1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及二氧化硅纳米粒子，其制备方法、用途，复合物及其用途。
背景技术：
2.信使核糖核酸(mrna)在活细胞翻译过程中起着连接脱氧核糖核酸(dna)和蛋白质的重要作用，因此引起了研究和工业的极大兴趣，已显示出多种应用，如疫苗、基因编辑和癌症免疫治疗、预防。
3.将mrna传递到细胞中进行有效翻译对于mrna技术的发展至关重要。但是，目前用于传递mrna的技术尚有改进空间。
4.因此，需要改进的技术。
技术实现要素：
5.本发明解决的技术问题包括，目前用于传递信使核糖核酸(mrna)的技术尚有改进空间。
6.本发明实施例的一方面涉及一种二氧化硅纳米粒子，其形状为树枝状中心-径向孔隙，粒径范围为50-100nm，孔径范围为20-30nm。
7.可选地，所述二氧化硅纳米粒子为单分散颗粒。
8.可选地，所述粒径为80nm。
9.可选地，所述孔径为20nm。
10.可选地，所述二氧化硅纳米粒子包括由聚乙烯亚胺改性而成的表面。
11.可选地，所述二氧化硅纳米粒子含有氮。
12.可选地，所述二氧化硅纳米粒子含氮量为5％。
13.本发明实施例的另一方面涉及一种制备如上所述的二氧化硅纳米粒子的方法，其包括：将硅源、催化剂、表面活性剂和水在室温混合，以得到二氧化硅颗粒。
14.可选地，所述硅源包括原硅酸四乙酯、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物。
[0015]
可选地，所述催化剂包括三羟乙基胺、四丙基氢氧化铵。
[0016]
可选地，所述表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵、七氟丁酸钠。
[0017]
可选地，十六烷基三甲基溴化铵和七氟丁酸钠的摩尔比范围为0.25-0.5：1。
[0018]
可选地，搅拌以混合所述硅源、所述催化剂、所述表面活性剂和水。
[0019]
可选地，对所述二氧化硅颗粒进行膦酸基表面改性后、再进行聚乙烯亚胺改性，以得到聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子。
[0020]
本发明实施例的又一方面涉及一种如前所述的二氧化硅纳米粒子在递送信使核糖核酸中的用途。
[0021]
本发明实施例的再一方面涉及一种复合物，其包括信使核糖核酸和如上所述的二氧化硅纳米粒子。
[0022]
可选地，所述二氧化硅纳米粒子与所述信使核糖核酸的质量比为5：1。
[0023]
可选地，所述信使核糖核酸包括增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸。
[0024]
本发明实施例的又一方面涉及一种如前所述的复合物在制备预防或治疗肿瘤疾病的药物中的用途。
[0025]
本发明实施例的技术方案可以有利于基于信使核糖核酸(mrna)的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用等。
[0026]
下文将结合附图对本发明实施例进行进一步的描述。
附图说明
[0027]
图1为本发明实验示例1中的二氧化硅颗粒的透射电镜图；
[0028]
图2是本发明实验示例2里聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子的透射电镜图；
[0029]
图3为本发明实验示例2中聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子(pei-msn)和脂质纳米粒子(lnp)的不同浓度对应的细胞活力数据图；
[0030]
图4是本发明实验示例4里聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子和脂质纳米粒子分别对增强绿色荧光蛋白(egfp，enhanced green fluorescent protein)信使核糖核酸(mrna)的负载数据图；
[0031]
图5为本发明实验示例4中聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子和脂质纳米粒子分别在不同时间对增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸的累积释放数据图；以及
[0032]
图6(a)、(b)、(c)分别是人肾上皮细胞hek293t摄取负载有增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸的聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子和对照组的荧光图和转染效率定量图。
具体实施方式
[0033]
本发明实施例的一方面涉及一种二氧化硅纳米粒子，其形状为树枝状中心-径向孔隙，粒径范围为50-100nm，孔径范围为20-30nm。
[0034]
本发明实施例的技术方案可以有利于基于信使核糖核酸(mrna)的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用等。
[0035]
具体而言，本发明实施例涉及的二氧化硅纳米粒子对细胞的毒性影响较低，可以高效负载、释放mrna，可以有效地将mrna导入细胞中，转染率较高，可以有利于基于mrna的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用等。
[0036]
除非另外特别指出，本技术中的数值范围可以包括其中的任意数值、数值子范围，例如50-100nm可以包括50nm、100nm、66nm、71nm、83nm、50-60nm、55-99nm、70-80nm、85-96nm、92-100nm等。
[0037]
除非另外特别指出，本技术中的数值可以包含测量、计量等误差范围内的数值，其中误差可以在正负百分之五的范围。比如，100nm可以包含95nm、98nm、102nm、105nm等。
[0038]
可选地，所述二氧化硅纳米粒子为单分散颗粒。如此，可以有助于所述二氧化硅纳米粒子的性能比较均衡。所述二氧化硅纳米粒子的大小可以基本一致，尺寸分布方差可以小于15％。
[0039]
可选地，所述粒径为80nm。如此，可以有利于所述二氧化硅纳米粒子可以有效地为细胞所摄取。
[0040]
可选地，所述孔径为20nm。如此，可以有助于所述二氧化硅纳米粒子高效地负载、释放mrna，转染效率较高。
[0041]
可选地，所述二氧化硅纳米粒子包括由聚乙烯亚胺改性而成的表面。如此，可以有助于所述二氧化硅纳米粒子具有较佳的表面性能。
[0042]
可选地，所述二氧化硅纳米粒子含有氮。如此，可以有助于所述二氧化硅纳米粒子具有较佳的表面性能。
[0043]
可选地，所述二氧化硅纳米粒子含氮量为5％。如此，可以有助于所述二氧化硅纳米粒子具有较佳的表面性能。
[0044]
本发明实施例的另一方面涉及一种制备如上所述的二氧化硅纳米粒子的方法，其包括：将硅源、催化剂、表面活性剂和水在室温混合，以得到二氧化硅颗粒。
[0045]
本发明实施例的技术方案可以有利于基于信使核糖核酸(mrna)的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用等等。
[0046]
具体而言，本发明实施例涉及的方法制备的二氧化硅纳米粒子对细胞的毒性影响较低，可以高效负载、释放信使核糖核酸(mrna)，可以有效地将mrna导入细胞中，转染效率较高，可以有利于基于mrna的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用等。
[0047]
本发明实施例涉及的方法在室温混合，可以有助于形成所述二氧化硅纳米粒子的形状、粒径、孔径，还可以有利于降低制备所述二氧化硅纳米粒子的能源消耗等。
[0048]
可选地，所述硅源包括原硅酸四乙酯、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物。如此，可以有助于形成所述二氧化硅纳米粒子。
[0049]
可选地，所述催化剂包括三羟乙基胺、四丙基氢氧化铵。如此，可以有利于混合时反应的进行。
[0050]
可选地，所述表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵、七氟丁酸钠。如此，可以有助于混合时反应的进行以及所述二氧化硅纳米粒子的形状、粒径、孔径的形成。
[0051]
可选地，十六烷基三甲基溴化铵和七氟丁酸钠的摩尔比范围为0.25-0.5：1。如此，可以有助于混合时反应的进行以及所述二氧化硅纳米粒子的形状、粒径、孔径的形成。
[0052]
可选地，搅拌以混合所述硅源、所述催化剂、所述表面活性剂和水。如此，可以有利于调节所述二氧化硅纳米粒子的尺寸。
[0053]
可选地，对所述二氧化硅颗粒进行膦酸基表面改性后、再进行聚乙烯亚胺改性，以得到聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子。如此，可以有助于所述二氧化硅纳米粒子具有较佳的表面性能。
[0054]
本发明实施例的又一方面涉及一种如前所述的二氧化硅纳米粒子在递送信使核糖核酸中的用途。
[0055]
用本发明实施例涉及的二氧化硅纳米粒子递送信使核糖核酸(mrna)，对细胞的毒性影响较低，可以高效负载、释放mrna，可以有效地将mrna导入细胞中，转染率较高，可以有利于基于mrna的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用等。
[0056]
本发明实施例的再一方面涉及一种复合物，其包括信使核糖核酸和如上所述的二氧化硅纳米粒子。
[0057]
本发明实施例的复合物对细胞的毒性影响较低，可以有利于基于mrna的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用等。
[0058]
可选地，所述二氧化硅纳米粒子与所述mrna的质量比为5：1。如此，可以有助于所述二氧化硅纳米粒子高效地负载所述mrna。
[0059]
可选地，所述信使核糖核酸包括增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸。如此，可以有利于基于mrna的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用等。
[0060]
本发明实施例的又一方面涉及一种如前所述的复合物在制备预防或治疗肿瘤疾病的药物中的用途。
[0061]
本发明实施例的复合物可以用于基于mrna的基因功能研究、基因治疗研究及临床应用等，例如，用于制备预防或治疗肝癌、肺癌、胃癌等肿瘤疾病的药物。
[0062]
下述实验示例可以用于帮助理解本发明实施方式，无意用作对权利要求的限制。
[0063]
实验示例
[0064]
实验示例1：制备二氧化硅颗粒
[0065]
十六烷基三甲基溴化铵(380mg)和150mg的七氟丁酸钠加入含有68mg三羟乙基胺的25ml去离子水中，室温搅拌至十六烷基三甲基溴化铵完全溶解。加入3ml原硅酸四乙酯，室温接着搅拌24h。离心后收集固态的产物。然后，在550℃高温煅烧产物6h，以除去表面活性剂，即得到单分散二氧化硅颗粒。
[0066]
图1为得到的二氧化硅颗粒的透射电镜图，结合其可以表征，二氧化硅颗粒形状为树枝状中心-径向孔隙、粒径为80nm、孔径为20nm，稳定性强。
[0067]
实验示例2：聚乙烯亚胺改性
[0068]
将实验示例1中制得的30mg二氧化硅颗粒分散到10ml水(ph＝10，用氢氧化铵调节)中以形成粒子溶液，然后在粒子溶液中加入10ml、56mmol/l的3-(三羟硅基)丙基甲基膦酸钠溶液，在40℃搅拌2h，实现膦酸基的表面改性。
[0069]
离心和彻底清洗膦酸基表面改性二氧化硅颗粒后,沉淀物产物被重新悬浮于包含有150mg聚乙烯亚胺的15ml碳酸盐缓冲溶液中，在室温搅拌4h后，经离心、水洗、室温干燥过夜，得到单分散的聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子(pei-msn)。
[0070]
元素分析显示，聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子含氮量在5％左右，表明聚乙烯亚胺改性成功。
[0071]
图2是得到的聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子的透射电镜图，结合其可以表征，改性后二氧化硅纳米粒子结构粒径均没有发生太大的改变，形状为树枝状中心-径向孔隙、粒径为80nm、孔径为20nm。
[0072]
通过cck-8分别检测聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子和脂质纳米粒子(lnp，美国insmed公司)对人肾上皮细胞hek293t的毒性影响。图3为聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子(pei-msn)和脂质纳米粒子(lnp)的不同浓度对应的人肾上皮细胞hek293t的细胞活力数据图。如图3所示，聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子的细胞毒性低于脂质纳米粒子，比如，在浓度达到100μg/ml时，聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子对应的细胞活力仍高达75％，而脂质纳米粒子对应的细胞活力则只有50％。
[0073]
实验示例3：制备增强绿色荧光蛋白(egfp，enhanced green fluorescent protein)信使核糖核酸(mrna)溶液
[0074]
以pvax1-egfp质粒为模板，将该质粒扩增，并通过限制性核酸内切酶将扩增后的质粒线性化处理。洗脱沉淀并纯化得到egfp基因dna线性化质粒产物。随后采用t7体外转录
试剂盒，以30μg的egfp基因dna线性化质粒产物为模板，在37℃恒温条件下转录1-2小时，然后在37℃恒温条件下进行5’端加帽和3’端加尾修饰转录得到修饰后的mrna。修饰后的mrna用转录纯化试剂盒进行纯化，最后用去离子水进行洗脱，得到egfp mrna溶液。
[0075]
实验示例4：pei-msn对egfp mrna的负载和释放
[0076]
实验示例2制得的聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子(pei-msn，5μg)和5μg脂质纳米粒子(lnp)分别分散在10μl的10mm pbs溶液中，与实验示例3制得的1μl的egfp mrna溶液(1μg/μl)在4℃条件下混合30min，即，其中pei-msn与egfp mrna的质量比为5:1。
[0077]
然后，以15000rpm离心10min，收集2μl上清液，用nanodrop 1000(thermo scientific)分光光度计在260nm波长进行分析，测定pei-msn和lnp分别对egfp mrna的负载量，数据图示于图4，可见pei-msn的egfp mrna负载量达到75ng/μg，这可能得益于pei-msn较大的枝晶孔隙，而脂质纳米粒子的egfp mrna负载量只有45ng/μg。
[0078]
同时，将载有egfp mrna的pei-msn和lnp分别分散在pbs溶液中，在37℃，以50rpm振荡48h。使用nanodrop 1000(thermo scientific)分光光度计分析在选定时间点(0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h)收集的振荡上清液，测定egfp mrna的累积释放率，所得数据如图5所示，可见pei-msn的egfp mrna累积释放率在8h后就远超lnp，在48h高达80％，而lnp的egfp mrna累积释放率在48h仅有60％。
[0079]
实验示例5：制备pei-msn/egfp mrna复合物
[0080]
以聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子(pei-msn)和egfp mrna为5：1(w/w)的比例将纳米粒溶液(实验示例2中制得的聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子分散于去离子水中，浓度为0.5mg/ml)加入到egfp mrna溶液(实验示例3中制得的egfp mrna溶液分散于去离子水中，浓度为1mg/ml)中，之后立刻用移液枪吹打混匀，再在室温环境静置15分钟，即得pei-msn/egfp mrna复合物。
[0081]
实验示例6：pei-msn/egfp mrna复合物负载至人肾上皮细胞hek293t
[0082]
转染前将人肾上皮细胞hek293t细胞接种于12孔板，其中细胞密度为1.2*105个/孔，培养24h。将实验示例5制得的5μl pei-msn/egfp mrna复合物混合在pbs总量为50μl的培养基中孵育30分钟。然后，在每个接种、培养了人肾上皮细胞hek293t细胞的孔内滴入孵育后的pei-msn/egfp mrna复合物，进一步培养48h进行转染，为实验组。对照组中，除了用实验示例4的负载egfp mrna的lnp纳米粒子替换实验组里的pei-msn/egfp mrna复合物之外，其它所有的实验条件、物料、剂量与实验组一致。
[0083]
图6(a)、(b)、(c)分别为转染后人肾上皮细胞hek293t摄取负载有egfp mrna的pei-msn(聚乙烯亚胺改性二氧化硅纳米粒子/增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸复合物)和对照组的荧光图和转染效率定量图，显示pei-msn能够高效递送egfp mrna，转染效率达到85％，而对照组的转染效率甚至不到65％。
[0084]
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。