒蛋白酶分离肌集钙蛋白标签和edb蛋白后，进行钙处理来使分离的肌集钙蛋白标签沉淀并去除，由此容易分离靶蛋白edb。
31.图6示出根据实施例2在肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒和肌集钙蛋白1凝血酶载体克隆表皮生长因子靶蛋白基因的结果。
32.图7示出根据实施例2纯化肌集钙蛋白1凝血酶-表皮生长因子(csq1thrombin-egf)、肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-表皮生长因子(csq1tev-egf)蛋白的结果。本来在细菌中表达的表皮生长因子本身凝聚而100％均存在于沉淀物中而周知，若利用肌集钙蛋白标签，则30％～40％可被水溶化。
33.图8示出根据实施例2利用凝血酶蛋白酶(thrombin protease)切割肌集钙蛋白1凝血酶-表皮生长因子蛋白质的结果。
34.图9示出根据实施例3纯化肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-角质细胞生长因子1(csq1tev-kgf1)蛋白质的结果。
35.图10示出根据实施例3利用烟草蚀纹病毒蛋白酶切割肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-角质细胞生长因子1蛋白质的结果。
36.图11示出根据实施例3纯化肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-血管内皮生长因子(csq1tev-vegf)蛋白质的结果。
37.图12示出根据实施例3利用烟草蚀纹病毒蛋白酶切割肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-血管内皮生长因子蛋白质的结果。
38.图13示出根据实施例3纯化肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-成纤维细胞生长因子2(csq1tev-fgf2)蛋白质的结果。
39.图14示出根据实施例3利用烟草蚀纹病毒蛋白酶切割肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-成纤维细胞生长因子2蛋白质的结果。
40.图15示出根据实施例4在烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1(tevcsq1)或凝血酶肌集钙蛋白1(thrombincsq1)载体克隆骨形成蛋白2(bmp2)及转化生长因子β(tgfβ)靶蛋白基因的结果。
41.图16示出根据实施例4纯化骨形成蛋白2-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1(bmp2-tevcsq1)、骨形成蛋白2-凝血酶肌集钙蛋白1(bmp2-thrombincsq1)蛋白质的结果。
42.图17示出根据实施例4利用烟草蚀纹病毒蛋白酶或凝血酶蛋白酶切割骨形成蛋白2-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1或骨形成蛋白2-凝血酶肌集钙蛋白1蛋白质的结果。
43.图18示出根据实施例4纯化转化生长因子β-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1(tgfβ-tevcsq1)、转化生长因子β-凝血酶肌集钙蛋白1(tgfβ-thrombincsq1)蛋白质的结果。
44.图19示出根据实施例4利用烟草蚀纹病毒蛋白酶或凝血酶蛋白酶切割转化生长因子β-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1或转化生长因子β-凝血酶肌集钙蛋白1蛋白质的结果。
45.图20示出根据实施例4纯化辣根过氧化物酶-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1(hrp-tevcsq1)蛋白质的结果。
46.图21示出根据实施例4利用烟草蚀纹病毒蛋白酶切割辣根过氧化物酶-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1蛋白质的结果。
47.图22示出根据实施例4纯化胰高血糖素样肽1-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1glp1-tevcsq1蛋白质的结果。
48.图23示出根据实施例4利用烟草蚀纹病毒蛋白酶切割胰高血糖素样肽1-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1蛋白质的结果。
49.图24示出根据实施例5在肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒(csq2tev)或肌集钙蛋白2凝血酶(csq2thrombin)载体克隆骨形成蛋白2及角质细胞生长因子1靶蛋白基因的结果。
50.图25示出根据实施例5纯化肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒-骨形成蛋白2(csq2tev-bmp2)和肌集钙蛋白2凝血酶-骨形成蛋白2(csq2thrombin-bmp2)蛋白质的结果。
51.图26示出根据实施例5利用烟草蚀纹病毒蛋白酶或凝血酶蛋白酶切割肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒-骨形成蛋白2或肌集钙蛋白2凝血酶-骨形成蛋白2蛋白质的结果。
52.图27示出根据实施例5纯化肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒-角质细胞生长因子1(csq2tev-kgf1)、肌集钙蛋白2凝血酶-角质细胞生长因子1(csq2thrombin-kgf1)蛋白质的结果。
53.图28示出根据实施例5利用烟草蚀纹病毒蛋白酶或凝血酶蛋白酶切割肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒-角质细胞生长因子1或肌集钙蛋白2凝血酶-角质细胞生长因子1蛋白质的结果。
54.图29示出根据实施例6纯化辣根过氧化物酶-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2(hrp-tevcsq2)、辣根过氧化物酶-凝血酶肌集钙蛋白2(hrp-thrombincsq2)蛋白质的结果。
55.图30示出根据实施例6利用烟草蚀纹病毒蛋白酶切割辣根过氧化物酶-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2蛋白质的结果。
56.图31示出根据实施例6纯化胰高血糖素样肽1-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2(glp1-tevcsq2)蛋白质的结果。
57.图32示出根据实施例6利用烟草蚀纹病毒蛋白酶切割胰高血糖素样肽1-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2蛋白质的结果。
58.图33示出根据实施例7纯化肌集钙蛋白1-ssp dna-表皮生长因子(csq1-ssp dna-egf)蛋白质的结果。
59.图34示出根据实施例7利用二硫苏糖醇(dithiothreitol，dtt)切割肌集钙蛋白1-ssp dna-表皮生长因子蛋白质的结果。
60.图35示出根据实施例7纯化肌集钙蛋白2-ssp dna-角质细胞生长因子1(csq2-ssp dna-kgf1)蛋白质的结果。
61.图36示出根据实施例7利用二硫苏糖醇切割肌集钙蛋白2-ssp dna-角质细胞生长因子1蛋白质的结果。
62.图37示出根据实施例8纯化表皮生长因子-gyra-肌集钙蛋白1蛋白质的结果。
63.图38示出根据实施例8利用20mm的na-hepes(ph 6.5)缓冲液切割表皮生长因子-gyra-肌集钙蛋白1(egf-gyra-csq1)蛋白质的结果。
64.图39示出根据实施例8纯化骨形成蛋白2-gyra-肌集钙蛋白2(bmp2-gyra-csq2)蛋白质的结果。
65.图40示出根据实施例8利用20mm的na-hepes(ph 6.5)缓冲液切割的结果。
具体实施方式
66.在本说明书中使用的术语“肌集钙蛋白(calsequestrin，csq)”为肌质网(sarcoplasmic reticulum)的钙结合蛋白，即使肌质网中的钙浓度高于细胞质，也可在肌肉收缩后与钙结合来在肌质网池储存钙离子。一个肌集钙蛋白分子可与多个钙(例如，每一个肌集钙蛋白分子具有40个～50个的钙结合位点)结合，因此，钙储存能力非常优秀。肌集钙蛋白具有如下的性质，即，当钙含量低时，以单体存在，当钙含量增加时，变为多聚体来使大小变大。
67.在本说明书中使用的术语“靶蛋白”是指为特定目的需以高纯度或大量获得的任意蛋白质，其无限制地包括天然型蛋白质、变异体蛋白质或新型重组蛋白等。靶蛋白可以为出于工业、医疗、学术等理由需要高纯度或大量获得的蛋白质，优选为用于医药或研究的重
组蛋白，更优选地，选自由高分子蛋白质、糖蛋白、细胞因子、生长因子、血液制剂、疫苗、激素、酶及抗体组成的组中。更优选地，靶蛋白可以为抗体的轻链或重链的全部或一部分，最优选为抗体的轻链可变区(vl)或重链可变区(vh)。
68.在本说明书中使用的术语“通过水解酶的分解肽”可包含在肌集钙蛋白标签与靶蛋白之间，其可被水解酶切割而分离肌集钙蛋白标签和靶蛋白。
69.在本说明书中使用的术语“载体”为可在适当的宿主细胞中表达靶蛋白的表达载体，是指包含可操作地连接必须调控元件来表达核酸插入物的核酸构建体。上述载体包含本领域通常使用的质粒、细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体，可操作本领域通常使用的质粒(例如，psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列及puc19等)、噬菌体(例如，λgt4λb、λ-charon、λδz1及m13等)或病毒(例如，cmv、sv40等)来制备。
70.在本说明书中使用的术语“转化(transformation)”是指将脱氧核糖核酸(dna)引入至宿主来使脱氧核糖核酸作为染色体的因子或通过染色体整合完成而复制，将外部的脱氧核糖核酸引入至细胞内来人为引起遗传变化的现象。上述转化方法包括cacl2沉淀法、在cacl2方法使用称为二甲基亚砜(dmso，dimethyl sulfoxide)的还原物质来提高效率的hanahan方法、电穿孔法(electroporation)、磷酸钙沉淀法、原生质融合法、利用碳化硅纤维的搅拌法、农杆菌介导的转化法、利用peg的转化法、硫酸葡聚糖、脂质体及干燥/抑制介导的转化方法等，但并不限定于此。
71.在本说明书中使用的术语“宿主细胞”为寄生其他微生物或基因来供给营养的细胞，是指载体转化在宿主细胞来在宿主细胞中发挥各种基因或分子影响的细胞。可在原核细胞稳定且连续克隆及表达本发明的载体的宿主细胞可使用本领域公知的任意宿主细胞，例如，由如e.coli rosetta、e.coli jm109、e.coli bl21、e.coli rr1、e.coli le392、e.coli b、e.coli x 1776、e.coli w3110、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的芽孢杆菌属菌株以及如鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌及各种假单胞菌属的肠杆菌科菌株等。并且，在将本发明的载体转化到真核细胞的情况下，可利用酵母(酿酒酵母(saccharomyce cerevisiae))、昆虫细胞、人细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞株、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、3t3、rin及mdck细胞株)及植物细胞等作为宿主细胞。
72.根据第一实例，本发明提供包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白的融合蛋白。
73.本发明的特征在于，在本发明的融合蛋白中，上述肌集钙蛋白标签包含肌集钙蛋白1(csq1)或肌集钙蛋白2(csq2)。
74.本发明的特征在于，在本发明的融合蛋白中，上述肌集钙蛋白1及肌集钙蛋白2分别被由seq id no:1及seq id no:2组成的氨基酸编码。上述seq id no:1的氨基酸可被seq id no:3的核苷酸序列编码，上述seq id no:2的氨基酸可被seq id no:4的核苷酸序列编码。
75.本发明的特征在于，在本发明的融合蛋白中，上述肌集钙蛋白标签及靶蛋白通过由氨基酸组成的水解酶分解肽融合，上述氨基酸选自由seq id no:5至seq id no:8组成的组中。
76.本发明的特征在于，在本发明的融合蛋白中，上述靶蛋白选自由高分子蛋白质、糖
蛋白、细胞因子、生长因子、血液制剂、疫苗、激素、酶及抗体组成的组中。例如，上述靶蛋白可选自由白细胞介素2、血液因子vii、血液因子viii、血液因子ix、免疫球蛋白、辣根过氧化物酶、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、集落刺激因子、人纤连蛋白额外结构域b、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、表皮生长因子、胰岛素生长因子、转化生长因子-α及转化生长因子-β、脑源性神经营养因子、血小板源性生长因子、胎盘生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-1及成纤维细胞生长因子-2、角质细胞生长因子、胰高血糖素样肽-1、exendin、生长激素抑制素、黄体生成素释放激素、促肾上腺皮质激素、生长激素释放激素、催产素、胸腺肽α-1、促肾上腺皮质激素释放因子、降血钙素、比伐卢定、血管加压素、磷脂酶激活蛋白、胰岛素、肿瘤坏死因子、促卵泡激素、促甲状腺激素、抗利尿激素、色素激素、甲状旁腺激素、促黄体激素、降钙素基因相关肽、脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑分泌因子、催乳素、慢性促性腺激素、组织纤溶酶原激活剂、生长激素释放肽、胸腺体液因子、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺甙脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、二磷酸腺苷酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶及葡萄糖醛酸酶组成的组中。
77.本发明的特征在于，在本发明的融合蛋白中，上述靶蛋白被选自由seq id no:9至seq id no:19组成的组中的氨基酸编码。
78.根据第二实例，本发明提供包含编码融合蛋白的核苷酸序列的核酸以及包含上述核酸的表达载体，上述融合蛋白包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白。
79.本发明的特征在于，在本发明的核酸或表达载体中，上述肌集钙蛋白标签被由seq id no:1或seq id no:2组成的氨基酸编码。上述seq id no:1的氨基酸可被seq id no:3的核苷酸序列编码，上述seq id no:2的氨基酸可被seq id no:4的核苷酸序列编码。
80.本发明的特征在于，在本发明的核酸或表达载体中，上述肌集钙蛋白标签及靶蛋白可通过由氨基酸组成的水解酶分解肽，上述氨基酸选自由seq id no:5至seq id no:8组成的组中。
81.本发明的特征在于，在本发明的核酸或表达载体中，上述靶蛋白选自由高分子蛋白质、糖蛋白、细胞因子、生长因子、血液制剂、疫苗、激素、酶及抗体组成的组中。例如，上述靶蛋白可选自由白细胞介素2、血液因子vii、血液因子viii、血液因子ix、免疫球蛋白、辣根过氧化物酶、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、集落刺激因子、人纤连蛋白额外结构域b、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、表皮生长因子、胰岛素生长因子、转化生长因子-α及转化生长因子-β、脑源性神经营养因子、血小板源性生长因子、胎盘生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-1及成纤维细胞生长因子-2、角质细胞生长因子、胰高血糖素样肽-1、exendin、生长激素抑制素、黄体生成素释放激素、促肾上腺皮质激素、生长激素释放激素、催产素、胸腺肽α-1、促肾上腺皮质激素释放因子、降血钙素、比伐卢定、血管加压素、磷脂酶激活蛋白、胰岛素、肿瘤坏死因子、促卵泡激素、促甲状腺激素、抗利尿激素、色素激素、甲状旁腺激素、促黄体激素、降钙素基因相关肽、脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑分泌因子、催乳素、慢性促性腺激素、组织纤溶酶原激活剂、生长激素释放肽、胸腺体液因子、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺甙脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、二磷酸腺
苷酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶及葡萄糖醛酸酶组成的组中。
82.本发明的特征在于，在本发明的核酸或表达载体中，上述靶蛋白被选自由seq id no:9至seq id no:19组成的组中的氨基酸编码。
83.根据第三实例，本发明提供利用包含融合蛋白的表达载体转化的细胞，上述融合蛋白包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白。
84.本发明的特征在于，在本发明的转化细胞中，上述肌集钙蛋白标签被由seq id no:1或seq id no:2组成的氨基酸编码。上述seq id no:1的氨基酸可被seq id no:3的核苷酸序列编码，上述seq id no:2的氨基酸可被seq id no:4的核苷酸序列编码。
85.本发明的特征在于，在本发明的转化细胞中，上述肌集钙蛋白标签及靶蛋白可通过由氨基酸组成的水解酶分解肽融合，上述氨基酸选自由seq id no:5至seq id no:8组成的组中。
86.本发明的特征在于，在本发明的转化细胞中，上述靶蛋白选自由高分子蛋白质、糖蛋白、细胞因子、生长因子、血液制剂、疫苗、激素、酶及抗体组成的组中。例如，上述靶蛋白可选自由白细胞介素2、血液因子vii、血液因子viii、血液因子ix、免疫球蛋白、辣根过氧化物酶、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、集落刺激因子、人纤连蛋白额外结构域b、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、表皮生长因子、胰岛素生长因子、转化生长因子-α及转化生长因子-β、脑源性神经营养因子、血小板源性生长因子、胎盘生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-1及成纤维细胞生长因子-2、角质细胞生长因子、胰高血糖素样肽-1、exendin、生长激素抑制素、黄体生成素释放激素、促肾上腺皮质激素、生长激素释放激素、催产素、胸腺肽α-1、促肾上腺皮质激素释放因子、降血钙素、比伐卢定、血管加压素、磷脂酶激活蛋白、胰岛素、肿瘤坏死因子、促卵泡激素、促甲状腺激素、抗利尿激素、色素激素、甲状旁腺激素、促黄体激素、降钙素基因相关肽、脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑分泌因子、催乳素、慢性促性腺激素、组织纤溶酶原激活剂、生长激素释放肽、胸腺体液因子、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺甙脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、二磷酸腺苷酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶及葡萄糖醛酸酶组成的组中。
87.本发明的特征在于，在本发明的转化细胞中，上述靶蛋白被选自由seq id no:9至seq id no:19组成的组中的氨基酸编码。
88.本发明的特征在于，在本发明的转化细胞中，上述细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、假单胞菌属、酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵巢细胞株、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、3t3、rin、mdck细胞株或植物细胞。
89.根据第四实例，本发明提供利用肌集钙蛋白标签的靶蛋白的表达及纯化方法，上述方法包括：步骤a)，制备包含核酸的表达载体，上述核酸编码包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白的融合蛋白；步骤b)，将上述表达载体转导至宿主细胞来获取转化体；步骤c)，从上述转化体表达包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白的融合蛋白；步骤d)，利用钙从表达的上述转化体沉淀包含肌集钙蛋白标签及靶蛋白的融合蛋白；以及步骤e)，利用水解酶从融合蛋白分离靶蛋白。
90.本发明的特征在于，在本发明的靶蛋白的表达及纯化方法中，上述肌集钙蛋白标签被由seq id no:1或seq id no:2组成的氨基酸编码。上述seq id no:1的氨基酸可被seq id no:3的核苷酸序列编码，上述seq id no:2的氨基酸可被seq id no:4的核苷酸序列编码。
91.本发明的特征在于，在本发明的靶蛋白的表达及纯化方法中，上述肌集钙蛋白标签及靶蛋白可通过由氨基酸组成的水解酶分解肽融合，上述氨基酸选自由seq id no:5至seq id no:8组成的组中。
92.本发明的特征在于，在本发明的靶蛋白的表达及纯化方法中，上述靶蛋白可选自由高分子蛋白质、糖蛋白、细胞因子、生长因子、血液制剂、疫苗、激素、酶及抗体组成的组中。例如，上述靶蛋白可选自由白细胞介素2、血液因子vii、血液因子viii、血液因子ix、免疫球蛋白、辣根过氧化物酶、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、集落刺激因子、人纤连蛋白额外结构域b、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、表皮生长因子、胰岛素生长因子、转化生长因子-α及转化生长因子-β、脑源性神经营养因子、血小板源性生长因子、胎盘生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-1及成纤维细胞生长因子-2、角质细胞生长因子、胰高血糖素样肽-1、exendin、生长激素抑制素、黄体生成素释放激素、促肾上腺皮质激素、生长激素释放激素、催产素、胸腺肽α-1、促肾上腺皮质激素释放因子、降血钙素、比伐卢定、血管加压素,磷脂酶激活蛋白、胰岛素、肿瘤坏死因子、促卵泡激素、促甲状腺激素、抗利尿激素、色素激素、甲状旁腺激素、促黄体激素、降钙素基因相关肽、脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑分泌因子、催乳素、慢性促性腺激素、组织纤溶酶原激活剂、生长激素释放肽、胸腺体液因子、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺甙脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、二磷酸腺苷酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶及葡萄糖醛酸酶组成的组中。
93.本发明的特征在于，在本发明的靶蛋白的表达及纯化方法中，上述靶蛋白被选自由seq id no:9至seq id no:19组成的组中的氨基酸编码。
94.本发明实施方式
95.以下，为了有助于理解发明，提出各种实施例。下述实施例仅为了更加容易理解发明而提供，发明的保护范围并不限定于下述实施例。
96.实施例
97.实施例1：利用肌集钙蛋白标签分离edb
98.1-1.在肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白1凝血酶载体(vector)克隆edb
99.为了在肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白1凝血酶载体克隆edb，合成了下述寡核苷酸edb-f1及edb-b1(bioneer，大田(daejeon)，韩国(korea))。另外，作为比较例，制备了公知组氨酸标签或谷胱甘肽s转移酶标签和edb的融合蛋白。
100.5'-aatggatccgaggtgccccaactcactgac-3'(seq id no:20)
101.5'-attctcgagttacgtttgttgtgtcagtgtagtagg-3’(seq id no:21)
102.为了扩增，混合20pmol的edb-f1、20pmol的edb-b1、4μl的聚合酶链式反应预混料(pcr premix)(elpisbio，大田、韩国)及10ug的模板(template)来制备了共20μl的添加有蒸馏水的混合液。对该混合液进行聚合酶链式反应(在95℃的温度下5分钟，30次：在95℃的
温度下30秒钟，在42℃的温度下30秒钟，在72℃的温度下45秒钟及在72℃的温度下5分钟)来扩增后，通过纯化(聚合酶链式反应纯化试剂盒，geneall，首尔，韩国)来获取了edb14(seq id no:9)、edb21(seq id no:10)、edb26(seq id no:11)基因。为了将edb基因插入到肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白1凝血酶载体，利用限制酶处理肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白1凝血酶载体和插入脱氧核糖核酸。将约1μg的插入脱氧核糖核酸与bamhi(new england biolabs(neb，伊普斯威奇(ipswich))及xhoi(neb，伊普斯威奇)反应一天后，利用聚合酶链式反应纯化试剂盒来获取了纯化脱氧核糖核酸。并且，向约40μg的肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白1凝血酶载体添加小牛肠碱性磷酸酶(ciap，calf intestinal alkaline phosphatase)(neb，伊普斯威奇)并反应3小时后，利用聚合酶链式反应纯化试剂盒纯化。利用t4脱氧核糖核酸连接酶(bioneer，大田，韩国)使插入脱氧核糖核酸与肌集钙蛋白烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白1凝血酶载体在常温条件下连接3小时(图3)。
103.之后，转化(transformaion)将肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白1凝血酶载体与edb插入物连接反应的脱氧核糖核酸。在冰上解冻感受态细胞dh5a，与2μl的在100μl的感受态细胞连接反应的溶液混合后，反应30分钟。并且，在42℃的温度下热激(heat shock)1分钟，并向soc培养基(media)添加200μl后，在37℃的温度下培养30分钟并涂布。从涂布的菌落中随机取出6个来进行聚合酶链式反应，对脱氧核糖核酸进行电泳来确认了插入物(insert)。委托bioneer公司进行测序来确认了克隆的菌落。
104.作为比较例，通过如上所述的方法在bioneer公司提供的pbt7-n-组氨酸(pbt7-n-his)和pbt7-n-谷胱甘肽s转移酶载体克隆组氨酸标签或谷胱甘肽s转移酶标签和edb的融合蛋白。
105.1-2.纯化肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-edb、肌集钙蛋白1凝血酶-edb、组氨酸-edb(his-edb)、谷胱甘肽s转移酶-edb
106.将在bioneer公司确认序列的脱氧核糖核酸均转换到bl21细胞后，涂布在包含氨苄青霉素的琼脂培养基。将在琼脂板培养基中生长的菌落接种到包含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml的lb培养基后，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，以1∶1的比例与甘油混合，制备1ml的原料(stock)并存储在-80℃的速冻冷库(deepfreezer)。在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的20ml的lb培养基接种100μl的原料，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，移入包含氨苄青霉素(50μg/ml)的400ml的lb培养基并培养至od＝0.7。之后，添加1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，在18℃的温度下以200rpm的速度培养一天。在4℃的温度下以4000rpm的速度离心分离20分钟，去除沉淀的细胞之外的所有上清液，并利用裂解缓冲液(20mm的tris(ph 8.0)、300mm的nacl及10mm的咪唑(imidazole))悬浮。在-80℃的温度下保存一天后取出并完全溶解，将10mg的苯基甲烷磺酰氟(pmsf，phenyl methane sulfonyl fluoride)溶解在1ml的二甲基亚砜后，向溶解的大肠杆菌(e.coli)添加1ml。利用声波仪溶解大肠杆菌后，在4℃的温度下以13000rpm的速度离心分离1小时。向上清液添加20mm的cacl2，在4℃的温度下反应1小时。之后，以5000rpm的速度离心分离30分钟。去除上清液，向沉淀物添加乙二胺四乙酸(edta)并悬浮，从而获取肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-edb和肌集钙蛋白1凝血酶-edb蛋白(图4)。
107.组氨酸-edb通过如下的方法表达纯化。将在pbt7-n-组氨酸载体克隆edb14的转换
到bl21细胞后，涂布在包含氨苄青霉素的琼脂培养基。将在琼脂板培养基中生长的菌落接种在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml的lb培养基后，在37℃的温度下以220rpm的速度混合并培养一天后，以1∶1的比例与甘油混合，制备1ml的原料并存储在-80℃的速冻冷库。在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的20ml的lb培养基接种100μl的原料，在37℃的温度下以220rpm的速度混合并培养一天后，移入包含氨苄青霉素(50μg/ml)的400ml的lb培养基并培养至od＝0.7。之后，添加1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在37℃的温度下以220rpm的速度培养一天。在4℃的温度下以4000xg的条件离心分离10分钟，去除沉淀的细胞之外的所有上清液，并利用裂解缓冲液(50mm的磷酸钠(sodium phosphate)(ph 8.0)、300mm的nacl及10mm的咪唑)悬浮。在-80℃的温度下保存一天后取出并完全溶解，将10mg的苯基甲烷磺酰氟溶解在1ml的异丙醇(isopropanol)后，向溶解的大肠杆菌添加1ml。
108.利用声波仪溶解大肠杆菌后，在4℃的温度下以13000rpm的速度离心分离1小时。利用蒸馏水和裂解缓冲液洗涤ni-nta亲和树脂(elposbio，大田，韩国)后，将上清液与树脂结合。利用600ml的洗涤缓冲液(50mm的磷酸钠(ph 8.0)、300mm的nacl及20mm的咪唑)洗涤后，利用洗脱缓冲液(50mm的磷酸钠(ph 8.0)、300mm的nacl及250mm的咪唑)洗脱并获取n-末端组氨酸标签edb14蛋白(图4)。
109.谷胱甘肽s转移酶-edb通过如下的方法表达纯化。经在pbt7-n-谷胱甘肽s转移酶载体克隆edb14的转换到bl21细胞后，涂布在包含氨苄青霉素的琼脂培养基。将在琼脂板培养基中生长的菌落接种在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml的lb培养基后，在37℃的温度下以220rpm的速度混合并培养一天后，以1∶1的比例与甘油混合，制备1ml的原料并存储在-80℃的速冻冷库。在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的20ml的lb培养基接种100μl的原料，在37℃的温度下以220rpm的速度混合并培养一天后，移入包含氨苄青霉素(50μg/ml)的400ml的lb培养基并培养至od＝0.7。之后，添加1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在37℃的温度下以220rpm的速度培养一天。在4℃的温度下以4000xg的条件离心分离10分钟，去除沉淀的细胞之外的所有上清液，并利用裂解缓冲液(50mm的tris(ph 7.5)、150mm的nacl及0.05％的np-40)。在-80℃的温度下保存一天后取出并完全溶解，将10mg的苯基甲烷磺酰氟溶解在1ml的异丙醇后，向溶解的大肠杆菌添加1ml。
110.利用声波仪溶解大肠杆菌后，在4℃的温度下以13000rpm的速度离心分离1小时。利用蒸馏水和裂解缓冲液洗涤谷胱甘肽s转移酶结合琼脂糖树脂(gst.bind agarose resin)(elposbio，大田，韩国)后，将上清液与树脂结合。利用600ml的洗涤缓冲液(50mm的tris-cl(ph 8.0)、150mm的nacl及0.1mm的乙二胺四乙酸)洗涤后，利用洗脱缓冲液(50mm的tris-cl(ph 8.0)、150mm的nacl、0.1mm的乙二胺四乙酸及10mm的还原(游离)谷胱甘肽(reduced(free)glutathione))洗脱并获取n-末端谷胱甘肽s转移酶-标签edb14蛋白(图4)。
111.结果确认，在edb14蛋白的情况下，不能利用组氨酸标签或谷胱甘肽s转移酶-标签在上清液(supernatant)中表达，但利用肌集钙蛋白标签的情况下，可被水溶化来在上清液中表达。
112.1-3.利用烟草蚀纹病毒蛋白酶分离edb
113.为了从肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-edb蛋白质中仅分离edb，添加5μl的烟草蚀纹病毒蛋白酶(genscript，usa)并在30℃的温度下反应一天后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯
酰胺凝胶电泳(sds-page)确认(图5)。结果确认，肌集钙蛋白标签及edb融合蛋白通过钙沉淀后，可利用烟草蚀纹病毒蛋白酶容易分离。
114.实施例2：利用肌集钙蛋白标签分离表皮生长因子
115.2-1.在肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒和肌集钙蛋白1凝血酶载体克隆表皮生长因子
116.为了在肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒和肌集钙蛋白1凝血酶载体克隆表皮生长因子，合成了下述两个寡核苷酸表皮生长因子-f1及表皮生长因子-b1(bioneer，大田，韩国)。
117.5'-aatggatccaactctgatagcgaatgcccg-3'(seq id no:22)
118.5'-attctcgagtta acgcagttcccaccattt-3'(seq id no:23)
119.为了扩增，混合20pmol的表皮生长因子-f1(egf-f1)、20pmol的表皮生长因子-b1(egf-b1)、4μl的聚合酶链式反应预混料(elpisbio，大田，韩国)及10ug的模板来制备了共20μl的添加有蒸馏水的混合液。对该混合液进行聚合酶链式反应(在95℃的温度下5分钟，30次：在95℃的温度下30秒钟，在42℃的温度下30秒钟，在72℃的温度下45秒钟及72℃的温度下5分钟)来扩增后，通过纯化(聚合酶链式反应纯化试剂盒，geneall，首尔，韩国)来获取了表皮生长因子基因(seq id no:12)。为了将表皮生长因子基因插入到肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒和肌集钙蛋白1凝血酶载体，利用限制酶处理载体和插入脱氧核糖核酸。将约1μg的插入脱氧核糖核酸与bamhi(new england biolabs(neb，伊普斯威奇)及xhoi(neb，伊普斯威奇)反应一天后，利用聚合酶链式反应纯化试剂盒获取纯化脱氧核糖核酸。并且，向约40μg的肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒和肌集钙蛋白1凝血酶载体添加小牛肠碱性磷酸酶(neb，伊普斯威奇)并反应3小时后，利用聚合酶链式反应纯化试剂盒纯化。利用t4脱氧核糖核酸连接酶(bioneer，大田，韩国)使插入脱氧核糖核酸与载体在常温条件下连接3小时(图6)。
120.之后，转化将肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白1凝血酶载体与表皮生长因子插入物连接反应的脱氧核糖核酸。在冰上解冻感受态细胞dh5a，与2μl的在100μl的感受态细胞连接反应的溶液混合后，反应30分钟。并且，在42℃的温度下热激1分钟，并向soc培养基添加200μl后，在37℃的温度下培养30分钟并涂布。从涂布的菌落中随机取出6个来进行聚合酶链式反应，对脱氧核糖核酸进行电泳来确认了插入物。委托bioneer公司进行测序来确认了克隆的菌落。
121.2-2.纯化肌集钙蛋白1凝血酶-表皮生长因子或肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-表皮生长因子
122.将在bioneer公司确认序列的脱氧核糖核酸转换到bl21细胞后，涂布在包含氨苄青霉素的琼脂培养基。将在琼脂板培养基中生长的菌落接种到包含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml的lb培养基后，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，以1∶1的比例与甘油混合，制备1ml的原料并存储在-80℃的速冻冷库。在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的20ml的lb培养基接种100μl的原料，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，移入包含氨苄青霉素(50μg/ml)的400ml的lb培养基并培养至od＝0.7。之后，添加1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在18℃的温度下以200rpm的速度培养一天。在4℃的温度下以4000rpm的速度离心分离20分钟，去除沉淀的细胞之外的所有上清液，并利用裂解缓冲液(20mm的tris(ph 8.0)、300mm的nacl及10mm的咪唑)悬浮。在-80℃的温度下保存一天后取出并完全溶解，将10mg的苯基甲烷磺酰氟溶解在1ml的二甲基亚砜后，向溶解的大肠杆菌添加1ml。利用声波仪溶解大肠杆菌后，在4℃的温度下以13000rpm的速度离心分离1小时。向上清液添加
20mm的cacl2，在4℃的温度下反应1小时。之后，以5000rpm的速度离心分离30分钟。去除上清液，向沉淀物添加乙二胺四乙酸并悬浮，从而获取肌集钙蛋白1凝血酶-表皮生长因子和肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-表皮生长因子蛋白(图7)。
123.2-3.利用凝血酶蛋白酶分离表皮生长因子
124.为了从集钙蛋白1凝血酶-表皮生长因子蛋白质中仅分离表皮生长因子，添加5μl的凝血酶蛋白酶并在22℃的温度下反应一天后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认(图8)。结果确认，可利用凝血酶蛋白酶容易分离肌集钙蛋白标签及edb融合蛋白。
125.实施例3：利用肌集钙蛋白标签分离角质细胞生长因子1、血管内皮生长因子及成纤维细胞生长因子2
126.3-1.纯化肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-角质细胞生长因子1、肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-血管内皮生长因子及肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-成纤维细胞生长因子2
127.在bioneer公司合成角质细胞生长因子1(seq id no:13)、血管内皮生长因子(seq id no:14)及成纤维细胞生长因子2(seq id no:15)基因后，在肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒克隆，转换到bl21细胞后涂布在包含氨苄青霉素的琼脂培养基。将在琼脂板培养基中生长的菌落接种在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml的lb培养基后，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，以1∶1的比例与甘油混合，制备1ml的原料并存储在-80℃的速冻冷库。在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的30ml的lb培养基接种100μl的原料，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，移入包含氨苄青霉素(50μg/ml)的1l的lb培养基并培养至od＝0.6。之后，添加1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在17℃的温度下以200rpm的速度培养一天。在4℃的温度下以4000rpm的速度离心分离20分钟，去除沉淀的细胞之外的所有上清液，并利用裂解缓冲液(20mm的tris(ph 8.0)、300mm的nacl及10mm的咪唑)悬浮。在-80℃的温度下保存一天后取出并完全溶解，将10mg的苯基甲烷磺酰氟溶解在1ml的二甲基亚砜后，向溶解的大肠杆菌添加1ml。利用声波仪溶解大肠杆菌后，在4℃的温度下以13000rpm的速度离心分离1小时。向上清液添加20mm的cacl2，在4℃的温度下反应1小时。之后，以5000rpm的速度离心分离30分钟。去除上清液，向沉淀物添加乙二胺四乙酸并悬浮，从而获取肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-角质细胞生长因子1、肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-血管内皮生长因子及肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-成纤维细胞生长因子2蛋白质(图9、图11、图13)。
128.3-2.利用烟草蚀纹病毒蛋白酶分离角质细胞生长因子1、血管内皮生长因子及成纤维细胞生长因子2
129.为了从肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-角质细胞生长因子1蛋白质(以下，在肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-血管内皮生长因子及肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-成纤维细胞生长因子蛋白质的情况下也执行与肌集钙蛋白1烟草蚀纹病毒-角质细胞生长因子1相同的实验)中仅分离角质细胞生长因子1，添加5μl的烟草蚀纹病毒蛋白酶(genscript，usa)并在30℃的温度下反应一天后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认(图10、图12、图14)。结果确认，可利用烟草蚀纹病毒蛋白酶容易分离肌集钙蛋白标签及角质细胞生长因子1融合蛋白、肌集钙蛋白标签及v表皮生长因子蛋白质以及肌集钙蛋白标签及成纤维细胞生长因子蛋白质三者。
130.实施例4：利用肌集钙蛋白标签分离骨形成蛋白2、转化生长因子β、辣根过氧化物酶及胰高血糖素样肽1
131.4-1.在烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1或凝血酶肌集钙蛋白1载体克隆骨形成蛋白2及转化生长因子β
132.为了在烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1或凝血酶肌集钙蛋白1载体克隆骨形成蛋白2及转化生长因子β，合成了下述寡核苷酸amplify-f1及amplify-b1(bioneer，大田，韩国)。
133.5'-cagcaagacagcgatggatcc-3'(seq id no:24)
134.5'-cgacttacaggtgatctcgag-3’(seq id no:25)
135.为了扩增，混合20pmol的amplify-f1、20pmol的amplify-b1、聚合酶链式反应预混料(bioneer，大田，韩国)及10ug的模板来制备了共20μl的添加有蒸馏水的混合液。对该混合液进行聚合酶链式反应(在95℃的温度下5分钟，30次：在95℃的温度下30秒钟，在47℃的温度下30秒钟，在72℃的温度下45秒钟及72℃的温度下5分钟)来扩增后，通过纯化(聚合酶链式反应纯化试剂盒，geneall，首尔，韩国)来获取了骨形成蛋白2(seq id no:16)及转化生长因子β(seq id no:17)基因。为了将骨形成蛋白2基因(以下，转化生长因子β基因的情况下也执行与骨形成蛋白2相同的实验)插入到烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1或凝血酶肌集钙蛋白1载体，利用限制酶处理烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1或凝血酶肌集钙蛋白1载体和插入脱氧核糖核酸。将约1μg的插入脱氧核糖核酸与bamhi(new england biolabs(neb，伊普斯威奇)反应一天后，利用xhoi(neb，伊普斯威奇)反应两天。之后，利用聚合酶链式反应纯化试剂盒获取纯化脱氧核糖核酸。并且，向约3μg的烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白或凝血酶肌集钙蛋白载体添加小牛肠碱性磷酸酶(takara，日本)并反应3小时后，利用聚合酶链式反应纯化试剂盒纯化。利用t4脱氧核糖核酸连接酶(bioneer，大田，韩国)使插入脱氧核糖核酸与烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白或凝血酶肌集钙蛋白载体在常温条件下连接3小时(图15)。
136.之后，转化将烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1或凝血酶肌集钙蛋白1载体与骨形成蛋白2插入物连接反应的脱氧核糖核酸。在冰上解冻感受态细胞dh5a，与5μl的在100μl的感受态细胞连接反应的溶液混合后，反应30分钟。并且，在42℃的温度下热激30秒钟，并向soc培养基添加200μl后，在37℃的温度下培养40分钟并涂布。从涂布而获取的菌落随机取出，并委托bioneer公司进行测序来确认了克隆的菌落。在bioneer公司也合成辣根过氧化物酶(seq id no:18)和胰高血糖素样肽1(seq id no:19)基因后，通过如上所述的方法在烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1克隆。
137.4-2.纯化骨形成蛋白2-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1或骨形成蛋白2-凝血酶肌集钙蛋白1、转化生长因子β-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1或转化生长因子β-凝血酶肌集钙蛋白1、辣根过氧化物酶-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1及胰高血糖素样肽1-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1
138.将在bioneer公司确认序列的骨形成蛋白2-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1、骨形成蛋白2-凝血酶肌集钙蛋白1、转化生长因子β-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1、转化生长因子β-凝血酶肌集钙蛋白1、辣根过氧化物酶-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1、胰高血糖素样肽-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1载体分别转换到bl21细胞后，涂布在包含氨苄青霉素的琼脂培养基。将在琼脂板培养基中生长的菌落接种到包含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml的lb培养基后，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，以1∶1的比例与甘油混合，制备1ml的原料并存储在-80℃的速冻冷库。在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的30ml的lb培养基接种100μl的原料，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，移入包含氨苄青霉素(50μg/ml)
的1l的lb培养基并培养至od＝0.6。之后，添加1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在17℃的温度下以200rpm的速度培养一天。在4℃的温度下以4000rpm的速度离心分离20分钟，去除沉淀的细胞之外的所有上清液，并利用裂解缓冲液(20mm的tris(ph 8.0)、300mm的nacl及10mm的咪唑)悬浮。在-80℃的温度下保存一天后取出并完全溶解，将10mg的苯基甲烷磺酰氟溶解在1ml的二甲基亚砜后，向溶解的大肠杆菌添加1ml。利用声波仪溶解大肠杆菌后，在4℃的温度下以13000rpm的速度离心分离1小时。向上清液添加20mm的cacl2，在4℃的温度下反应1小时。之后，以5000rpm的速度离心分离30分钟。去除上清液，向沉淀物添加乙二胺四乙酸并悬浮，从而获取骨形成蛋白2-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1和骨形成蛋白2-凝血酶肌集钙蛋白1蛋白质(图16、图18、图20、图22)。
139.4-3.利用烟草蚀纹病毒蛋白酶分离骨形成蛋白2、转化生长因子β、辣根过氧化物酶及胰高血糖素样肽1
140.为了从骨形成蛋白2-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1蛋白质(以下，在转化生长因子β-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1、辣根过氧化物酶-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1及胰高血糖素样肽1-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1蛋白质的情况下也执行与骨形成蛋白2-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1相同的实验)分离骨形成蛋白2，添加2μl的烟草蚀纹病毒蛋白酶(genscript，usa)并在30℃的温度下反应一天后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认(图17、图19、图21、图23)。结果确认，可利用烟草蚀纹病毒蛋白酶容易分离肌集钙蛋白标签及骨形成蛋白2融合蛋白。
141.4-4.利用凝血酶蛋白酶分离骨形成蛋白2及转化生长因子β
142.为了从骨形成蛋白2-凝血酶肌集钙蛋白1蛋白质(以下，在转化生长因子β-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1蛋白质的情况下也执行与骨形成蛋白2-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白1相同的实验)分离骨形成蛋白2，添加5μl的凝血酶蛋白酶并在22℃的温度下反应一天后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认(图17、图19)。结果确认，可利用凝血酶蛋白酶容易分离肌集钙蛋白标签及骨形成蛋白2融合蛋白。
143.实施例5.利用肌集钙蛋白-标签分离骨形成蛋白2及角质细胞生长因子1
144.5-1.在肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白2凝血酶载体克隆骨形成蛋白2及角质细胞生长因子1
145.为了在肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白2凝血酶载体克隆骨形成蛋白2及角质细胞生长因子1，使用合成的寡核苷酸amplify-f1及amplify-b1(bioneer，大田，韩国)。为了扩增，混合20pmol的amplify-f1、20pmol的amplify-b1、聚合酶链式反应预混料(bioneer，大田，韩国)及10ug的模板来制备了共20μl的添加有蒸馏水的混合液。对该混合液进行聚合酶链式反应(在95℃的温度下5分钟，30次：在95℃的温度下30秒钟，在47℃的温度下30秒钟，在72℃的温度下45秒钟及72℃的温度下5分钟)来扩增后，通过纯化(聚合酶链式反应纯化试剂盒，geneall，首尔，韩国)来获取了骨形成蛋白2(seq id no:16)及角质细胞生长因子1(seq id no:13)基因。为了将骨形成蛋白2基因(以下，角质细胞生长因子1基因的情况下也执行与骨形成蛋白2相同的实验)插入到肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白2凝血酶载体，利用限制酶处理肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白2凝血酶载体和插入脱氧核糖核酸。将约1μg的插入脱氧核糖核酸与bamhi(new england biolabs(neb，伊普斯威奇)反应一天后，利用xhoi(neb，伊普斯威奇)反应两天。之后，利用聚合酶链式反
应纯化试剂盒获取纯化脱氧核糖核酸。并且，向约3μg的肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白2凝血酶载体添加小牛肠碱性磷酸酶(takara，日本)并反应3小时后，利用聚合酶链式反应纯化试剂盒纯化。利用t4脱氧核糖核酸连接酶(bioneer，大田，韩国)使插入脱氧核糖核酸与肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白2凝血酶载体在常温条件下连接3小时(图24)。
146.之后，转化将肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒或肌集钙蛋白2凝血酶载体与骨形成蛋白2插入物连接反应的脱氧核糖核酸。在冰上解冻感受态细胞dh5a，与5μl的在100μl的感受态细胞连接反应的溶液混合后，反应30分钟。并且，在42℃的温度下热激30秒钟，并向soc培养基添加200μl后，在37℃的温度下培养40分钟并涂布。从涂布而获取的菌落随机取出，并委托bioneer公司进行测序来确认了克隆的菌落。
147.5-2.纯化肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒-骨形成蛋白2或肌集钙蛋白2凝血酶-骨形成蛋白2及肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒-角质细胞生长因子1或肌集钙蛋白2凝血酶-角质细胞生长因子1
148.将在bioneer公司确认序列的脱氧核糖核酸均转换到bl21细胞后，涂布在包含氨苄青霉素的琼脂培养基。将在琼脂板培养基中生长的菌落接种到包含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml的lb培养基后，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，以1∶1的比例与甘油混合，制备1ml的原料并存储在-80℃的速冻冷库。在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的30ml的lb培养基接种100μl的原料，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，移入包含氨苄青霉素(50μg/ml)的1l的lb培养基并培养至od＝0.6。之后，添加1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在17℃的温度下以200rpm的速度培养一天。在4℃的温度下以4000rpm的速度离心分离20分钟，去除沉淀的细胞之外的所有上清液，并利用裂解缓冲液(20mm的tris(ph 8.0)、300mm的nacl及10mm的咪唑)悬浮。在-80℃的温度下保存一天后取出并完全溶解，将10mg的苯基甲烷磺酰氟溶解在1ml的二甲基亚砜后，向溶解的大肠杆菌添加1ml。利用声波仪溶解大肠杆菌后，在4℃的温度下以13000rpm的速度离心分离1小时。向上清液添加20mm的cacl2，在4℃的温度下反应1小时。之后，以5000rpm的速度离心分离30分钟。去除上清液，向沉淀物添加乙二胺四乙酸并悬浮，从而获取肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒-骨形成蛋白2和肌集钙蛋白2凝血酶-骨形成蛋白2蛋白质(图25、图27)。
149.5-3.利用烟草蚀纹病毒蛋白酶分离骨形成蛋白2及角质细胞生长因子
150.为了从肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒-骨形成蛋白2蛋白质(以下，在肌集钙蛋白2烟草蚀纹病毒-角质细胞生长因子1蛋白质的情况下也执行相同的实验)分离骨形成蛋白2，添加2μl的烟草蚀纹病毒蛋白酶(genscript，usa)并在30℃的温度下反应一天后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认(图26、图28)。结果确认，可利用烟草蚀纹病毒蛋白酶容易分离肌集钙蛋白标签及骨形成蛋白2融合蛋白。
151.5-4.利用凝血酶蛋白酶分离骨形成蛋白2及角质细胞生长因子
152.为了从肌集钙蛋白2凝血酶-骨形成蛋白2蛋白质(以下，在肌集钙蛋白2凝血酶-角质细胞生长因子1蛋白质的情况下也执行相同的实验)分离骨形成蛋白2，添加5μl的凝血酶蛋白酶并在22℃的温度下反应一天后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认(图26、图28)。结果确认，可利用凝血酶蛋白酶容易分离肌集钙蛋白标签及骨形成蛋白2融合蛋白。
153.实施例6.利用肌集钙蛋白标签分离辣根过氧化物酶及胰高血糖素样肽1
154.6-1.纯化辣根过氧化物酶-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2或辣根过氧化物酶-凝血酶肌集钙蛋白2及胰高血糖素样肽1-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2
155.在bioneer公司合成辣根过氧化物酶(seq id no:18)及胰高血糖素样肽1(seq id no:19)的基因后，在烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2和凝血酶肌集钙蛋白2载体克隆，转换到bl21细胞后涂布在包含氨苄青霉素的琼脂培养基。将在琼脂板培养基中生长的菌落接种在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml的lb培养基后，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，以1∶1的比例与甘油混合，制备1ml的原料并存储在-80℃的速冻冷库。在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的30ml的lb培养基接种100μl的原料，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，移入包含氨苄青霉素(50μg/ml)的1l的lb培养基并培养至od＝0.6。之后，添加1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在17℃的温度下以200rpm的速度培养一天。在4℃的温度下以4000rpm的速度离心分离20分钟，去除沉淀的细胞之外的所有上清液，并利用裂解缓冲液(20mm的tris(ph 8.0)、300mm的nacl及10mm的咪唑)悬浮。在-80℃的温度下保存一天后取出并完全溶解，将10mg的苯基甲烷磺酰氟溶解在1ml的二甲基亚砜后，向溶解的大肠杆菌添加1ml。利用声波仪溶解大肠杆菌后，在4℃的温度下以13000rpm的速度离心分离1小时。向上清液添加20mm的cacl2，在4℃的温度下反应1小时。之后，以5000rpm的速度离心分离30分钟。去除上清液，向沉淀物添加乙二胺四乙酸并悬浮，从而获取辣根过氧化物酶-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2和辣根过氧化物酶-凝血酶肌集钙蛋白2及胰高血糖素样肽1-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2蛋白质(图29、图31)。
156.6-2.利用烟草蚀纹病毒蛋白酶分离辣根过氧化物酶及胰高血糖素样肽1
157.为了从辣根过氧化物酶-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2蛋白质(以下，在胰高血糖素样肽1-烟草蚀纹病毒肌集钙蛋白2蛋白质的情况下也执行相同的实验)分离辣根过氧化物酶，添加2μl的烟草蚀纹病毒蛋白酶(genscript，usa)并在30℃的温度下反应一天后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认(图30、图32)。结果确认，可利用烟草蚀纹病毒蛋白酶容易分离肌集钙蛋白标签及辣根过氧化物酶融合蛋白以及肌集钙蛋白标签及胰高血糖素样肽1液压蛋白质二者。
158.实施例7.利用肌集钙蛋白标签分离表皮生长因子及角质细胞生长因子1
159.7-1.纯化肌集钙蛋白1-ssp dna-表皮生长因子及肌集钙蛋白2-ssp dna-角质细胞生长因子1
160.在bioneer公司合成表皮生长因子(seq id no:12)、角质细胞生长因子1(seq id no:13)的基因后，在肌集钙蛋白1-ssp dna和肌集钙蛋白2-ssp dna载体克隆，转换到bl21细胞后涂布在包含氨苄青霉素的琼脂培养基。将在琼脂板培养基中生长的菌落接种在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml的lb培养基后，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，以1∶1的比例与甘油混合，制备1ml的原料并存储在-80℃的速冻冷库。在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的30ml的lb培养基接种100μl的原料，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，移入包含氨苄青霉素(50μg/ml)的1l的lb培养基并培养至od＝0.6。之后，添加1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在17℃的温度下以200rpm的速度培养一天。在4℃的温度下以4000rpm的速度离心分离20分钟，去除沉淀的细胞之外的所有上清液，并利用裂解缓冲液(20mm的tris(ph 8.0)、300mm的nacl及10mm的咪唑)悬浮。在-80℃的温度下保存一天
后取出并完全溶解，将10mg的苯基甲烷磺酰氟溶解在1ml的二甲基亚砜后，向溶解的大肠杆菌添加1ml。利用声波仪溶解大肠杆菌后，在4℃的温度下以13000rpm的速度离心分离1小时。向上清液添加20mm的cacl2，在4℃的温度下反应1小时。之后，以5000rpm的速度离心分离30分钟。去除上清液，向沉淀物添加乙二胺四乙酸并悬浮，从而获取肌集钙蛋白1-ssp dna-表皮生长因子及肌集钙蛋白2-ssp dna-角质细胞生长因子1蛋白质(图33、图35)。
161.7-2.利用ph值分离表皮生长因子及角质细胞生长因子1
162.为了从肌集钙蛋白1-ssp dna-表皮生长因子蛋白质(以下，在肌集钙蛋白2-ssp dna-角质细胞生长因子1蛋白质的情况下也执行相同的实验)分离表皮生长因子，利用20mm的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)ph 6.5、500mm的nacl缓冲液在常温条件下反应一天后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认(图34、图36)。结果确认，可利用ph值容易分离肌集钙蛋白标签及表皮生长因子融合蛋白。
163.实施例8.利用肌集钙蛋白标签分离表皮生长因子及骨形成蛋白2
164.8-1.纯化表皮生长因子-gyra-肌集钙蛋白1及骨形成蛋白2-gyra-肌集钙蛋白2
165.在bioneer公司合成表皮生长因子(seq id no:12)、骨形成蛋白2(seq id no:16)的基因后，在gyra-肌集钙蛋白1和gyra-肌集钙蛋白2载体克隆，转换到bl21细胞后涂布在包含氨苄青霉素的琼脂培养基。
166.将在琼脂板培养基中生长的菌落接种在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml的lb培养基后，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，以1∶1的比例与甘油混合，制备1ml的原料并存储在-80℃的速冻冷库。在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的30ml的lb培养基接种100μl的原料，在37℃的温度下以200rpm的速度混合并培养一天后，移入包含氨苄青霉素(50μg/ml)的1l的lb培养基并培养至od＝0.6。之后，添加1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在17℃的温度下以200rpm的速度培养一天。在4℃的温度下以4000rpm的速度离心分离20分钟，去除沉淀的细胞之外的所有上清液，并利用裂解缓冲液(20mm的tris(ph 8.0)、300mm的nacl及10mm的咪唑)悬浮。在-80℃的温度下保存一天后取出并完全溶解，将10mg的苯基甲烷磺酰氟溶解在1ml的二甲基亚砜后，向溶解的大肠杆菌添加1ml。利用声波仪溶解大肠杆菌后，在4℃的温度下以13000rpm的速度离心分离1小时。向上清液添加20mm的cacl2，在4℃的温度下反应1小时。之后，以5000rpm的速度离心分离30分钟。去除上清液，向沉淀物添加乙二胺四乙酸并悬浮，从而获取表皮生长因子-gyra-肌集钙蛋白1及骨形成蛋白2-gyra-肌集钙蛋白2蛋白质(图37、图39)。
167.8-2.利用二硫苏糖醇分离表皮生长因子及骨形成蛋白2
168.为了从表皮生长因子-gyra-肌集钙蛋白1蛋白质(以下，在骨形成蛋白2-gyra-肌集钙蛋白2蛋白质的情况下也执行相同的实验)分离表皮生长因子，利用20mm的羟乙基哌嗪乙硫磺酸ph 8.5、500mm的nacl、40mm的二硫苏糖醇缓冲液在常温条件下反应一天后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认(图38、图40)。结果确认，可利用二硫苏糖醇容易分离肌集钙蛋白标签及表皮生长因子融合蛋白。
169.以上，详细记述了本发明内容的认定部分，这种具体记述仅为优选的实施方式，本发明的范围并不局限于此，这对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。因此，本发明的是指范围通过发明要求保护范围和其等同技术方案定义。