1.本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种膜分离法提取高纯度金银花绿原酸的方法。


背景技术：

2.金银花(lonicera japonica)是忍冬初开的花或干燥的花蕾，具有抗病原微生物、抗炎、解热、保肝、降血脂、止血、免疫调节等作用，临床主要用于治疗各种感染、炎症、高血脂、肿瘤放疗等。
3.金银花含有芳香油、绿原酸、黄酮、皂苷和鞣质等生物活性成分，是重要的药食两用植物原料，在食品工业和医药工业中应用广泛。绿原酸是金银花中典型的抗氧化功效成分，有很强的药理活性，对血液系统、消化系统和生殖系统疾病均有显著疗效。
4.绿原酸(chlorogenic acid，ca)是一种缩酚酸，在植物中经莽草酸途径形成的一类苯丙素类化合物，是国际公认的“植物黄金”。现代药理学研究表明，绿原酸具有多种药理活性，如抗肿瘤、降血压、抗病毒等。同时，绿原酸还作为食品添加剂和植物生长激素，广泛应用于食品和化妆品行业。鉴于绿原酸具有多种药理活性和广阔的应用领域，因此如何有效的从金银花中进行提取越来越受到人们的关注。
5.绿原酸的提取方法很多，有水提取法、有机溶剂浸提法、酶解法、超临界流体萃取法、微波辅助法、超声波辅助法等。其中有机溶剂提取法是较经典的方法，另外超声波、微波辅助有机溶剂提取法因提取时间短，操作简单目前应用较为广泛。绿原酸的分离纯化方法也有很多，如金属盐离子沉淀法、重结晶法、β－环状糊精包埋法、有机溶剂萃取法、膜分离法、树脂法、色谱法等。
6.然而目前的金银花绿原酸提取提纯工艺，均存在着原料提取率低、工序繁琐、操作复杂、分离纯化效果欠佳，所得绿原酸的收率和纯度也不是很理想，导致绿原酸提取的生产成本极高，实际推广存在着很大的困难。
7.因此，寻找一种高效提取金银花绿原酸的工艺，提升绿原酸提取率和纯度，降低工艺成本是目前亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

8.本发明针对现有技术中所存在的问题，从原料角度入手，通过复合酶水解技术，促进绿原酸的最大量溶出，再结合微滤超滤纳滤等膜分离技术，以得到高纯度的绿原酸，总体降低使用成本，促进绿原酸的推广和应用。
9.为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：
10.膜分离法提取高纯度金银花绿原酸的方法，绿原酸通过粉碎酶解、加热浸提、大孔树脂吸附、膜分离、喷雾干燥制备得到，具体包括以下步骤：
11.(1)粉碎酶解：将干燥金银花粉碎，加水，加复合酶，28-30℃下混合浸泡12-24h；
12.(2)加热浸提：浸泡结束调节ph为3-4，再次浸泡12-24h；再进行加热浸提，浸提温
度为70-90℃，浸提时间为1.0-2.0小时，将物料固液分离，液体进行离心分离，离心机转速5000r/min离心处理20min，得到浸提液；
13.(3)大孔树脂吸附：调节浸提液ph至3-4，加入大孔树脂柱进行饱和吸附，洗脱时先用水和低浓度乙醇溶液除杂，然后再用较高浓度乙醇洗脱，得到洗脱液；
14.(4)膜分离：洗脱液先打入到微滤膜除杂，然后用超滤膜进行分离提纯，再用截留分子量200的纳滤膜将提取液浓缩至原体积的10％，收集浓缩，得到绿原酸浓缩液；
15.(5)喷雾干燥：浓缩液进入喷雾干燥塔，得到终产品粉料，包装入库即可。
16.进一步的，步骤(1)金银花、水固液比为1g:15ml，复合酶的用量为金银花和水总质量的0.01-0.03％。
17.进一步的，所述复合酶是由纤维素酶和黑曲果胶酶按照1:1混合所得。
18.进一步的，所述黑曲果胶酶是由以下方法制备得到：采用黑曲霉ld-092为出发菌株，经过种子培养和液体发酵培养，经后处理得到黑曲果胶酶。
19.发酵后处理工艺为：液态发酵后发酵液经高速离心，滤液浓缩后经喷雾干燥，得到黑曲果胶酶。
20.斜面培养：挑取一环黑曲霉ld-092接种于固体斜面培养基，30℃下恒温培养36h，得一级种子；
21.摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温30℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；
22.种子培养：种子培养基以g/l计：玉米浆20-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸氢二钾5-15、碳酸钠5-15，培养条件：初始ph4-6，培养温度28-30℃，培养时间8-16h；使用前灭菌处理。
23.二级种子液按照接种量20％(v/v)的比例接入液体发酵培养基中，扩大培养，得发酵液。
24.液体发酵培养：液体发酵培养基以g/l计：玉米浆50-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸氢二钾5-15、酵母膏5-10、碳酸钠5-15，培养条件：初始ph4-6，培养温度28-30℃，培养时间36-60h；使用前灭菌处理。
25.进一步的，所述黑曲霉(aspergillus niger)ld-092菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.18559。
26.本发明纤维素酶采用市售商品化纤维素酶，本发明实施例纤维素酶购自河北颖泉生物科技有限公司。
27.进一步的，步骤(3)所述大孔树脂为大孔树脂ads-7型或hpd500型大孔吸附树脂中的一种。
28.进一步的，步骤(4)中超滤膜的截留分子量为2500-3000的中空纤维超滤膜。
29.有益效果
30.(1)本发明首先使用酶解水提的方式对金银花浸提，所使用的纤维素酶可以分解金银花细胞壁，促进绿原酸的溶出，而辅以黑曲果胶酶，本发明制备的黑曲果胶酶可以在软酸性环境中保持较高的活性，在绿原酸溶出的过程中仍然能够保持较高的酶解活性，配合纤维素酶的使用，可以高效的促进金银花有效物质的溶出，为后续膜分离提纯环节提供物
质前提；
31.(2)其次对水提液大孔树脂洗脱，初步去除杂质，微滤膜去除固体微粒和大分子物质，超滤膜以去除如蛋白质、多糖、鞣质等大分子物质及胶体物质，纳滤膜在常温下截留绿原酸，起到浓缩提纯的目的；整个提纯过程没有使用任何有机溶剂；
32.(3)本发明应用膜分离工艺结合水提酶解工艺，实现了金银花绿原酸的高效提取，不使用任何有机溶剂，极大降低了生产风险和生产成本，绿色无污染，具有广泛的市场应用前景。
附图说明
33.图1为绿原酸标准品色谱图；
34.图2为本发明实施例2纳滤后浓缩液色谱图。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。
36.实施例1
37.膜分离法提取高纯度金银花绿原酸的方法，绿原酸通过粉碎酶解、加热浸提、大孔树脂吸附、膜分离、喷雾干燥制备得到，具体包括以下步骤：
38.(1)粉碎酶解：将干燥金银花粉碎，加水，加复合酶，28-30℃下混合浸泡12h；
39.(2)加热浸提：浸泡结束调节ph为3-4，再次浸泡12h；再进行加热浸提，浸提温度为70℃，浸提时间为1.0小时，将物料固液分离，液体进行离心分离，离心机转速5000r/min离心处理20min，得到浸提液；
40.(3)大孔树脂吸附：调节浸提液ph至3-4，加入大孔树脂柱进行饱和吸附，洗脱时先用水和低浓度乙醇溶液除杂，然后再用较高浓度乙醇洗脱，得到洗脱液；
41.(4)膜分离：洗脱液先打入到微滤膜除杂，然后用超滤膜进行分离提纯，再用截留分子量200的纳滤膜将提取液浓缩至原体积的10％，收集浓缩，得到绿原酸浓缩液；
42.(5)喷雾干燥：浓缩液进入喷雾干燥塔，得到终产品粉料，包装入库即可。
43.步骤(1)金银花、水固液比为1g:15ml，复合酶的用量为金银花和水总质量的0.01％。
44.所述复合酶是由纤维素酶和黑曲果胶酶按照1:1混合所得。
45.所述黑曲果胶酶是由以下方法制备得到：采用黑曲霉ld-092为出发菌株，经过种子培养和液体发酵培养，经后处理得到黑曲果胶酶。
46.发酵后处理工艺为：液态发酵后发酵液经高速离心，滤液浓缩后经喷雾干燥，得到黑曲果胶酶。
47.种子培养：种子培养基以g/l计：玉米浆20-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸氢二钾5-15、碳酸钠5-15，培养条件：初始ph4-6，培养温度28-30℃，培养时间8h；使用前灭菌处理。
48.液体发酵培养：液体发酵培养基以g/l计：玉米浆50-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸氢二钾5-15、酵母膏5-10、碳酸钠5-15，培养条件：初始ph4-6，培养温度28-30℃，培养时间36h；使用前灭菌处理。
49.所述黑曲霉(aspergillus niger)ld-092菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.18559。
50.步骤(3)所述大孔树脂为大孔树脂ads-7型。
51.步骤(4)中超滤膜的截留分子量为2500-3000的中空纤维超滤膜。
52.实施例2
53.膜分离法提取高纯度金银花绿原酸的方法，绿原酸通过粉碎酶解、加热浸提、大孔树脂吸附、膜分离、喷雾干燥制备得到，具体包括以下步骤：
54.(1)粉碎酶解：将干燥金银花粉碎，加水，加复合酶，28-30℃下混合浸泡24h；
55.(2)加热浸提：浸泡结束调节ph为3-4，再次浸泡24h；再进行加热浸提，浸提温度为90℃，浸提时间为2.0小时，将物料固液分离，液体进行离心分离，离心机转速5000r/min离心处理20min，得到浸提液；
56.(3)大孔树脂吸附：调节浸提液ph至3-4，加入大孔树脂柱进行饱和吸附，洗脱时先用水和低浓度乙醇溶液除杂，然后再用较高浓度乙醇洗脱，得到洗脱液；
57.(4)膜分离：洗脱液先打入到微滤膜除杂，然后用超滤膜进行分离提纯，再用截留分子量200的纳滤膜将提取液浓缩至原体积的10％，收集浓缩，得到绿原酸浓缩液；
58.(5)喷雾干燥：浓缩液进入喷雾干燥塔，得到终产品粉料，包装入库即可。
59.步骤(1)金银花、水固液比为1g:15ml，复合酶的用量为金银花和水总质量的0.03％。
60.所述复合酶是由纤维素酶和黑曲果胶酶按照1:1混合所得。
61.所述黑曲果胶酶是由以下方法制备得到：采用黑曲霉ld-092为出发菌株，经过种子培养和液体发酵培养，经后处理得到黑曲果胶酶。
62.发酵后处理工艺为：液态发酵后发酵液经高速离心，滤液浓缩后经喷雾干燥，得到黑曲果胶酶。
63.斜面培养：挑取一环黑曲霉ld-092接种于固体斜面培养基，30℃下恒温培养36h，得一级种子；
64.所述斜面培养基(g/l)：马铃薯100-200，葡萄糖10-20，琼脂1017，ph4.5，121℃灭菌20min。
65.摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温30℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；
66.种子培养：种子培养基以g/l计：玉米浆20-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸氢二钾5-15、碳酸钠5-15，培养条件：初始ph4-6，培养温度28-30℃，培养时间8-16h；使用前灭菌处理。
67.二级种子液按照接种量20％(v/v)的比例接入液体发酵培养基中，扩大培养，得发酵液。
68.液体发酵培养：液体发酵培养基以g/l计：玉米浆50-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸氢二钾5-15、酵母膏5-10、碳酸钠5-15，培养条件：初始ph4-6，培养温度28-30℃，培养时间36-60h；使用前灭菌处理。
69.所述黑曲霉(aspergillus niger)ld-092菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理
中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.18559。
70.步骤(3)所述大孔树脂为大孔树脂hpd500型。
71.步骤(4)中超滤膜的截留分子量为2500-3000的中空纤维超滤膜。
72.对比例1
73.膜分离法提取高纯度金银花绿原酸的方法，绿原酸通过粉碎酶解、加热浸提、大孔树脂吸附、膜分离、喷雾干燥制备得到，具体包括以下步骤：
74.(1)粉碎酶解：将干燥金银花粉碎，加水，加复合酶，28-30℃下混合浸泡24h；
75.(2)加热浸提：浸泡结束调节ph为3-4，再次浸泡24h；再进行加热浸提，浸提温度为90℃，浸提时间为2.0小时，将物料固液分离，液体进行离心分离，离心机转速5000r/min离心处理20min，得到浸提液；
76.(3)大孔树脂吸附：调节浸提液ph至3-4，加入大孔树脂柱进行饱和吸附，洗脱时先用水和低浓度乙醇溶液除杂，然后再用较高浓度乙醇洗脱，得到洗脱液；
77.(4)膜分离：洗脱液先打入到微滤膜除杂，然后用超滤膜进行分离提纯，再用截留分子量200的纳滤膜将提取液浓缩至原体积的10％，收集浓缩，得到绿原酸浓缩液；
78.(5)喷雾干燥：浓缩液进入喷雾干燥塔，得到终产品粉料，包装入库即可。
79.步骤(1)金银花、水固液比为1g:15ml，复合酶的用量为金银花和水总质量的0.03％。
80.所述复合酶为纤维素酶。
81.步骤(3)所述大孔树脂为大孔树脂hpd500型。
82.步骤(4)中超滤膜的截留分子量为2500-3000的中空纤维超滤膜。
83.本对比例除只使用纤维素酶进行酶解外，其余均同实施例2。
84.对比例2
85.膜分离法提取高纯度金银花绿原酸的方法，绿原酸通过粉碎酶解、加热浸提、大孔树脂吸附、膜分离、喷雾干燥制备得到，具体包括以下步骤：
86.(1)粉碎酶解：将干燥金银花粉碎，加水，加复合酶，28-30℃下混合浸泡24h；
87.(2)加热浸提：浸泡结束调节ph为3-4，再次浸泡24h；再进行加热浸提，浸提温度为90℃，浸提时间为2.0小时，将物料固液分离，液体进行离心分离，离心机转速5000r/min离心处理20min，得到浸提液；
88.(3)大孔树脂吸附：调节浸提液ph至3-4，加入大孔树脂柱进行饱和吸附，洗脱时先用水和低浓度乙醇溶液除杂，然后再用较高浓度乙醇洗脱，得到洗脱液；
89.(4)膜分离：洗脱液先打入到微滤膜除杂，然后用超滤膜进行分离提纯，再用截留分子量200的纳滤膜将提取液浓缩至原体积的10％，收集浓缩，得到绿原酸浓缩液；
90.(5)喷雾干燥：浓缩液进入喷雾干燥塔，得到终产品粉料，包装入库即可。
91.步骤(1)金银花、水固液比为1g:15ml，复合酶的用量为金银花和水总质量的0.03％。
92.所述复合酶为黑曲果胶酶。
93.所述黑曲果胶酶是由以下方法制备得到：采用黑曲霉ld-092为出发菌株，经过种子培养和液体发酵培养，经后处理得到黑曲果胶酶。
94.发酵后处理工艺为：液态发酵后发酵液经高速离心，滤液浓缩后经喷雾干燥，得到黑曲果胶酶。
95.斜面培养：挑取一环黑曲霉ld-092接种于固体斜面培养基，30℃下恒温培养36h，得一级种子；
96.所述斜面培养基(g/l)：马铃薯100-200，葡萄糖10-20，琼脂1017，ph4.5，121℃灭菌20min。
97.摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温30℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；
98.种子培养：种子培养基以g/l计：玉米浆20-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸氢二钾5-15、碳酸钠5-15，培养条件：初始ph4-6，培养温度28-30℃，培养时间8-16h；使用前灭菌处理。
99.二级种子液按照接种量20％(v/v)的比例接入液体发酵培养基中，扩大培养，得发酵液。
100.液体发酵培养：液体发酵培养基以g/l计：玉米浆50-100、棉粕40-120、葡萄糖20-60、磷酸氢二钾5-15、酵母膏5-10、碳酸钠5-15，培养条件：初始ph4-6，培养温度28-30℃，培养时间36-60h；使用前灭菌处理。
101.所述黑曲霉(aspergillus niger)ld-092菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.18559。
102.步骤(3)所述大孔树脂为大孔树脂hpd500型。
103.步骤(4)中超滤膜的截留分子量为2500-3000的中空纤维超滤膜。
104.本对比例除只使用黑曲果胶酶进行酶解外，其余均同实施例2。
105.对比例3
106.本对比例除使用的复合酶组成是由纤维素酶和黑曲果胶酶按照1:2混合，其余均同实施例2。
107.对比例4
108.本对比例除使用的复合酶组成是由纤维素酶和黑曲果胶酶按照2:1混合，其余均同实施例2。
109.性能测试
110.(1)绿原酸含量和提取率测试
111.取50g金银花，分别按照实施例2、对比例1-4的方法进行分离提纯，对所得到的浓缩液进行测试；方法为：精密量取样品溶液1ml于10ml容量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液备用；
112.(2)测试方法
113.hplc法：色谱条件agilent eclipse xdb-c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，乙腈(a)：0.1％乙酸(b)为流动相梯度洗脱(0
→
40min，a：5％-29％，b：95％-71％)，检测波长266nm；流速0.9ml/min，柱温30℃，进样体积10μl，记录标准品和供试品的色谱图；
114.(3)标准曲线绘制
115.精密称取绿原酸标准品10mg，50％甲醇溶液溶解，并定容于50ml棕色容量瓶中，逐
级稀释为5、10、20、30、40、50μg/ml的绿原酸标准溶液，得标准谱图。
116.(4)计算方法
117.对照品溶液以及供试品溶液各进样10μl，记录结果，根据保留时间进行定性，相对应色谱峰的峰面积进行定量，计算相应绿原酸含量。公式如下：
[0118][0119]
其中，s为样品峰面积、s0为标准品峰面积，c0为标准品浓度，w为样品重量。
[0120]
绿原酸得率计算公式如下：
[0121][0122]
其中，c为提取液中绿原酸的浓度，v为提取液的体积，n为稀释倍数，m为金银花质量。
[0123]
测试结果如表1所示：
[0124]
表1试验测试结果
[0125] 绿原酸得率％绿原酸浓度mg/l绿原酸纯度％实施例13.4518936.188.5实施例23.4818987.892.5对比例12.7417145.375.1对比例22.8517256.977.2对比例33.0617985.680.1对比例43.0217872.578.9
[0126]
从绿原酸标准品和本发明实施例2样品所得色谱图1-2也可以看出，本发明所得绿原酸纯度较高，杂质较少，可根据市场需求，使用本发明高浓度绿原酸配制低浓度需求产品使用，促进其大规模的推广和应用，整体降低提取成本，具有广泛的市场应用前景。
[0127]
需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。