可用于治疗克拉伯病的组合物


背景技术：

1.作为细小病毒家族的成员，腺相关病毒(aav)是单链线性dna(ssdna)基因组长约4.7千碱基(kb)的小型无包膜二十面体病毒。野生型基因组包括dna链两端处的反向末端重复序列(itr)和两个开放阅读框(orf)：rep和cap。rep由对aav生命周期所需的rep蛋白进行编码的四个重叠基因构成，并且cap含有衣壳蛋白的重叠核苷酸序列：vp1、vp2和vp3，其自组装以形成二十面体对称的衣壳。
2.源自复制缺陷型人细小病毒的重组腺相关病毒(raav)载体已经被描述为用于基因递送的合适媒剂。通常，从载体中去除功能性rep基因和cap基因，从而得到无复制能力的载体。这些功能在载体产生系统期间提供，但在最终的载体中不存在。
3.迄今为止，已经有若干种不同的从人或非人灵长类动物(nhp)中分离的良好表征的aav。已经发现，不同血清型的aav表现出不同转染效率，并且表现出不同细胞或组织的趋性。已经在wo 2005/033321中描述了很多不同aav进化枝，包含进化枝f，所述进化枝在所述文献中被鉴定为具有仅三个成员：aav9、aavhu31和aavhu32。m.a.dimattia等人,《病毒学杂志(j.virol.)》(2012年6月),第86卷,第12期,6947-6958中提供了aav9的结构分析。本文报告了aav9具有由cap基因编码且具有重叠序列的三个可变蛋白(vp)的60个拷贝(总共)。这些分别包含以预测比率1:1:10存在的vp1(87kda)、vp2(73kda)和vp3(62kda)。vp3的整个序列在vp2内，并且所有vp2都在vp1内。vp1具有独特的n端结构域。修正的坐标和结构因子可在登录号3ux1下从rcsb pdb数据库获得。
4.若干个不同的aav9变体已经被工程化以脱靶或靶向不同组织。参考例如n.pulicheria,“工程化心脏和肌肉骨骼基因转移的脱靶肝脏的aav9载体(engineering liver-detargeted aav9 vectors for cardiac and musculoskeletal gene transfer)”,《分子疗法(molecular therapy)》,第19卷,第6期,第1070-1078页(2011年6月)。也已经报告了用于跨脑血屏障递送基因的aav9变体的产生。参考例如b.e.deverman等人,《自然生物技术(nature biotech)》,第34卷,第2期,第204-211页(2016年2月1日在线公开)和caltech新闻稿,a.wetherston,www.neurology-central.com/2016/02/10/successful-delivery-of-genes-through-the-blood-brain-barrier/,accessed 10/05/2016。还参考wo 2016/0492301和us 8,734,809。
5.最近，在扩增来自自然来源的衣壳基因之后鉴定出的aavhu68被鉴定为新aav衣壳。参见例如wo 2018/160582。如aav9一样，这种aav在进化枝f内。
6.克拉伯病(krabbe disease，球状细胞脑白质病变；gld)是由对水解酶半乳糖神经酰胺酶(galc)进行编码的基因中的突变引起的常染色体隐性溶酶体贮积病(lsd)(wenger d.a.等人,(2000)《分子遗传学与新陈代谢(mol genet metab.)》,70(1):1-9)。这种酶负责降解某些半乳糖脂，包含几乎仅在髓鞘中发现的半乳糖苷神经酰胺(神经酰胺)和半乳糖苷鞘氨醇(鞘氨醇半乳糖苷)。在克拉伯病中，galc缺陷引起溶酶体中的鞘氨醇半乳糖苷的毒性累积(svennerholm等人,1980)。鞘氨醇半乳糖苷累积对于cns中产生髓磷脂的少突胶质细胞和pns中的许旺细胞都是特别有毒的，从而导致这些细胞类型快速且广泛的死亡。cns
和pns两者中的髓磷脂分解伴随有反应性星形细胞胶质细胞增生和巨大的多核巨噬细胞(“球状细胞”)浸润(suzuki k.,(2003)《儿童神经学杂志(j child neurol.)》,18(9):595-603)。在不存在galc活性的情况下，半乳糖苷神经酰胺主要由于另一种酶(gm1神经节苷脂β-半乳糖苷酶)水解(kobayashi t.等人,(1985)《生物化学杂志(j biol chem.)》260(28):14982-7)以及有助于抑制半乳糖苷神经酰胺合成的少突胶质细胞死亡(svennerholm l.等人,(1980)《脂类研究杂志(j lipid res.)》,21(1):53-64)而不累积。
7.目前可用于克拉伯病的仅有疾病修饰治疗是通常由脐带血移植(ucbt)、同种异体外周血干细胞或同种异体骨髓提供的造血干细胞移植(hsct)。使用hsct治疗通常在患者一周岁之前表现出症状的患有婴儿克拉伯病的患者收效甚微。当在婴儿克拉伯病显性症状发作之后执行时，hsct仅提供最少神经学改善而没有显著提高存活率(escolar m.l.等人,(2005)《新英格兰医学期刊(n engl j med.)》,352(20):2069-81)。当在症状发生前的患者中执行时，hsct是有效的，但即使如此，运动结果不好(escolar m.l.等人,(2005)《新英格兰医学期刊》,352(20):2069-81；wright m.d.等人,(2017)《神经病学(neurology)》,89(13):1365-1372；van den broek b.t.a.等人,(2018)《血液进展(blood adv.)》,2(1):49-60)。在30天日龄之前移植的婴儿与之后移植的那些婴儿相比具有更好的存活率和功能性结果(allewelt h.等人,(2018)《血液与骨髓移植生物学(biol blood marrow transplant)》,24(11):2233-2238)。据报告，与未经治疗或症状发作之后治疗的婴儿克拉伯病患者相比，症状发生前的移植产生关于进行性中央髓鞘形成、正常接受性语言、症状严重程度衰减和更长存活期的显著更好的结果。(escolar m.l.等人,(2005)《新英格兰医学期刊》,352(20):2069-81；duffner p.k.等人,(2009)《遗传学与医学(genet med.genet med.)》11(6):450-4；wright m.d.等人,(2017)《神经病学》,89(13):1365-1372)。即使如此，症状出现之前治疗的大多数儿童的身高和体重都远低于平均值，并且具有从轻度痉挛到无法独立行走的进行性粗大运动延迟(escolar m.l.等人,(2005)《新英格兰医学期刊》,352(20):2069-81；duffner p.k.等人,(2009)《遗传学与医学》11(6):450-4)。一些儿童还具有残留损伤，包含获得性头小畸形、需要胃造口术和构音障碍(duffner p.k.等人,(2009)《遗传学与医学》11(6):450-4)。此外，hsct似乎仅影响cns特异性疾病的病理学。与pns病理学相关的临床特征(如外周神经病变)仍不受hsct的影响。这些结果突出了hsct的限制，特别是快速疾病进展赶超造血干细胞移植、迁移到cns所需的时间的早期发作形式，通过galc分泌和交叉校正(即由校正细胞分泌的酶由galc缺陷性细胞摄取的过程)来区分并提供治疗效果。
8.本领域仍然需要针对克拉伯病患者的经改进的治疗。


技术实现要素：

9.提供了一种包括重组腺相关病毒(raav)的组合物，所述raav包括靶向中枢神经系统中的细胞的aav衣壳和载体基因组，所述载体基因组包括：(i)半乳糖神经酰胺酶编码序列，所述半乳糖神经酰胺酶编码序列对成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白进行编码，所述成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白具有seq id no:10中的氨基酸序列，所述蛋白处于引导所述蛋白质表达的调控序列的控制下；以及(ii)将所述载体基因组包装在所述aav衣壳中所必需的aav反向末端重复序列，其中所述载体基因组包装在所述aav衣壳中。在某些实施例中，所述aav衣
壳来自aavhu68衣壳。在某些实施例中，所述编码序列具有seq id no:9的核酸序列或与其95％到99.9％相同的序列。在某些实施例中，所述编码序列对seq id no:10的成熟蛋白和适合于中枢神经系统中的人细胞的外源信号肽进行编码。在某些实施例中，所述调控序列包括：β肌动蛋白启动子、内含子和/或兔珠蛋白polya。在某些实施例中，所述组合物包括具有载体基因组cb7.ci.hgalc.rbg的raav。
10.在某些实施例中，提供了一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒包括靶向中枢神经系统中的细胞的aav衣壳和载体基因组，所述载体基因组包括：(i)半乳糖神经酰胺酶编码序列，所述半乳糖神经酰胺酶编码序列对成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白进行编码，所述成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白具有seq id no:10中的氨基酸序列，所述蛋白处于引导所述成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白表达的调控序列的控制下；以及(ii)将所述载体基因组包装在aav衣壳中所必需的aav反向末端重复序列。在某些实施例中，所述aav衣壳来自aavhu68衣壳。在某些实施例中，所述编码序列具有seq id no:9的核酸序列或与其95％到99.9％相同的序列。在某些实施例中，所述编码序列对seq id no:10的成熟蛋白和适合于中枢神经系统中的人细胞的外源信号肽进行编码。在某些实施例中，所述调控序列包括β肌动蛋白启动子、内含子和/或兔球蛋白polya。在某些实施例中，所述载体基因组是cb7.ci.hgalc.rbg。
11.在某些实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包括可用于治疗克拉伯病的raav原液。在某些实施例中，提供了一种包括raav原液的组合物的用途，其用于制备药物。在某些实施例中，所提供的组合物可用于治疗外周神经的功能障碍和/或治疗克拉伯病。在某些实施例中，所述raav可与造血干细胞疗法、骨髓移植和/或底物减少疗法作为共疗法施用。
12.在某些实施例中，提供了一种包括半乳糖神经酰胺酶编码序列的质粒，所述半乳糖神经酰胺酶编码序列对信号肽和成熟人半乳糖神经酰胺酶蛋白进行编码，所述成熟人半乳糖神经酰胺酶蛋白具有seq id no:10(aa 43到685)中的氨基酸序列。在某些实施例中，所述质粒包括seq id no:9的核酸序列或与其95％到99.9％相同的序列。
13.在某些实施例中，提供了一种组合物的用途，其用于治疗克拉伯病、校正引起呼吸衰竭的外周神经的功能障碍和由克拉伯病引起的运动功能丧失、或延缓由克拉伯病引起的癫痫的发作或频率，所述治疗、校正或延缓包括向患者施用包括重组腺相关病毒(raav)原液的组合物，所述raav包括：(a)靶向中枢神经系统中的细胞的aav衣壳；以及(b)载体基因组，所述载体基因组包括半乳糖神经酰胺酶编码序列，所述半乳糖神经酰胺酶编码序列对成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白进行编码，所述成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白具有seq id no:10中的氨基酸序列，所述蛋白处于引导所述蛋白质表达的调控序列的控制下，所述载体基因组进一步包括将所述载体基因组包装在aav衣壳中所必需的aav反向末端重复序列，其中所述载体基因组包装在所述aav衣壳中。在某些实施例中，所述患者患有晚期婴儿克拉伯病(likd)。在某些实施例中，所述患者患有青少年克拉伯病(jkd)。在某些实施例中，所述患者患有青年/成人发作性克拉伯病。在某些实施例中，所述raav可与造血干细胞移植(hsct)、骨髓移植和/或底物减少疗法作为共疗法施用。在某些实施例中，所述raav通过鞘内、脑室内或器官实质内施用递送。
14.在某些实施例中，所提供的组合物被调配用于鞘内、脑室内或器官实质内施用。在某些实施例中，所述组合物通过计算机断层扫描(ct)引导的枕骨下注射以单剂量施用于小
脑延髓池中(小脑延髓池内)。
15.通过以下对本发明的详细描述，本发明的这些和其它方面将变得显而易见。
附图说明
16.图1提供了aav9(seq id no:4)和aavhu68(seq id no:2)衣壳序列的比对。在aav9衣壳与aavhu68衣壳之间不同的两个氨基酸定位在衣壳的vp1区域(67，157)和vp2(157)区域中。缩略语：aav9，腺相关病毒血清型9；aavhu68；腺相关病毒血清型hu68；vp1，病毒蛋白1；vp2，病毒蛋白。
17.图2示出了cb7.ci.hgalc.rbg载体基因组的示意图。线性映射描绘了载体基因组，所述载体基因组被设计成表达在普遍存在的cb7启动子的控制下的人galc。cb7由位于cmv ie增强子与鸡β肌动蛋白(cb)启动子之间的杂合体构成。缩略语：cmv ie，巨细胞病毒立即早期；galc，半乳糖神经酰胺酶；itr，反向末端重复序列；polya，聚腺苷酸化；rbg，兔β珠蛋白。
18.图3示出了插入有工程化cgalc基因(cgalcco)的penn.aav.cb7.ci.rbg(p1044)的载体图。
19.图4a示出了twitcher小鼠(twi/twi)的神经病理学和行为表型的进展。小鼠显示细胞毒性鞘氨醇半乳糖苷累积，随后是由吞噬球状细胞浸润pns和cns白质。在髓鞘形成的初始时间段之后，由于形成髓鞘的许旺细胞和少突胶质细胞死亡，因此分别在pns中、随后是cns中观察到较小程度的脱髓鞘。由震颤、抽搐、后肢无力组成的行为表型表现在约pnd 20，随后是需要安乐死的后续瘫痪和体重减轻表现在约pnd 40。改编自(nicaise a.m.等人,(2016)《神经科学研究杂志(j neurosci res.)》94(11):1049-61)。缩略语：cns，中枢神经系统；pnd，出生后天数；pns，外周神经系统；twi，twitcher功能丧失等位基因。
20.图4b示出了使用twitcher小鼠模型评价aav.cb7.cgalcco.rbg基因疗法的研究设计。
21.图5示出了在向症状发生前twitcher小鼠静脉内或脑室内施用raavhu68.hgalc之后的存活率曲线。在pnd 0，向新生twitcher小鼠高剂量iv施用raavhu68.hgalc(1.00
×
10
11
gc[相当于1.00
×
10
14
gc/kg])导致49天的中值存活期(n＝6)。在pnd0，向新生twitcher小鼠icv施用5倍的更低剂量的raavhu68.hgalc(2.00
×
10
10
gc)导致61.5天的中值存活期(n＝10)。将施用raavhu68.hgalc的twitcher小鼠的存活期与icv施用媒剂(pbs)作为对照的年龄匹配的twitcher小鼠的存活期进行比较(n＝8)。缩略语：gc，基因组拷贝；icv，脑室内；iv，静脉内；n，动物数量；pnd，出生后天数。
[0022]
图6示出了在使用不同aav衣壳向症状发生前twitcher小鼠脑室内递送galc之后的存活率曲线。在pnd 0，icv施用剂量为2.00
×
10
10
gc的aavhu68载体(raavhu68.hgalc)赋予61.5天的中值存活期(n＝10)。在pnd 0，icv施用剂量为2.00
×
10
10
gc的aav1、aav3b或aav5载体导致小于60天的中值存活期(aav1：57天[n＝6]，aav3b：51天[n＝9]，aav5：51天[n＝6])，而在pnd 0仅icv施用媒剂(pbs)的对照twitcher小鼠显示43天的中值存活期(n＝8)。缩略语：aav3b，aav血清型3b；aav5，aav血清型5；aav1，aav血清型1；以及aavhu68，aav血清型hu68(raavhu68.hgalc)；gc，基因组拷贝；icv，脑室内；n，动物数量；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pnd，出生后天数。
[0023]
图7示出了在向症状发生前twitcher小鼠脑室内施用不同剂量的raavhu68.hgalc之后的神经运动功能。在pnd 0，向症状发生前twitcher小鼠(twi/twi)icv施用剂量为2.00
×
10
10
gc(n＝10)、5.00
×
10
10
gc(n＝12)或1.00
×
10
11
gc(n＝12)的raavhu68.hgalc。每克脑质量(新生小鼠为0.15g)的剂量分别相当于1.30
×
10
11
gc/g、3.30
×
10
11
gc/g和6.70
×
10
11
gc/g。作为对照，在pnd 0向年龄匹配的症状发生前twitcher小鼠(twi/twi)(n＝8)和年龄匹配的未受影响的小鼠(twi/+或+/+；n＝14)icv施用pbs。在pnd 35，通过在最初以5rpm旋转并且在120秒内增加到40rpm的加速杆上奔跑的小鼠跌落的时间(秒)评估神经运动功能。通过单向anova，随后是邓恩多重比较检验(dunn's multiple comparison test)确定**p《0.01。缩略语：anova，方差分析；gc，基因组拷贝；icv，脑室内；n，动物数量；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pnd，出生后天数；rpm，每分钟转数。
[0024]
图8示出了在向症状发生前twitcher小鼠脑室内施用不同剂量的raavhu68.hgalc之后的存活率曲线。icv施用媒剂(pbs)的对照twitcher小鼠(twi/twi)显示出43天的中值存活期(n＝8)。在pnd 0，icv施用raavhu68.hgalc的twitcher小鼠(twi/twi)在2.00
×
10
10
gc的剂量下显示出61.5天的中值存活期(n＝10)，在5.00
×
10
10
gc的剂量下显示出99天的中值存活期(n＝12)，并且在1.00
×
10
11
gc剂量下显示出130天的中值存活期(n＝12)。每克脑质量(新生小鼠为0.15g)的raavhu68.hgalc剂量分别相当于1.30
×
10
11
gc/g、3.30
×
10
11
gc/g和6.70
×
10
11
gc/g。缩略语：gc，基因组拷贝；icv，脑室内；n，动物数量；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pnd，出生后天数。
[0025]
图9示出了在向有症状twitcher小鼠脑室内施用raavhu68.hgalc之后的神经运动功能。在pnd 0，向症状发生前新生twitcher小鼠(twi/twi)icv施用剂量为1.00
×
10
11
gc(n＝12)的raavhu68.hgal。在pnd 12，向早期有症状twitcher小鼠(twi/twi)icv施用剂量为1.00
×
10
11
gc(n＝12)或2.00
×
10
11
gc(n＝11)的raavhu68.hgalc。在pnd 21，向晚期有症状twitcher小鼠(twi/twi)icv施用剂量为2.00
×
10
11
gc(n＝16)的raavhu68.hgalc。在pnd 12，向年龄匹配的未受影响的小鼠(twi/+和+/+；n＝27)和受影响的twitcher小鼠(twi/twi；n＝15)icv施用媒剂(pbs)作为对照。在pnd 35，通过在最初以5rpm旋转并且在120秒内增加到40rpm的加速杆上奔跑的小鼠跌落的时间(秒)评估神经运动功能。通过单向anova，随后是邓恩多重比较检验确定**p《0.01和***p《0.001。缩略语：anova，方差分析；gc，基因组拷贝；icv，脑室内；n，动物数量；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pnd，出生后天数；rpm，每分钟转数。
[0026]
图10示出了在向有症状twitcher小鼠脑室内施用raavhu68.hgalc之后的存活率曲线。在pnd 12，以1.00
×
10
11
gc(n＝12)或2.00
×
10
11
gc(n＝11)的剂量icv施用raavhu68.hgalc的早期有症状twitcher小鼠(twi/twi)的中值存活期分别为71天或81天。在pnd 21，以2.00
×
10
11
gc(n＝16)的剂量icv施用raavhu68.hgalc的晚期有症状twitcher小鼠(twi/twi)的中值存活期为51.5天。通过比较，在pnd 0或pnd 12icv施用媒剂(pbs)的对照twitcher小鼠(twi/twi；历史对照；从研究1开始n＝8[pnd 0]和从研究2开始n＝4[pnd 12])显示出小于50天的中值存活期。缩略语：gc，基因组拷贝；icv，脑室内；n，动物数量；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pnd，出生后天数。
[0027]
图11a和图11b示出了在向有症状twitcher小鼠脑室内施用raavhu68.hgalc之后的临床评分和神经运动功能。在pnd 12，向早期有症状twitcher小鼠(twi/twi；n＝9)icv施
用剂量为2.00
×
10
11
gc的raavhu68.hgalc。在pnd 12，向年龄匹配的早期有症状twitcher小鼠(twi/twi；n＝9)、未受影响的twitcher杂合小鼠(twi/+；n＝10)和野生型小鼠(n＝8)icv施用pbs作为对照。(图11a)从pnd 22开始，每天对每只小鼠进行评估，直到在pnd 40进行尸检以使用临床评分评估测定抱握能力、步态、震颤、驼背和皮毛质量。每只动物指配有累积得分，然后在研究持续时间内，通过aav处理使所述累积得分归一化。更高得分表明更差的临床状态。(图11b)在pnd 35，通过在最初以5rpm旋转并且在120秒内增加到40rpm的加速杆上奔跑的小鼠跌落的时间(秒)评估神经运动功能。通过单向anova，随后是邓恩多重比较检验确定*p《0.05。缩略语：gc，基因组拷贝；icv，脑室内；n，动物数量；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pnd，出生后天数；rpm，每分钟转数。
[0028]
图12示出了在向有症状twitcher小鼠脑室内施用raavhu68.hgalc之后的坐骨神经组织学。在pnd 12，向早期有症状twitcher小鼠(twi/twi；n＝9)icv施用剂量为2.00
×
10
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gc的raavhu68.hgalc。在pnd 12，向年龄匹配的早期有症状twitcher小鼠(twi/twi；n＝9)和未受影响的野生型小鼠(n＝8)icv施用pbs作为对照。二十八天之后在pnd 40，对小鼠进行尸检，并且获得坐骨神经的样品。对组织切片进行luxol blue和pas反应染色，以分别可视化髓磷脂(暗染色)和球状细胞(亮染色)。缩略语：gc，基因组拷贝；icv，脑室内；n，动物数量；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pas，过碘酸-希夫；pnd，出生后天数。
[0029]
图13a-图13c示出了在出生后第12天向有症状twitcher小鼠脑室内施用raavhu68.hgalc后28天的galc活性。在pnd 12，向早期有症状twitcher小鼠(twi/twi；n＝9)icv施用剂量为2.00
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gc的raavhu68.hgalc。在pnd 12，向年龄匹配的早期有症状twitcher小鼠(twi/twi；n＝9)和未受影响的野生型小鼠(n＝8)icv施用pbs作为对照。二十八天之后在pnd 40，对小鼠进行尸检，并且获得脑、肝和血清的样品。基于荧光团的测定用于定量galc酶活性水平(相对fu)。缩略语：fu，荧光单位；galc，半乳糖神经酰胺酶；gc，基因组拷贝；icv，脑室内；n，动物数量；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pnd，出生后天数。
[0030]
图14a和图14b示出了在raavhu68.hgalc和骨髓移植的组合疗法之后的间歇存活率曲线。使用仅bmt(n＝13，pnd 10)、仅raavhu68.hgalc(n＝12，pnd 0或n＝13，pnd 12；icv；1.00
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gc)、raavhu68.hgalc处理twitcher小鼠(twi/twi)，随后是bmt(n＝7；分别pnd 0和pnd 10)，或者bmt随后是raavhu68.hgalc(n＝7；分别pnd 10和pnd 12)。仅施用pbs的twitcher小鼠(twi/twi)用作历史对照(n＝8，研究1，pnd 0；n＝4，研究2，pnd 12)。示出了间歇存活率结果，并且实验仍在继续。缩略语：bmt，骨髓移植；gc，基因组拷贝；icv，脑室内；n，动物数量；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pnd，出生后天数。
[0031]
图15示出了呈现的克拉伯犬的神经病理学和行为表型的进展(wenger d.a.等人,(1999)《遗传学杂志(j hered.)》90(1):138-42；bradbury a.等人,(2016)《神经辐射学杂志(neuroradiol j.)》,29(6):417-424；bradbury a.m.等人,(2016b)94(11):1007-17；bradbury a.m.等人,(2018)《人类基因疗法(hum gene ther)》,29(7):785-801)。虚线表示指定表型的较早时间点的数据尚未被描述。*星号是指组织学上观察到的脱髓鞘。缩略语：baer，脑干听觉诱发应答；cns，中枢神经系统；mri，磁共振成像；ncv，神经传导速度；pns，外周神经系统。
[0032]
图16示出了1/2期首次人体临床试验的设计。队列1(低剂量)和队列2(高剂量)中对三个受试者中的每个受试者进行给药，随后是在3号受试者和6号受试者之后进行强制性
安全委员会审查。在队列1和队列2中的第一名受试者登记之后的30天间隔之后，每个队列中的后两名受试者同时登记。随后，队列3(mtd)中的6名受试者同时登记，而不需要交错给药。缩略语：fih，首次人体；ltfu，长期随访；mtd，最大耐受剂量。
[0033]
图17示出了所提议的1/2期试验的安全评估的决策树。*研究中止标准包含任何事件，其中多于一名受试者经历如通过调查者评估的与研究性产品或icm注射程序相关的3级或更高级的ae。**医疗审查由医疗监督员协同主要调查者进行。***队列3受试者是同时登记的。在mtd下的给药不交错，其中每个受试者之间有4周安全观察期，并且在队列3中的前3名受试者登记之后，不需要进行安全委员会审查。缩略语：ae，不良事件；icm，小脑延髓池内；mtd，最大耐受剂量；srt，安全审查触发。
[0034]
图18a、图18b和图18c示出了1/2期试验的事件安排的表格。
[0035]
图19示出了hsct之后8周的野生型和twitcher(克拉伯)小鼠的小脑中的gfp+供体细胞的脑移植。
[0036]
图20示出了施用具有工程化galc(cgalcco)或自然犬类galc(cgalnat)序列的raavhu68的twitcher小鼠中的血清gacl活性的比较。与具有自然序列的raavhu68相比，在施用raavhu.cgalcco的twitcher小鼠中观察到经改进的存活率。
[0037]
图21示出了反式质粒paav2/hu68.kanr(p0068)的线性载体图。缩略语：aav2，腺相关病毒血清型2；aavhu68，腺相关病毒血清型hu68；bp，碱基对；cap，衣壳；kanr，卡那霉素抗性；ori，复制起点；rep，复制酶。
[0038]
图22a和图22b示出了腺病毒辅助质粒paddeltaf6(kanr)。(图22a)通过中间体padδf1和padδf5，从亲本质粒pbhg10得到辅助质粒padδf6。(图22b)由卡那霉素抗性基因置换padδf6中的氨苄青霉素抗性基因，以产生padδf6(kan)。
[0039]
图23示出了评价克拉伯犬的aav.cb7.cgalcco.rbg基因疗法的研究设计。
[0040]
图24a-图24c示出了在向克拉伯犬icm施用aavhu68.cgalc之后的存活率和向csf中的酶分泌。(图24a)存活率曲线(正在进行的)。(图24b和图24c)使用荧光底物测量的csf中的galc活性(标记基因技术股份有限公司(marker gene techonologies,inc.)，目录号：m2774)。
[0041]
图25a-图25d示出了在施用aavhu68.cgalc之后的克拉伯犬的胫骨运动神经(图25a)和桡骨感觉神经(图25b)、坐骨运动神经(图25c)和尺骨运动神经(图25d)的神经传导速度(ncv)。周期性ncv记录示出了克拉伯假手术处理的犬的减缓的(图25a)或未检测到的(图25b)信号，而所有四只raavhu68.cgalc处理的动物具有与年龄匹配的wt对照犬相似的归一化速度。
[0042]
图25e示出了假手术处理的和raavhu68.cgalc处理的克拉伯犬的神经系统检查的结果。
[0043]
图26a-图26c示出了假手术处理的和aavhu68.cgalc处理的克拉伯犬的脑切片的组织学结果。(图26a)髓鞘的luxol blue染色。(图26b)iba1免疫染色(小胶质细胞标志物)和(图26c)定量。
[0044]
图27示出了野生型(媒剂处理的)和接受媒剂或aavhu68.cgalc的克拉伯犬的体重曲线。
[0045]
图28a和图28b示出了假手术处理的克拉伯犬和野生型犬以及施用aavhu68.cgalc
的克拉伯犬的csf和感觉神经元安全监测。(图28a)csf脑脊液细胞增多。(图28b)aavhu68.cgalc处理的克拉伯犬的背根神经节组织学。
[0046]
图29a示出了对假手术处理的克拉伯犬和野生型犬以及施用aavhu68.cgalc的克拉伯犬的mrt测量。图29b示出了图29a中的mri测量的累积评分。
[0047]
图30示出了载体产生的制造工艺流程图。缩略语：aex，阴离子交换；crl，查尔斯河实验室(charles river laboratories)；ddpcr，液滴数字聚合酶链反应；dmem，杜氏改性伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium)；dna，脱氧核糖核酸；ffb，最终调配物缓冲液；gc，基因组拷贝；hek293，人胚胎肾293细胞；itffb，鞘内最终调配物缓冲液；pei，聚乙烯亚胺；sds-page，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；tff，切向流过滤；usp，美国药典(united states pharmacopeia)；wcb，工作细胞库。
[0048]
图31示出了载体调配的制造工艺流程图。缩略语：ad5，腺病毒血清型5；auc，分析超速离心；bds，原料药物质(bulk drug substance)；bsa，牛血清白蛋白；cz，晶体天顶(crystal zenith)；ddpcr，液滴数字聚合酶链反应；e1a，早期区域1a(基因)；elisa，酶联免疫吸附测定；fdp，最终药物产品；gc，基因组拷贝；hek293，人胚胎肾293细胞；itffb，鞘内最终调配物缓冲液；kanr，卡那霉素抗性(基因)；ms，质谱；ngs，下一代测序；qpcr，定量聚合酶链反应；sds-page，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；tcid50 50％组织培养物感染剂量；uplc，超高效液相色谱；usp，美国药典。
具体实施方式
[0049]
提供了一种表达人半乳糖神经酰胺酶(galc)蛋白的重组腺相关病毒(raav)以及含有所述raav的组合物和其用途。在某些实施例中，raav.hgalc第一次提供了用于有症状婴儿克拉伯患者(早期婴儿克拉伯病，eikd)的疾病修饰治疗。在某些实施例中，raav.hgalc提供了用于症状发生前婴儿患者的治疗。在某些实施例中，raav.hgalc提供了可以校正引起呼吸衰竭和运动功能丧失的外周神经的疗法。在某些实施例中，raav.hgalc向受益-风险比不支持造血干细胞移植(hsct)的晚期发作患者的治疗提供了另外选项，所述hsct是目前仅有的疾病修饰治疗。
[0050]
如本文所使用的，“raav.galc”是指具有aav衣壳的raav，已经包装在所述aav衣壳中的载体基因组至少含有半乳糖神经酰胺酶蛋白(酶)的编码序列。raavhu68.galc是指raav，其中aav衣壳是本文所定义的aavhu68衣壳。以下实例还展示了其它aav衣壳。
[0051]
术语“cgalc”是指表达如在研究犬的以下实例中使用的犬类galc的编码序列。犬类galc具有26bp信号肽和总长度为669个氨基酸的蛋白质。
[0052]
术语“hgalc”是指人galc的编码序列。
[0053]
hgalc的同种型1是典型序列并且长度为685个氨基酸。这种氨基酸序列在seq id no:6中再现。成熟蛋白质定位在约氨基酸43到约685处，并且信号肽定位在位置1到42中，尽管一些建议认为初始met位于位置17处而非位置1处。尽管gacl的多种同种型是已知的(同种型1-5)并且已经描述了超过三打自然变体，但是本发明的发明人已经发现，在641位置处具有苏氨酸(t)到丙氨酸(a)突变的变型是尤其期望的。seq id no:10中提供这个序列。这种变体是由本文所提供的raav和载体基因组的实例中展示的人半乳糖神经酰胺酶(hgalc)编码序列编码的蛋白质序列。半乳糖神经酰胺酶(galc)也被称为半乳糖脑苷酯酶，并且这
些名称可互换使用。在某些实施例中，这种变体可以在酶置换疗法或共疗法中使用。
[0054]
如本文所使用的，“cb7.ci.hgalc.rbg”是指含有在普遍存在的cb7启动子的控制下的人galc的编码序列并且至少包含侧接有5'itr和3'itr的cmv ie(巨细胞病毒立即早期)增强子、嵌合内含子和兔β珠蛋白(rbg)polya序列的载体基因组(例如，如图2所描绘的)。在某些实施例中，cb7.ci.hgalc.rbg包含对具有seq id no:10的氨基酸序列的成熟galc蛋白进行编码的galc编码序列。在某些实施例中，cb7.ci.hgalc.rbg包含含有seq id no:9的核酸序列或与其95％到99.9％相同的序列的galc的编码序列。在又另一个实施例中，cb7.ci.hgalc.rbg载体基因组包含seq id no:19。在某些实施例中，cb7.ci.hgalc.rbg含有seq id no:10的成熟蛋白和外源信号肽的编码序列。
[0055]
在某些实施例中，设想到一种融合蛋白，所述融合蛋白至少含有成熟galc，其中自然信号肽的全部或一部分被去除(aa 1-17或aa 1-42)并且被外源信号肽取代。此类融合蛋白可以含有外源信号肽和至少成熟的人galc蛋白(例如，seq id no:6或seq id no:10的氨基酸43到695)。在某些实施例中，所述融合蛋白含有适合于cns中的人细胞的外源信号肽，即被天然信号肽取代以改善产生、胞内运输和/或人cns中存在的细胞中的蛋白质分泌(即，hgalc)的信号肽。适合于cns中的人细胞的外源信号肽包含但不限于自然发现于免疫球蛋白(例如，igg)、细胞因子(例如，il-2、il12和il18等)、胰岛素、白蛋白、β-葡萄糖醛酸酶、碱性蛋白酶、血管假性血友病因子(von willebrand factor，vwf)或纤连蛋白分泌信号肽(还参考例如，www.signalpeptide.de/index.php？m＝listspdb_mammalia)的信号肽。
[0056]
本发明还涵盖对本文所提供的gacl蛋白进行编码的核酸序列(例如，seq id no:6、seq id no:10或包括成熟galc的融合蛋白)。在某些实施例中，编码序列是对蛋白质进行编码的cdna序列。然而，还涵盖对应的rna序列。
[0057]
在某些实施例中，核酸编码序列具有seq id no:5的cdna序列或与其95％到99.9％相同的序列或其片段。合适的片段包含成熟蛋白的编码序列(约nt 127到约nt 2058)或具有信号肽片段的成熟蛋白的编码序列(例如，约nt 54到约nt 2058)。在某些实施例中，编码序列具有对seq id no:5(nt 127到2058)的成熟hgalc或包括其和外源前导序列的融合蛋白进行编码的核酸序列或与其95％到99.9％相同的序列。在某些实施例中，编码序列具有对seq id no:5(nt 127到2058)的成熟hgalc进行编码的核酸序列或与其95％到99.9％相同的序列，或其包括前导序列和成熟hgalc的片段的片段。在某些实施例中，编码序列对具有seq id no:10的氨基酸序列的全长人galc蛋白进行编码。在某些实施例中，编码序列对seq id no:5的hgalc前导序列(核酸1到126)和(由核酸127到2058编码的)成熟蛋白进行编码。
[0058]
在某些实施例中，表达盒包括抑制背根神经节(drg)中的hgalc表达的一个或多个mirna靶序列(参考例如于2020年2月12日提交的国际专利申请第pct/us19/67872号，所述国际专利申请通过引用并入本文中)。
[0059]
如本文所使用的，克拉伯病(也称为球状细胞脑白质病变(gld))是由影响半乳糖神经酰胺酶(galc)活性(即负责降解髓鞘半乳糖脂的酶)的突变引起的溶酶体贮积病。已经根据酶缺陷的严重程度描述了若干种类型的克拉伯病。从最严重到最不严重的酶缺陷为：≤6月龄发作定义的早期婴儿克拉伯病(eikd)；7个月到12个月发作定义的晚期婴儿克拉伯病(likd)；13个月到10年发作定义的青少年克拉伯病(jkd)；以及青年/成人发作性克拉伯
病。
[0060]
在某些实施例中，raav.galc载体的有效量将csf中的galc酶水平增加到正常水平的约30％到约100％内。在其它实施例中，raav.galc载体的有效量将质粒中的galc酶水平增加到正常水平的约30％到约100％内。在某些实施例中，观察到galc的较低量的增加的csf或质粒水平，但是在与如本文所述的克拉伯病相关的一种或多种症状中观察到改善。
[0061]“重组aav”或“raav”是含有两个元件的抗dnase的病毒颗粒、aav衣壳和至少含有包装在aav衣壳内的非aav编码序列的载体基因组。除非另有说明，否则此术语可以与短语“raav载体”互换使用。raav是“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”，因为其缺少任何功能性aav rep基因或功能性aav cap基因并且不能产生后代。在某些实施例中，仅aav序列是aav反向末端重复序列(itr)，通常定位在载体基因组的5'和3'最末端处，以允许定位在itr之间的基因和调控序列包装在aav衣壳内。
[0062]
如本文所使用的，“载体基因组”是指包装在形成病毒颗粒的raav衣壳内部的核酸序列。此类核酸序列含有aav反向末端重复序列(itr)。在本文的实例中，载体基因组至少含有从5'到3'的aav 5'itr、编码序列和aav 3'itr。可以选择来自aav2的itr、不同于衣壳来源或除全长itr之外的aav。在某些实施例中，itr来自与在产生或反式补充aav期间提供rep功能的aav来源相同的aav。进一步地，可以使用其它itr。进一步地，载体基因组含有引导基因产物表达的调控序列。在本文中更详细地讨论载体基因组的合适组分。
[0063]
aavhu68
[0064]
如以下实例所描述的，本文所提供的raav包括aavhu68衣壳。参见例如wo 2018/160582，其通过引用并入本文中。aavhu68在进化枝f内。aavhu68(seq id no:2)由于位于vp1的位置67和157处的两个经编码的氨基酸而不同于另一进化枝f病毒aav9(seq id no:4)。相比之下，其它进化枝f aav(aav9，hu31，hu31)具有在位置67处的ala以及在位置157处的ala。
[0065]
raavhu68由aavhu68衣壳和载体基因组构成。在一个实施例中，包括raavhu68的组合物包括vp1的异质群体、vp2的异质群体和vp3蛋白的异质群体的组装。如本文所使用的，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异质”或其任何语法变型是指由不相同的元件组成的群体，例如具有带有不同的经修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白质)。seq id no:2提供了aavhu68 vp1蛋白的经编码的氨基酸序列。aavhu68衣壳含有具有来自seq id no:2中的预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含某些脱酰胺化的天冬酰胺(n或asn)残基。例如，某些亚群体包括seq id no:2中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺化的天冬酰胺(n)位置并且任选地进一步包括其它脱酰胺化的氨基酸，其中脱酰胺作用引起氨基酸变化和其它任选的修饰。在本文中描述了这些和其它修饰的各种组合。
[0066]
如本文所使用的，除非另有说明，否则vp蛋白的“亚群体”是指一组vp蛋白，所述一组vp蛋白具有至少一个限定的共同特性，并且由至少一个组成员到少于参考组的所有成员组成。
[0067]
例如，除非另有说明，否则vp1蛋白的“亚群体”是至少一种(1)vp1蛋白，并且少于组装的aav衣壳中的所有vp1蛋白。除非另有说明，否则vp3蛋白的“亚群体”可以是少于组装的aav衣壳中的所有vp3蛋白的一种(1)vp3蛋白。例如，vp1蛋白可以是vp蛋白的亚群体；vp2
蛋白可以是vp蛋白的单独的亚群体，并且vp3是组装的aav衣壳中的vp蛋白的又另外的亚群体。在另一个实例中，vp1、vp2和vp3蛋白可以含有具有不同修饰的亚群体，例如，至少一种、两种、三种或四种高度脱酰胺化的天冬酰胺，例如在天冬酰胺-甘氨酸对处。
[0068]
除非另有说明，否则与在参考氨基酸位置处的预测的氨基酸序列相比，高度脱酰胺化是指在参考的氨基酸位置处被至少45％脱酰胺化、至少50％脱酰胺化、至少60％脱酰胺化、至少65％脱酰胺化、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、97％、99％、最高约100％脱酰胺化(例如，seq id no:2的氨基酸57处的天冬酰胺的至少80％基于总vp1蛋白脱酰胺化或seq id no:2的氨基酸409处的天冬酰胺的20％基于总vp1、vp2和vp3蛋白脱酰胺化)。此类百分比可以使用2d凝胶、质谱技术或其它合适的技术来确定。
[0069]
如本文所提供的，seq id no:2的每个脱酰胺化的n可以独立地为天冬氨酸(asp)、异天冬氨酸(isoasp)、天冬氨酸盐和/或asp和isoasp的相互转化的共混物或其组合。可以存在任何合适比率的α-和异天冬氨酸。例如，在某些实施例中，比率可以为10:1到1:10天冬氨酸:异天冬氨酸、约50:50天冬氨酸:异天冬氨酸、或约1:3天冬氨酸:异天冬氨酸或另一所选比率。在某些实施例中，seq id no:2中的一种或多种谷氨酰胺(q)脱酰胺化为谷氨酸(glu)，即α-谷氨酸、γ-谷氨酸(glu)或α-和γ-谷氨酸的共混物，其可以通过常见的戊二酰亚胺(glutarinimide)中间体相互转化。可以存在任何合适比率的α-和γ-谷氨酸。例如，在某些实施例中，比率可以为10:1到1:10α:γ、约50:50α:γ或约1:3α:γ或另一所选比率。
[0070]
因此，raavhu68包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的raavhu68内具有脱酰胺化的氨基酸的亚群体，至少包含至少一个包括至少一种高度脱酰胺化的天冬酰胺的亚群体。另外，其它修饰可以包含异构化，特别是在所选天冬氨酸(d或asp)残基位置处。在仍其它实施例中，修饰可以包含在asp位置处的酰胺化。
[0071]
在某些实施例中，aavhu68衣壳含有具有至少4个到至少约25个脱酰胺化的氨基酸残基位置的vp1、vp2和vp3的亚群体，与seq id no:2的经编码的氨基酸序列相比，所述氨基酸残基位置中的至少1到10％被脱酰胺化。这些中的大多数可以是n残基。然而，q残基也可以被脱酰胺化。
[0072]
在某些实施例中，aavhu68衣壳的另外的特征在于以下中的一种或多种。aavhu68衣壳蛋白，所述aavhu68衣壳蛋白包括：aavhu68 vp1蛋白，所述aavhu68 vp1蛋白通过从对seq id no:2的1到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列表达、由seq id no:1产生的vp1蛋白、或由与seq id no:1至少70％相同的对seq id no:2的1到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列产生的vp1蛋白产生；aavhu68 vp2蛋白，所述aavhu68 vp2蛋白通过从对seq id no:2的至少约氨基酸138到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列的表达、由包括seq id no:1的至少核苷酸412到2211的序列产生的vp2蛋白、或由与seq id no:1的至少核苷酸412到2211至少70％相同的对seq id no:2的至少约氨基酸138到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列产生的vp2蛋白产生；和/或aavhu68 vp3蛋白，所述aavhu68 vp3蛋白通过从对seq id no:2的至少约氨基酸203到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列表达、由包括seq id no:1的至少核苷酸607到2211的序列产生的vp3蛋白、或由与seq id no:1的至少核苷酸607到2211至少70％相同的对seq id no:2的至少约氨基酸203到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列产生的vp3蛋白产生。
[0073]
另外地或可替代地，提供了一种aav衣壳，所述aav衣壳包括任选地包括位置157处的缬氨酸的vp1蛋白的异质群体、任选地包括位置157处的缬氨酸的vp2蛋白的异质群体以及vp3蛋白的异质群体，其中基于seq id no:2的vp1衣壳的编号，vp1和vp2蛋白的至少一个亚群体包括位置157处的缬氨酸并且任选地进一步包括位置67处的谷氨酸。任选地或可替代地，提供了一种aavhu68衣壳，所述aavhu68衣壳包括为对seq id no:2的氨基酸序列进行编码的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群体、为对seq id no:2的至少约氨基酸138到736的氨基酸序列进行编码的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群体、以及为对seq id no:2的至少氨基酸203到736进行编码的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群体，其中：所述vp1、vp2和vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群体。
[0074]
aavhu68 vp1、vp2和vp3蛋白通常表示为由对seq id no:2的全长vp1氨基酸序列(氨基酸1到736)进行编码的相同核酸序列编码的替代剪接变体。任选地，单独使用vp1编码序列来表达vp1、vp2和vp3蛋白。可替代地，此序列可以与以下中的一个或多个共表达：对seq id no:2的aavhu68 vp3氨基酸序列(约aa 203到736)进行编码的核酸序列，所述aavhu68 vp3氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约aa 137)和/或vp2独特区(约aa 1到约aa 202)或与其互补的链，即对应的mrna或trna(seq id no:1的约nt 607到约nt 2211)；或与seq id no:1至少70％到至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的对seq id no:2的aa 203到736进行编码的序列。任选地或可替代地，vp1编码和/或vp2编码序列可以与以下中的一个或多个共表达：对seq id no:2(约aa 138到736)的aavhu68 vp2氨基酸序列进行编码的核酸序列，所述aavhu68 vp2氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约aa 137)或与其互补的链，即对应的mrna或trna(例如，seq id no:1的约nt 412到22121)；或与seq id no:1至少70％到至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的对seq id no:2的约aa 138到736进行编码的序列。
[0075]
如本文所描述的，raavhu68具有在从对seq id no:2的vp1氨基酸序列进行编码的aavhu68核酸中表达衣壳的产生系统中产生的raavhu68衣壳，以及任选地例如对不含vp1和/或vp2独特区的vp3蛋白进行编码的另外的核酸序列。使用单个核酸序列vp1从生产中产生的raavhu68产生vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白的异质群体。更具体地，raavhu68衣壳含有具有来自seq id no:2中的预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含脱酰胺化的天冬酰胺(n或asn)残基。例如，天冬酰胺-甘氨酸对中的天冬酰胺是高度脱酰胺化的。
[0076]
在一个实施例中，aavhu68 vp1核酸序列具有seq id no:1的序列或与其互补的链，例如对应的mrna或trna。在某些实施例中，vp2和/或vp3蛋白可以另外地或可替代地由不同于vp1的核酸序列表达，例如以改变所选表达系统中的vp蛋白的比率。在某些实施例中，还提供了对seq id no:2(约aa 203到736)的aavhu68 vp3氨基酸序列进行编码的核酸序列，所述aavhu68 vp3氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约aa 137)和/或vp2独特区(约aa 1到约aa 202)或与其互补的链，即对应的mrna或trna(seq id no:1的约nt 607到约nt 2211)。在某些实施例中，还提供了对seq id no:2(约aa 138到736)的aavhu68 vp2氨基酸序列进行编码的核酸序列，所述aavhu68 vp2氨基酸序没有vp1独特区(约aa 1到约137)或与其互补的链，即对应的mrna或trna(seq id no:1的约nt 412到2211)。
[0077]
然而，可以选择对seq id no:2的氨基酸序列进行编码的其它核酸序列用于产生raavhu68衣壳。在某些实施例中，核酸序列具有seq id no:1的核酸序列或与对seq id no:2进行编码的seq id no:1至少70％到99％相同、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％相同的序列。在某些实施例中，核酸序列具有seq id no:1的核酸序列或与对seq id no:2的vp2衣壳蛋白(约aa 138到736)进行编码的seq id no:1的约nt 412到约nt 2211至少70％到99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％相同的序列。在某些实施例中，核酸序列具有seq id no:1的约nt 607到约nt 2211的核酸序列或与对seq id no:2的vp3衣壳蛋白(约aa 203到736)进行编码的seq id no:1的约nt 607到约nt 2211至少70％到99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％相同的序列。
[0078]
设计对此raavhu68衣壳进行编码的核酸序列在本领域的技术范围内，包含dna(基因组或cdna)或rna(例如，mrna)。在某些实施例中，seq id no:1中提供了对aavhu68 vp1衣壳蛋白进行编码的核酸序列。在其它实施例中，可以选择与seq id no:1具有70％到99.9％同一性的核酸序列以表达aavhu68衣壳蛋白。在某些其它实施例中，核酸序列与seq id no:1至少约75相同、至少80％相同、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％相同或至少99％到99.9％相同。可以通过各种方法设计可以被密码子优化以在所选系统(即，细胞类型)中进行表达的此类核酸序列。可以使用在线可用的方法(例如，geneart)、公开的方法或提供密码子优化服务的公司(例如，dna2.0)(加利福尼亚州门洛帕克市)来执行此优化。例如，在美国国际专利公开第wo 2015/012924号中描述了一种密码子优化方法，其通过引用整体并入本文中。还参见例如美国专利公开第2014/0032186号和美国专利公开第2006/0136184号。适合地，修饰产物的开放阅读框(orf)的全长。然而，在一些实施例中，仅orf的片段可以被改变。通过使用这些方法中的一种方法，可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并产生对多肽进行编码的经密码子优化的编码区的核酸片段。许多选项可用于对密码子进行实际改变或者可用于合成如在此所述地设计的密码子优化的编码区。此类改变或合成可以使用本领域普通技术人员已熟知的标准和常规分子生物学操作来进行。在一种方法中，通过标准方法合成各自长度为80-90个核苷酸且跨越希望的序列的长度的一系列互补寡核苷酸对。这些寡核苷酸对被合成为使得在退火时它们形成80-90个碱基对的双链片段，这些双链片段含有黏性末端，例如在该对中的各寡核苷酸被合成来延伸超过与该对中另一寡核苷酸互补的区域3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个碱基。每对寡核苷酸的单链末端被设计为用另一对寡核苷酸的单链末端退火。允许这些寡核苷酸对退火，并且然后允许约五至六个这些双链片段经由粘性单链末端一起退火，并且随后它们连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如可获自加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(invitrogen corporation,carlsbad,calif)的载体。然后通过标准方法对构建体进行测序。制备由连接在一起的80到90个碱基对片段的5到6个片段(即约500个碱基对的片段)组成的这些构建体中的若干构建体，以使得整个希望的序列以一系列质粒构建体表示。然后用适当的限制性酶切割这些质粒的插入物并且将其连接在一起以形成最终构建体。然后将最终构建体克隆到标准细菌克隆载体中，并进行测序。另外的方法对于技术人员而言将立即是清楚的。另外，基因合成易于商购获得。
[0079]
在某些实施例中，raavhu68 vp1、vp2和vp3蛋白中的n-g对中的天冬酰胺(n)是高
度脱酰胺化的。在raavhu68衣壳蛋白的情况下，4个残基(n57、n329、n452、n512)跨不同批次常规地显示出脱酰胺化水平》70％，并且在大多数情况下脱酰胺化水平》90％。另外的天冬酰胺残基(n94、n253、n270、n304、n409、n477和q599)跨不同批次也显示出至多约20％的脱酰胺化水平。最初使用胰蛋白酶消化物鉴定脱酰胺化水平，并用胰凝乳蛋白酶消化对其进行验证。
[0080]
在某些实施例中，raavhu68衣壳含有具有高度酰胺化的raavhu68衣壳蛋白的至少四个天冬酰胺(n)位置的aav vp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白的亚群体。在某些实施例中，n-n对(不包括n-n-n三联体)的约20到50％示出了脱酰胺化。在某些实施例中，第一n是脱酰胺化的。在某些实施例中，第二n是脱酰胺化的。在某些实施例中，脱酰胺化为约15％到约25％脱酰胺化。在seq id no:2的位置259处的q处脱酰胺化是aavhu68蛋白的约8％到约42％的aavhu68 vp1、vp2和vp3衣壳蛋白。
[0081]
在某些实施例中，raavhu68衣壳的特征进一步在于vp1、vp2和vp3蛋白的d297的酰胺化。在某些实施例中，基于seq id no:2的编号，aavhu68衣壳中的vp1、vp2和/或vp3蛋白的位置297处的d的约70％到约75％被酰胺化。在某些实施例中，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个asp被异构化为d-asp。基于seq id no:2的编号，此类异构体通常以小于约1％的asp的量存在于残基位置97、107和384中的一个或多个残基位置处。
[0082]
在某些实施例中，raavhu68具有带有vp1、vp2和vp3蛋白的aavhu68衣壳，所述蛋白具有包括下表中列出的位置处的一个、两个、三个、四个或更多个脱酰胺化的残基的组合的亚群体。raav中的脱酰胺化可以使用2d凝胶电泳和/或质谱和/或蛋白质建模技术来确定。在线色谱可以使用acclaim pepmap柱和与q exactive hf和nanoflex源(赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific))耦合的thermo ultimate 3000 rslc系统(赛默飞世尔科技公司)执行。ms数据是使用用于q exactive hf的数据依赖性前20种方法获取的，所述方法从调查扫描(200-2000m/z)中动态选择最丰富的尚未测序的前体离子。测序通过高能碰撞解离片段进行，其中通过预测性自动增益控制确定的靶值为1e5离子，并且以4m/z的窗口进行前体分离。以m/z 200以120,000的分辨率获取调查扫描。hcd光谱的分辨率可以在m/z 200下设置为30,000，其中最大离子注入时间为50毫秒，并且归一化碰撞能量为30。s-透镜rf水平可以设置为50，以使消化肽所占据的m/z区达到最佳传输。可以从片段选择中排除具有单个、未分配或六个和更高电荷状态的前体离子。biopharma finder 1.0软件(赛默飞世尔科技公司)可以用于分析所获取的数据。对于肽作图，使用单进入蛋白fasta数据库进行搜索，其中脲基甲基化设置为固定的修饰；并将氧化、脱酰胺化和磷酸化设置为可变修饰、10ppm质量准确度、高蛋白酶特异性和置信水平为0.8的ms/ms光谱。合适的蛋白酶的实例可以包含例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。脱酰胺化的肽的质谱鉴定相对简单，因为脱酰胺化向完整分子的质量添加了+0.984da(-oh基团与-nh2基团之间的质量差)。特定肽的脱酰胺化百分比通过将脱酰胺化的肽的质量面积除以脱酰胺化的和天然的肽的面积之和来确定。考虑到可能的脱酰胺化位点的数量，在不同位点处被脱酰胺化的同量异位物种可以在单个峰中共迁移。因此，源自具有多个潜在的脱酰胺化位点的肽的片段离子可以用于定位或区分多个脱酰胺化位点。在这些情况下，观察到的同位素图案内的相对强度可以用于特异性确定不同的脱酰胺化的肽异构体的相对丰度。此方法假设所有异构物种的片段化效率是相同的，并且在脱酰胺化位点上是独立的。本领域的技术人员将理解的是，可以使用这
些说明性方法的多种变型。例如，合适的质谱仪可以包含例如四极杆飞行时间质谱仪(qtof)，如waters xevo或agilent 6530，或orbitrap仪器，如orbitrap fusion或orbitrap velos(赛默飞世尔科技公司)。合适的液相色谱系统包含例如来自沃特世(waters)的acquity uplc系统或agilent系统(1100或1200系列)。合适的数据分析软件可以包含例如masslynx(沃特世)、pinpoint和petfinder(赛默飞世尔科技公司)、mascot(矩阵科学公司(matrix science))、peaks db(生物信息学解决方案公司(bioinformatics solutions))。可以在例如x.jin等人,于2017年6月16日在线公开的《人类基因疗法方法》,第28卷,第5期,第255-267页中描述仍其它技术。
[0083]
no:2的aavhu68 vp3氨基酸序列进行编码的核酸序列(约aa 203到736)，所述aavhu68 vp3氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约aa 137)和/或vp2独特区(约aa 1到约aa 202)或与其互补的链，即对应的mrna或trna(seq id no:1的约nt 607到约nt 2211)；或与seq id no:1至少70％到至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的对seq id no:2的aa 203到736进行编码的序列。任选地或可替代地，vp1编码和/或vp2编码序列可以与以下中的一个或多个共表达：对seq id no:2(约aa 138到736)的aavhu68 vp2氨基酸序列进行编码的核酸序列，所述aavhu68 vp2氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约aa 137)或与其互补的链，即对应的mrna或trna(seq id no:1的nt 412到2211)；或与seq id no:1至少70％到至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的对seq id no:2的aa 138到736进行编码的序列。
[0089]
另外地或可替代地，raavhu68衣壳包括vp1、vp2和/或vp3蛋白的至少一个亚群体，基于seq id no:2的编号，所述蛋白在以下位置中的一个或多个位置处被脱酰胺化：n57、n66、n94、n113、n252、n253、q259、n270、n303、n304、n305、n319、n328、n329、n336、n409、n410、n452、n477、n512、n515、n598、q599、n628、n651、n663、n709或其组合；(e)raavhu68衣壳包括vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群体，基于seq id no:2的编号，所述蛋白包括在以下位置中的一个或多个位置处的1％到约20％脱酰胺化：n66、n94、n113、n252、n253、q259、n270、n303、n304、n305、n319、n328、n336、n409、n410、n477、n515、n598、q599、n628、n651、n663、n709或其组合；(f)raavhu68衣壳包括vp1的亚群体，其中基于seq id no:2的编号，vp1蛋白的位置57处的n的65％到100％被脱酰胺化；(g)raavhu68衣壳包括vp1蛋白的亚群体，其中vp1蛋白的位置57处的n的75％到100％被脱酰胺化；(h)raavhu68衣壳包括vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群体，其中基于seq id no:2的编号，位置329处的n的80％到100％被脱酰胺化；(i)raavhu68衣壳包括vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群体，其中基于seq id no:2的编号，位置452处的n的80％到100％被脱酰胺化；(j)raavhu68衣壳包括vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群体，其中基于seq id no:2的编号，位置512处的n的80％到100％被脱酰胺化；(k)raav包括总共约60个衣壳蛋白，其比率为约1个vp1:约1到1.5个vp2:3到10个vp3蛋白；(l)raav包括总共约60个衣壳蛋白，其比率为约1个vp1:约1个vp2:3到9个vp3蛋白。
[0090]
在某些实施例中，aavhu68被修饰成改变天冬酰胺-甘氨酸对中的甘氨酸，以降低脱酰胺化。在其它实施例中，将天冬酰胺改变为不同的氨基酸，例如以较慢速率进行脱酰胺化的谷氨酰胺；或改变为缺乏酰胺基的氨基酸(例如，含有酰胺基的谷氨酰胺和天冬酰胺)；和/或改变为缺乏酰胺基的氨基酸(例如，含有酰胺基的赖氨酸、精氨酸和组氨酸)。如本文所使用的，缺乏酰胺或胺侧基的氨基酸是指例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸和/或脯氨酸。如所描述的修饰可以在经编码的aavhu68氨基酸序列中存在的天冬酰胺-甘氨酸对中的一个、两个或三个天冬酰胺-甘氨酸对中。在某些实施例中，在所有四个天冬酰胺-甘氨酸对中没有进行此类修饰。因此，提供了一种用于降低具有较低脱酰胺化速率的raavhu68和/或工程化的raavhu68变体的脱酰胺化的方法。另外地，可以将一种或多种其它酰胺氨基酸改变为非酰胺氨基酸以降低raavhu68的脱酰胺化。
[0091]
这些氨基酸修饰可以通过常规的基因工程技术进行。例如，可以产生含有经修饰
的aavhu68 vp密码子的核酸序列，其中修饰对seq id no:2(天冬酰胺-甘氨酸对)中的位置58、330、453和/或513处的甘氨酸进行编码的密码子中的一到三个密码子，以对除甘氨酸之外的氨基酸进行编码。在某些实施例中，含有经修饰的天冬酰胺密码子的核酸序列可以在定位在seq id no:2中的位置57、329、452和/或512处的天冬酰胺-谷氨酸对中的一个到三个处工程化，使得经修饰的密码子对除天冬酰胺之外的氨基酸进行编码。每个经修饰的密码子可以对不同的氨基酸进行编码。可替代地，改变的密码子中的一个或多个密码子可以对相同的氨基酸进行编码。在某些实施例中，这些经修饰的aavhu68核酸序列可以用于产生具有比天然hu68衣壳脱酰胺化程度更低的衣壳的突变raavhu68。此类突变raavhu68可以具有降低的免疫原性和/或增加储存时的稳定性，特别是以悬浮液形式储存时的稳定性。如本文所使用的，“密码子”是指对氨基酸进行编码的序列中的三个核苷酸。
[0092]
如本文所使用的，“经编码的氨基酸序列”是指基于被翻译成氨基酸的参考的核酸序列的已知dna密码子的翻译而预测的氨基酸。下表展示了dna密码子和二十种常见氨基酸，分别示出了单字母代码(slc)和三个字母代码(3lc)。
[0093]
氨基酸slc3lcdna密码子异亮氨酸iileatt、atc、ata亮氨酸lleuctt、ctc、cta、ctg、tta、ttg缬氨酸vvalgtt、gtc、gta、gtg苯丙氨酸fphettt、ttc甲硫氨酸mmetatg半胱氨酸ccystgt、tgc丙氨酸aalagct、gcc、gca、gcg甘氨酸gglyggt、ggc、gga、ggg脯氨酸pprocct、ccc、cca、ccg苏氨酸tthract、acc、aca、acg丝氨酸ssertct、tcc、tca、tcg、agt、agc酪氨酸ytyrtat、tac色氨酸wtrptgg谷氨酰胺qglncaa、cag天冬酰胺nasnaat、aac组氨酸hhiscat、cac谷氨酸eglugaa、gag天冬氨酸daspgat、gac赖氨酸klysaaa、aag精氨酸rargcgt、cgc、cga、cgg、aga、agg终止密码子终止 taa、tag、tga
[0094]
在某些实施例中，可以使用raavhu68衣壳。例如，此类衣壳可以用于产生单克隆抗体和/或产生可用于监测基因疗法患者的aavhu68浓度水平的测定中的试剂。用于产生有用的抗aavhu68抗体、标记此类抗体或空衣壳的技术以及合适的测定格式是本领域技术人员已知的。
[0095]
在某些实施例中，本文中提供了seq id no:1的核酸序列或通过如本文所描述的修饰(例如，脱酰胺化的氨基酸)对seq id no:2的vp1氨基酸序列进行编码的与其至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列。在某些实施例中，vp1氨基酸序列在seq id no:2中再现。
[0096]
如本文所使用的，与aav的组有关的术语“进化枝”是指如基于对aav vp1氨基酸序列进行的比对，通过(至少1000个复制品的)至少75％的自举值(bootstrap value)和不大于0.05的泊松校正距离测量结果(poisson correction distance measurement)使用邻接算法(neighbor-joining algorithm)确定的一组在系统发育上彼此相t关的aav。在文献中已经描述了邻接算法。参见例如m.nei和s.kumar,《分子进化和系统发育学(molecular evolution and phylogenetics)》(牛津大学出版社(oxford university press),纽约(2000))。提供了可以用于实施此算法的可用计算机程序。例如，mega v2.1程序实施了经修改的nei-gojobori方法。使用这些技术和计算机程序以及aav vp1衣壳蛋白的序列，本领域技术人员可以容易地确定所选aav是含在本文所鉴定的进化枝之一中，还是在这些进化枝之外的另一个进化枝中。参见例如g gao等人,《病毒学杂志(jvirol)》,2004年6月；78(10:6381-6388，所述文献鉴定进化枝a、b、c、d、e和f，genbank登录号ay530553到ay530629。还参见wo 2005/033321。
[0097]
如本文所使用的，“aav9衣壳”是由多种aav9 vp蛋白构成的自组装aav衣壳。aav9 vp蛋白通常被表达为替代性剪接变体，所述剪接变体由对seq id no:4(genbank登录：aas99264)的vp1氨基酸序列进行编码的seq id no:3的核酸序列编码。这些剪接变体产生不同长度的seq id no:4的蛋白质。在某些实施例中，“aav9衣壳”包含具有与aas99264 99％相同或与seq id no:4 99％相同的氨基酸序列的aav。还参见us7906111和wo 2005/033321。如本文所使用的，“aav9变体”包含在例如wo 2016/049230、us 8,927,514、us 2015/0344911和us 8,734,809中描述的变体。
[0098]
因此已经描述了产生衣壳的方法、编码序列以及用于产生raav病毒载体的方法。参见例如gao等人,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》,100(10),6081-6086(2003)和us 2013/0045186a1。
[0099]
当提及核酸或其片段时，术语“基本同源性”或“基本类似性”表示当与另一个核酸(或其互补链)的适当核苷酸插入或缺失进行最佳比对时，至少约95到99％的比对序列具有核苷酸序列同一性。优选地，同源性在全长序列、或其开放阅读框或长度为至少15个核苷酸的另一个合适的片段上。本文描述了合适片段的实例。
[0100]
在核酸序列的上下文中，术语“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“相同百分比”是指两个序列中的残基在比对以获得最大对应性时是相同的。期望序列同一性比较的长度可以超过基因组的全长、基因编码序列的全长或至少约500到5000个核苷酸的片段。然而，也可能期望较小片段之间的同一性，例如至少约九个核苷酸，通常至少约20到24个核苷酸、至少约28到32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸。类似地，对于氨基酸序列，在蛋白质的全长或其片段上，可以容易地确定“序列同一性百分比”。合适地，片段长度为至少约8个氨基酸，并且可以高达约700个氨基酸。本文描述了合适片段的实例。
[0101]
当提及氨基酸或其片段时，术语“基本同源性”或“基本类似性”表示当与另一个氨基酸(或其互补链)的适当核苷酸插入或缺失进行最佳比对时，至少约95到99％的比对序列
具有氨基酸序列同一性。优选地，同源性在全长序列、或其蛋白质(例如，cap蛋白、rep蛋白、或其长度为至少8个氨基酸、或更期望地至少15个氨基酸的片段)上。本文描述了合适片段的实例。
[0102]
术语“高度保守的”意指至少80％同一性、优选地至少90％同一性，并且更优选地超过97％同一性。通过使用本领域技术人员已知的算法和计算机程序，本领域技术人员可以容易地确定同一性。
[0103]
通常，当提及两种不同的腺相关病毒之间的“同一性”、“同源性”或“类似性”时，参考“比对”序列来确定“同一性”、“同源性”或“类似性”。“比对”序列或“比对”是指与参考序列相比，通常含有对丢失的或另外的碱基或氨基酸的校正的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列。在实例中，使用公开的aav9序列作为参考点执行aav比对。使用多种公开或可商购获得的多序列比对程序中的任一种进行比对。此类程序的实例包含“clustalω”、“clustal w”、“cap序列组装”、“map”和“meme”，这些程序可通过因特网上的web服务器进行访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。可替代地，也使用了载体nti实用程序。本领域已知的许多算法可以用于测量核苷酸序列同一性，包含上述程序中包含的那些。作为另一个实例，可以使用gcg 6.1版本的程序fasta
tm
比较多核苷酸序列。fasta
tm
提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可以是使用如gcg 6.1版本中所提供的采用其默认参数(字号6和评分矩阵的nopam系数)的fasta
tm
所确定的，所述程序通过引用并入本文中。多个序列比对程序也可用于氨基酸序列，这些程序例如“clustalω”、“clustal x”、“map”、“pima”、“msa”、“blockmaker”、“meme”和“match-box”程序。通常，以默认设置使用这些程序中的任何程序，尽管本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。可替代地，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，所述算法或程序提供至少与通过参考算法和程序所提供的一样水平的同一性或比对。参见例如j.d.thomson等人,《核酸研究(nucl.acid.res.)》,“多个序列比对的全面比较(a comprehensive comparison of multiple sequence alignments)”,27(13):2682-2690(1999)。
[0104]
raav载体
[0105]
如上文所指示的，aavhu68序列和蛋白可用于产生raav，并且还可用于重组aav载体，所述重组aav载体可以是反义递送载体、基因疗法载体或疫苗载体。另外地，本文所描述的工程化的aav衣壳(例如，在位置67、157或两者处相对于seq id no:2中的vp1衣壳蛋白的编号具有突变氨基酸的那些aav衣壳)可以用于工程化raav载体以向靶细胞和组织递送合适的核酸分子。
[0106]
包装到aav衣壳中并递送到宿主细胞的基因组序列通常至少由转基因及其调控序列和aav反向末端重复序列(itr)构成。单链aav和自身互补(sc)aav两者都涵盖在raav内。转基因是与载体序列异源的核酸编码序列，所述核酸编码序列对多肽、蛋白质、功能性rna分子(例如，mirna、mirna抑制剂)或其它所关注的基因产物进行编码。
[0107]
具体地，本公开提供了包括人半乳糖神经酰胺酶(galc)的编码序列的raav。在一些实施例中，所述编码序列是工程化的galc编码序列。在一些实施例中，所述编码序列是seq id no:9的cgalc基因(cgalcco)的序列。
[0108]
核酸编码序列以允许转基因在靶组织的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与调
控组分可操作地连接。在一些实施例中，所述调控序列包括β肌动蛋白启动子、内含子和兔珠蛋白polya。在一些实施例中，所述调控序列包括seq id no:13。在一些实施例中，所述调控序列包括seq id no:15。在一些实施例中，所述调控序列包括seq id no:16。
[0109]
载体的aav序列通常包括顺式作用的5'和3'反向末端重复序列(参见例如b.j.carter,《细小病毒手册(handbook of parvoviruses)》,p.tijsser编辑,crc出版社,第155到168页(1990))。itr序列的长度为约145bp。优选地，分子中使用了对itr进行编码的基本上整个序列，尽管允许对这些序列进行一定程度的微小修饰。修饰这些itr序列的能力在本领域的技术范围内。(参见例如文本，如sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(molecular cloning：a laboratory manual)》,第2版,冷泉港实验室,纽约(1989)；以及k.fisher等人,《病毒学杂志(j.virol.)》,70:520 532(1996))。在本发明中采用的这种分子的实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选转基因序列和相关的调控元件侧接有5'和3'aav itr序列。在一个实施例中，itr来自与供应衣壳的aav不同的aav。在一个实施例中，itr来自aav2。已经描述了被称为δitr的5'itr的缩短版本，其中缺失了d序列和末端解析位点(trs)。在其它实施例中，使用了全长aav 5'和3'itr。然而，可以选择来自其它aav来源的itr。在itr的来源来自aav2并且aav衣壳来自另一个aav来源的情况下，所得载体可以被称为假型的。然而，这些元件的其它构型可以是合适的。
[0110]
除重组aav载体的上文鉴定的主要元件外，aav载体还包含必需的常规控制元件，所述常规控制元件以允许其在用质粒载体转染或用由本发明产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因可操作地连接。如本文所使用的，“可操作地连接的”序列包含与所关注的基因邻接的表达控制序列和以反式或在远处起作用以控制所关注的基因的表达控制序列。
[0111]
调控控制元件通常含有作为表达控制序列的一部分的启动子序列，例如定位在所选5'itr序列与编码序列之间。可以在本文所描述的载体中使用组成型启动子、可调控启动子[参见例如wo 2011/126808和wo 2013/04943]、组织特异性启动子或对生理学线索有应答的启动子。启动子可以选自不同的来源，例如人巨细胞病毒(cmv)立即早期增强子/启动子、sv40早期增强子/启动子、jc多瘤病毒启动子、髓鞘碱性蛋白(mbp)或神经胶质原纤维酸性蛋白(gfap)启动子、单纯疱疹病毒(hsv-1)潜伏期相关启动子(lap)、劳氏肉瘤病毒(rsv)长末端重复(ltr)启动子、神经元特异性启动子(nse)、血小板源性生长因子(pdgf)启动子、hsyn、黑色素浓缩激素(mch)启动子、cba、基质金属蛋白启动子(mpp)和鸡β肌动蛋白启动子。除了启动子之外，载体还可以含有一个或多个其它合适的转录起始、终止、增强子序列、有效的rna加工信号，如剪接和聚腺苷酸化(polya)信号；稳定胞质mrna的序列，例如wpre；增强翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时，增强所编码产物的分泌的序列。合适的增强子的实例是cmv增强子。其它合适的增强子包含适合于所期望的靶组织适应症的增强子。在一个实施例中，表达盒包括一种或多种表达增强子。在一个实施例中，表达盒含有两种或更多种表达增强子。这些增强子可以相同或彼此不同。例如，增强子可以包含cmv立即早期增强子。这种增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。可替代地，增强子的双拷贝可以被一个或多个序列分开。在仍另一个实施例中，表达盒进一步含有内含子，例如，鸡β肌动蛋白内含子。其它合适的内含子包含本领域已知的内含子，例如，如wo 2011/126808中描述的内含子。合适的polya序列的实例包含例如sv40、
sv50、牛生长激素(bgh)、人生长激素和合成polya。任选地，可以选择一个或多个序列来稳定mrna。此类序列的实例是经修饰的wpre序列，其可以在polya序列的上游和编码序列的下游被工程化[参见例如ma zanta-boussif等人,《基因疗法(gene therapy)》(2009)16:605-619]。
[0112]
这些raav特别适合于用于治疗目的和用于免疫的基因递送，包含诱导保护性免疫。进一步地，本发明的组合物还可以用于体外产生所期望的基因产物。对于体外产生，可以在用含有对所期望的产物进行编码的分子的raav转染宿主细胞并在允许表达的条件下培养细胞培养物之后从所期望的培养物中获得所期望的产物(例如，蛋白质)。然后可以根据需要纯化和分离所表达的产物。用于转染、细胞培养、纯化和分离的合适的技术是本领域的技术人员已知的。
[0113]
raav载体产生
[0114]
供产生aav病毒载体(例如，重组(r)aav)之用，表达盒可以携带在递送到包装宿主细胞的任何合适的载体(例如，质粒)上。可在本发明使用的质粒可以被工程化，使得其适合于在原核细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及其它细胞中进行体外复制和包装。合适的转染技术和包装宿主细胞是已知的和/或可以由本领域的技术人员容易地设计。
[0115]
用于产生和分离适合于用作载体的aav的方法是本领域已知的。通常参见例如grieger和samulski,2005,腺相关病毒作为基因疗法载体：载体开发、产生和临床应用(adeno-associated virus as a gene therapy vector:vector development,production and clinical applications),《生物化学工程/生物技术进展(adv.biochem.engin/biotechnol)》99:119-145；buning等人,2008,“腺相关病毒载体技术的最新开发(recent developments in adeno-associated virus vector technology),”《基因医学杂志(j.gene med)》,10:717-733；以及下文引用的参考文献，这些参考文献中的每个参考文献通过引用整体并入本文中。为了将基因包装到病毒粒子中，itr是在与含有表达盒的核酸分子相同的构建体中需要的顺式的唯一aav组分。cap和rep基因可以反式供应。
[0116]
在一个实施例中，本文所描述的表达盒被工程化到基因元件(例如，穿梭质粒)，所述基因元件将其上携带的免疫球蛋白构建体序列转移到包装宿主细胞中以产生病毒载体。在一个实施例中，所选基因元件可以通过任何合适的方法递送到aav包装细胞，所述方法包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速dna包被的粒料、病毒感染和原生质体融合。也可以制备稳定的aav包装细胞。可替代地，表达盒可以用于产生除aav之外的病毒载体，或用于在体外产生抗体的混合物。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如《分子克隆：实验室手册》,由green和sambrook编辑,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(2012)。
[0117]
术语“aav中间体”或“aav载体中间体”是指缺少包装在其中的所期望的基因组序列的组装的raav衣壳。这些也可以被称为“空”衣壳。此类衣壳可以不含有表达盒的可检测基因组序列，或者含有不足以实现基因产物的表达的仅部分包装的基因组序列。这些空衣壳是无功能的以将所关注的基因转移到宿主细胞。
[0118]
可以使用已知的技术产生本文所描述的重组腺相关病毒(aav)。参见例如wo 2003/042397；wo 2005/033321、wo 2006/110689；us 7588772 b2。此类方法涉及培养含有对aav衣壳蛋白进行编码的核酸序列的宿主细胞；功能性rep基因；至少由aav反向末端重复
序列(itr)和转基因构成的表达盒；以及足够的辅助功能以允许将表达盒包装到aav衣壳蛋白中。已经描述了产生衣壳的方法、其编码序列以及产生raav病毒载体的方法。参见例如gao等人,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》,100(10),6081-6086(2003)和us 2013/0045186a1。
[0119]
在一个实施例中，提供了一种可用于产生重组raavhu68的产生细胞培养物。此类细胞培养物含有在宿主细胞中表达raavhu68衣壳蛋白的核酸；适合于包装到raavhu68衣壳中的核酸分子，例如含有aav itr和对基因产物进行编码的非aav核酸序列的载体基因组，所述基因产物可操作地连接到引导产物在宿主细胞中进行表达的序列；以及足够的aav rep功能和腺病毒辅助功能，以允许将核酸分子包装到重组aavhu68衣壳中。在一个实施例中，细胞培养物由哺乳动物细胞(例如，人胚肾293细胞以及其它细胞)或昆虫细胞(例如，杆状病毒)构成。
[0120]
适合地，rep功能是通过aav提供的，所述aav与载体基因组中存在的itr来自相同来源，或来自将载体基因组包装到aav衣壳(例如，aavhu68)中的另一个来源。在某些实施例中，rep蛋白来自aav2。然而，在其它实施例中(在另一个实施例中)，rep蛋白是除了aavhu68rep之外的异源rep蛋白，例如但不限于aav1 rep蛋白、aav2rep蛋白、aav3 rep蛋白、aav4 rep蛋白、aav5 rep蛋白、aav6 rep蛋白、aav7 rep蛋白、aav8 rep蛋白；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78和rep40/52；或其片段；或另一种来源。这些aavhu68或突变aav衣壳序列中的任一种都可以在引导其在生产细胞中表达的外源调控控制序列的控制下。
[0121]
在一个实施例中，在合适的细胞培养物(例如，hek 293)细胞中制造细胞。用于制造本文所描述的基因疗法载体的方法包含本领域众所周知的方法，如产生用于产生基因疗法载体的质粒dna、产生载体以及纯化载体。在一些实施例中，基因疗法载体是aav载体，并且所产生的质粒是对aav基因组和所关注的基因进行编码的aav顺式质粒、含有aav rep和cap基因的aav反式质粒以及腺病毒辅助质粒。载体产生过程可以包含方法步骤，如开始细胞培养、进行细胞传代、接种细胞、用质粒dna转染细胞、将转染后培养基交换为无血清培养基以及采集含载体的细胞和培养基。所采集的含载体的细胞和培养基在本文中被称为粗细胞采集物。在又另一个系统中，通过用基于杆状病毒的载体进行感染来将基因疗法载体引入到昆虫细胞中。关于这些产生系统的综述，通常参见例如zhang等人,2009,“用于大规模重组腺相关病毒产生的腺病毒-腺相关病毒杂合体(adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production)”,《人类基因疗法(human gene therapy)》20:922-929，这些参考文献中的每个参考文献的内容以全文引用的方式并入本文中。在以下美国专利中也描述了制备和使用这些及其它aav产生系统的方法，这些美国专利中的每个美国专利的内容通过引用整体并入本文中：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065。
[0122]
在某些实施例中，raav.hgalc的制造工艺涉及用质粒dna瞬间转染hek293细胞。通过在pall icellis生物反应器中对hek293细胞进行pei介导的三重转染来产生单批次或多批次。在可能的情况下，在一次性的、封闭的生物处理系统中通过澄清、tff、亲和色谱和阴离子交换色谱对所采集的aav材料依次进行纯化。
[0123]
此后，粗细胞采集物可以是本主题的方法步骤，如浓缩载体采集物、渗滤载体采集物、微流化载体采集物、核酸酶消化载体采集物、过滤经微流化的中间体、通过色谱粗纯化、通过超速离心法粗纯化、通过切向流过滤进行缓冲液交换和/或调配和过滤以制备大量载体。
[0124]
在高盐浓度下进行两步亲和色谱纯化，然后使用阴离子交换树脂色谱来纯化载体药物产物并去除空衣壳。这些方法在于2016年12月9日提交的国际专利申请第pct/us2016/065970号及其优先权文档、于2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,071号以及于2015年12月11日提交并题为“aav9的可分级纯化方法(scalable purification method for aav9)”的第62/226,357号中更详细地描述，这些申请通过引用并入本文中。关于aav8的纯化方法，参见于2016年12月9日提交的国际专利申请第pct/us2016/065976号及其优先权文档、于2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,098号以及于2015年12月11日提交的第62/266,341号，并且关于rh10的纯化方法，参见于2016年12月9日提交的国际专利申请第pct/us16/66013号及其优先权文档、于2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,055号和还于2015年12月11日提交的题为“aavrh10的可分级纯化方法(scalable purification method for aavrh10)”的第62/266,347号，并且关于aav1的纯化方法，参见于2016年12月9日提交的国际专利申请第pct/us2016/065974号及其优先权文档、于2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,083号和于2015年12月11日提交的题为“aav1的可分级纯化方法(scalable purification method for aav1)”的第62/26,351号，这些申请通过引用全部并入本文中。
[0125]
为了计算空颗粒和完整颗粒的含量，将所选样品(例如，在本文的实例中经碘克沙醇(iodixanol)梯度纯化的制剂，其中gc#＝颗粒#)的vp3带体积相对于加载的gc颗粒进行作图。所得线性等式(y＝mx+c)用于计算测试品峰的带状体积中的颗粒的数量。然后将加载的每20μl颗粒数量(pt)乘以50，以得到颗粒(pt)/ml。将pt/ml除以gc/ml得到颗粒与基因组拷贝的比率(pt/gc)。pt/ml-gc/ml得到空pt/ml。空pt/ml除以pt/ml并且
×
100得到空颗粒的百分比。
[0126]
通常，用于测定具有包装的基因组的空衣壳和aav载体颗粒的方法是本领域已知的。参见例如grimm等人,《基因疗法》(1999)6:1322-1330；sommer等人,《分子疗法》(2003)7:122-128。为了测试变性的衣壳，所述方法包含使经处理的aav原液经受sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如在缓冲液中含有3-8％三乙酸盐的梯度凝胶)，然后运行凝胶直到分离出样品材料，并且将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜(优选地是尼龙)上。然后，将抗aav衣壳抗体用作与变性的衣壳蛋白结合的初级抗体，优选地抗aav衣壳单克隆抗体，最优选地b1抗aav2单克隆抗体(wobus等人,《病毒学杂志》(2000)74:9281-9293)。然后使用次级抗体，所述次级抗体与初级抗体结合并且含有一种用于检测与初级抗体的结合的装置，更优选地是含有与其共价结合的检测分子的抗igg抗体，最优选地是与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠igg抗体。一种用于检测结合的方法用于半定量地确定初级抗体与次级抗体之间的结合，优选地是能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选地是化学发光检测试剂盒。例如，对于sds-page，可以从柱级分中提取样品并在含有还原剂(例如，dtt)的sds-page上样缓冲液中加热，并且在预制的梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如，novex)上解析衣壳蛋白。可以根据制造商的说明使用
silverxpress(加利福尼亚州英杰公司)或其它合适的染色方法(即sypro红宝石色或考马斯染色)进行银染色。在一个实施例中，可以通过定量实时pcr(q-pcr)测量柱级分中的aav载体基因组(vg)的浓度。将样品稀释并用dnase i(或另一种合适的核酸酶)消化以去除外源dna。在核酸酶失活后，使用引物和对引物之间的dna序列具有特异性的taqman
tm
荧光探针进一步稀释和扩增样品。在applied biosystems prism 7700序列检测系统上测量每种样品达到定义的荧光水平所需的周期的数量(阈值周期，ct)。含有与aav载体中所含序列相同的序列的质粒dna用于在q-pcr反应中产生标准曲线。从样品获得的周期阈值(ct)的值用于通过相对于质粒标准曲线的ct值对其进行归一化来确定载体基因组效价。也可以使用基于数字pcr的端点测定。
[0127]
一方面，使用了经优化的q-pcr方法，所述方法利用了广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶k(如可从凯杰公司(qiagen)商购获得)。更具体地，经优化的qpcr基因组效价测定与标准测定类似，不同之处在于在dnase i消化之后，将样品用蛋白酶k缓冲液稀释并用蛋白酶k处理，然后进行热失活。合适地，以等于样品大小的量用蛋白酶k缓冲液稀释样品。蛋白酶k缓冲液可以浓缩2倍或更多倍。通常，蛋白酶k处理为约0.2mg/ml，但是可以在0.1g/ml到约1mg/ml之间变化。处理步骤通常在约55℃下进行持续约15分钟，但是可以在较低温度(例如，约37℃到约50℃)下进行持续较长的时间段(例如，约20分钟到约30分钟)，或者在较高的温度(例如，最高约60℃)下进行持续较短的时间段(例如，约5到10分钟)。类似地，热失活通常在约95℃下持续约15分钟，但是温度可以降低(例如，约70℃到约90℃)并且时间延长(例如，约20分钟到约30分钟)。然后将样品稀释(例如，1000倍)，并如标准测定中所描述的进行taqman分析。
[0128]
另外地或可替代地，可以使用液滴数字pcr(ddpcr)。例如，已经描述了用于通过ddpcr确定单链和自身互补aav载体基因组效价的方法。参见例如m.lock等人,《人类基因疗法方法》2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.电子出版2014年2月14日。
[0129]
简而言之，用于从基因组缺陷型aavhu68中间体中分离具有包装的基因组序列的raavhu68颗粒的方法涉及使包括重组aavhu68病毒颗粒和aavhu68衣壳中间体的悬浮液经受高效液相色谱，其中aavhu68病毒颗粒和aavhu689中间体与在10.2的ph下平衡的强阴离子交换树脂结合，并经受盐梯度，同时监测洗脱液在约260和约280下的紫外线吸光度。尽管对于raav9hu68不是最佳的，但是ph的范围可以为约10.0到10.4。在此方法中，当a260/a280的比率达到拐点时，从洗脱的级分中收集aavhu68完整衣壳。在一个实例中，对于亲和色谱步骤，可以将经渗滤的产物应用于有效捕获aav2/hu68血清型的capture select
tm poros-aav2/9亲和树脂(生命科技公司(life technologies))。在这些离子条件下，显著百分比的残留的细胞dna和蛋白质流过柱，而aav颗粒则被有效捕获。
[0130]
组合物和用途
[0131]
本文提供了一种组合物，所述组合物含有至少一种raav.hgalc原液(例如，raavhu68原液或突变raav原液)以及任选的载剂、赋形剂和/或防腐剂。raav原液是指多个raav载体，所述多个raav载体的量与例如在下文关于浓度和剂量单位的讨论中描述的量相同。
[0132]
如本文所使用的，“载剂”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗
细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶质物等。将此类培养基和药剂用于药物活性物质在本领域中是众所周知的。还可以将补充性活性成分并入到组合物中。短语“药学上可接受的”是指当向宿主施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。递送媒剂(如脂质体、纳米胶囊、微颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等)可以用于将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞中。具体地，raav载体递送的载体基因组可以被调配成用于递送或包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。
[0133]
在一个实施例中，组合物包含适合于递送到受试者的最终调配物，所述组合物是例如缓冲到生理上相容的ph和盐浓度的水性液体悬浮液。任选地，调配物中存在一种或多种表面活性剂。在另一个实施例中，可以将组合物作为稀释以施用于受试者的浓缩物运输。在其它实施例中，可以在施用时将组合物冻干并重构。
[0134]
可以从无毒的非离子表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如f68[basf]，也被称为泊洛沙姆(poloxamer)188，其具有中性ph，平均分子量为8400。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、solutol hs 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、labrasol(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油醚、tween(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“p”(对于泊洛沙姆)命名，后跟三个数字：前两位数字
×
100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字
×
10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％的量存在。
[0135]
以足够的量施用载体以转染细胞并提供足够水平的基因转移和表达，以便提供治疗益处，而不会产生过度的副作用或具有医学上可接受的生理作用，这可以由医学领域的技术人员确定。常规和药学上可接受的施用途径包含但不限于直接递送到所期望的器官(例如，肝脏(任选地通过肝动脉)、肺、心脏、眼睛、肾脏)、口服、吸入、鼻内、鞘内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其它亲本施用途径。如果需要，可以组合施用途径。
[0136]
病毒载体的剂量主要取决于如所治疗的病状、患者的年龄、体重和健康状况等因素，并且因此在患者之间可能有所不同。例如，病毒载体的治疗有效人剂量通常在约25到约1000微升到约100ml溶液范围内，所述溶液含有浓度为约1
×
109到1
×
10
16
基因组病毒载体。调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。可以监测转基因产物的表达水平以确定所得病毒载体的剂量频率，优选地含有迷你基因的aav载体。任选地，与出于治疗目的描述的剂量方案类似的剂量方案可以用于使用本发明的组合物进行免疫。
[0137]
可以以剂量单位调配复制缺陷型病毒组合物，以使含有的复制缺陷型病毒的量在约1.0
×
109gc到约1.0
×
10
16
gc的范围内(以治疗平均体重70kg的受试者)，包含所述范围内的所有整数或分数量，并且对于人类患者而言，优选地为1.0
×
10
12
gc到1.0
×
10
14
gc。在一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109或9
×
109gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
或9
×
10
10
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
11
、2
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、8
×
10
11
或9
×
10
11
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
12
、2
×
10
12
、3
×
10
12
、4
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
或9
×
10
12
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
13
、2
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
或9
×
10
13
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
或9
×
10
14
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
或9
×
10
15
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为每剂量1
×
10
10
到约1
×
10
12
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为每剂量1.4
×
10
13
到约4
×
10
14
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。
[0138]
这些上述剂量可以以各种体积的载剂、赋形剂或缓冲剂调配物施用，范围为约25到约1000微升或更大的体积，包含所述范围内的所有数字，这取决于待治疗区域的大小、所使用的病毒效价、施用途径以及所述方法的所期望的效果。在一个实施例中，载剂、赋形剂或缓冲剂的体积为至少约25μl。在一个实施例中，体积为约50μl。在另一个实施例中，体积为约75μl。在另一个实施例中，体积为约100μl。在另一个实施例中，体积为约125μl。在另一个实施例中，体积为约150μl。在另一个实施例中，体积为约175μl。在又另一个实施例中，体积为约200μl。在另一个实施例中，体积为约225μl。在又另一个实施例中，体积为约250μl。在又另一个实施例中，体积为约275μl。在又另一个实施例中，体积为约300μl。在又另一个实施例中，体积为约325μl。在另一个实施例中，体积为约350μl。在另一个实施例中，体积为约375μl。在另一个实施例中，体积为约400μl。在另一个实施例中，体积为约450μl。在另一个实施例中，体积为约500μl。在另一个实施例中，体积为约550μl。在另一个实施例中，体积为约600μl。在另一个实施例中，体积为约650μl。在另一个实施例中，体积为约700μl。在另一个实施例中，体积介于约700与约1000μl之间。
[0139]
raav.hgalc的治疗有效鞘内/脑池内剂量的范围为约1
×
10
11
到7.0
×
10
14
gc(固定剂量)-相当于109到5
×
109gc/g患者的脑质量。可替代地，以下治疗有效固定剂量可以施用于指定年龄组的患者：
[0140]
·
新生儿：约1
×
10
11
到约3
×
10
14
gc；
[0141]
·
3-9个月：约6
×
10
12
到约3
×
10
14
gc；
[0142]
·
9个月-6岁：约6
×
10
12
到约3
×
10
14
gc；
[0143]
·
3-6岁：约1.2
×
10
13
到约6
×
10
14
gc；
[0144]
·
6-12岁：约1.2
×
10
13
到约6
×
10
14
gc；
[0145]
·
12岁以上：约1.4
×
10
13
到约7.0
×
10
14
gc；
[0146]
·
18岁以上(成人)：约1.4
×
10
13
到约7.0
×
10
14
gc。
[0147]
在某些实施例中，剂量可以在约1
×
109gc/g脑质量到约1
×
10
12
gc/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约3
×
10
10
gc/g脑质量到约3
×
10
11
gc/g脑质量的范围内。
在某些实施例中，剂量可以在约5
×
10
10
gc/g脑质量到约1.85
×
10
11
gc/g脑质量的范围内。对于婴儿与青年/成人之间的换算，在一些实例中预计脑质量在四到12月龄时为约600g到约800g；九月到18月龄时为约800g到约1000g，18月龄到三岁时为约1000g到约1100g；青年或成人为1100g到约1300g，或者成年人为约1300g。
[0148]
在一个实施例中，病毒构建体可以以至少约1
×
109gc到约1
×
10
15
或约1
×
10
11
到5
×
10
13
gc的剂量递送。可以由本领域的技术人员确定用于递送这些剂量和浓度的合适的体积。例如，可以选择约1μl到150ml的体积，其中对于成人而言，选择更大的体积。通常，对于新生婴儿，合适的体积为约0.5ml到约10ml，对于年龄较大的婴儿，可以选择约0.5ml到约15ml。对于幼儿，可以选择约0.5ml到约20ml的体积。对于儿童，可以选择至多约30ml的体积。对于青春期前的少年和青少年，可以选择最大约50ml的体积。在仍其它实施例中，患者可以接受鞘内施用的体积选择为约5ml到约15ml或约7.5ml到约10ml。可以确定其它合适的体积和剂量。调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。
[0149]
可以根据所公开的方法将上文描述的重组载体递送到宿主细胞。可以将优选地悬浮于生理上相容的载剂中的raav施用于人或非人哺乳动物患者。在某些实施例中，为了施用于人类患者，将raav适当地悬浮于含有盐水、表面活性剂和生理上相容的盐或盐的混合物的水溶液中。合适地，将调配物调整到生理上可接受的ph，例如，在ph 6到9、或ph 6.5到7.5、ph 7.0到7.7或ph 7.2到7.8的范围内。由于脑脊液的ph为约7.28到约7.32，对于鞘内递送，可能期望在此范围内的ph；而对于静脉内递送，可能期望的ph为约6.8到约7.2。然而，可以选择最宽范围和这些子范围内的其它ph用于其它递送途径。
[0150]
在另一个实施例中，组合物包含载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。鉴于转移病毒所针对的适应症，本领域的技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包含盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)一起调配。其它示例性载体包含无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。缓冲液/载体应包含防止raav粘附到输液管道上但不干扰raav体内结合活性的组分。
[0151]
在一个实例中，调配物可以含有例如缓冲盐水溶液，所述缓冲盐水溶液包括水中的氯化钠、碳酸氢钠、葡聚糖、硫酸镁(例如，硫酸镁。7h2o)、氯化钾、氯化钙(例如，氯化钙。2h2o)、磷酸氢二钠及其混合物中的一种或多种。合适地，对于鞘内递送，同渗浓摩在与脑脊液相容的范围内(例如，约275到约290)；参见例如emedicine.medscape.com/article/2093316-overview。任选地，对于鞘内递送，可以将可商购获得的稀释剂用作悬浮剂，或与另一种悬浮剂和其它任选的赋形剂组合。参见例如elliotts解决方案[lukare medical]
[0152]
在某些实施例中，调配物可以含有不包括碳酸氢钠的缓冲盐水溶液。此类调配物可以含有缓冲盐水溶液，所述缓冲盐水溶液包括水中的磷酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁以及其混合物中的一种或多种，如哈佛缓冲液(harvard's buffer)。水溶液可以进一步含有p188，即可从basf商购获得的泊洛沙姆，其先前以商品名f68出售。水性溶液的ph可以为7.2。
[0153]
在其它实施例中，调配物可以含有一种或多种渗透增强剂。合适的渗透增强剂的实例可以包含例如甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸
钠、月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或edta。
[0154]
任选地，本发明的组合物除raav和一种或多种载剂之外还可以含有其它常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。适合的示例性防腐剂包含氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚以及对氯苯酚。适合的化学稳定剂包含明胶和白蛋白。
[0155]
根据本发明的组合物可以包括药学上可接受的载剂，如上文所定义的。合适地，本文所描述的组合物包括有效量的一种或多种aav，所述一种或多种aav悬浮于药学上合适的载剂中和/或与合适的赋形剂混合，所述合适的赋形剂被设计成通过注射、渗透泵、鞘内导管递送到受试者或通过另一种装置或途径递送。在一个实例中，组合物被调配用于鞘内递送。
[0156]
如本文所使用的，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指通过注射到椎管中，更具体地注射到蛛网膜下腔中使得其到达脑脊液(csf)的药物施用途径。鞘内递送可以包含腰椎穿刺、心室内(包含脑室内(icv))、枕骨下/脑池内和/或c1-2穿刺。例如，可以通过腰椎穿刺引入材料以在整个蛛网膜下腔扩散。在另一个实例中，可以向小脑延髓池中注射。
[0157]
如本文所使用的，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指药物直接进入到小脑延髓池(cisterna magna cerebellomedularis)的脑脊液中，更具体地是通过枕骨下穿刺或通过直接注射到小脑延髓池(cisterna magna)中或通过永久定位的管的施用途径。
[0158]
如本文中所使用的，术语计算机断层摄影(ct)是指放射线照相术，其中通过计算机由沿着轴线制成的一系列平面横截面图像构建身体结构的三维图像。
[0159]
本文所提供的raav.galc载体和组合物可用于校正与galc酶活性的缺陷水平相关的病状。在某些实施例中，本文所提供的raav.galc载体和组合物可用于治疗由galc缺陷引起的外周神经的功能障碍，可用于治疗由galc缺陷引起的呼吸衰竭和/或运动功能丧失，可用于治疗克拉伯病和/或可用于治疗与患者的克拉伯病相关的症状。
[0160]
在某些实施例中，包括有效量的raav.hgalc的组合物被施用于患有早期婴儿克拉伯病(eikd)的小于6月龄的患者。在某些实施例中，患者小于6月龄并且患有严重性低于eikd的galc酶缺陷。
[0161]
在某些实施例中，包括有效量的raav.hgalc的组合物被施用于大于6月龄的患者，例如患有晚期克拉伯病(likd)的7个月到约12个月的患者。在某些实施例中，患者大于6月龄或约7月龄到12月龄，并且患有严重性低于likd的galc酶缺陷。
[0162]
在某些实施例中，患者超过一岁(例如，13月龄到10岁)并且患有青少年克拉伯病(jkd)。在某些实施例中，患者为13月龄到10岁并且患有严重性低于jkd的galc酶缺陷。
[0163]
在某些实施例中，患者超过10岁(例如，10岁到12岁、或10岁到18岁或更大年龄)并且患有青年或成年发作性克拉伯病。
[0164]
在上述实施例中的任一个实施例中，本文提供的raav.hgalc疗法可以与造血干细胞置换疗法、骨髓移植(bmt)和/或底物减少疗法(srt)作为共疗法施用。在某些实施例中，raav.hgalc疗法(例如，eikd)随后是共疗法(如hsct或bmt)或酶置换疗法。在某些实施例中，在施用载体之后(包含在治疗后1周内)，疗法引起快速酶产生。
[0165]
在某些实施例中，酶置换疗法涉及施用seq id no:10的人galc蛋白。在其它实施例中，其它hgalc蛋白变体(例如，如本文所鉴定的典型序列或工程化的蛋白质)可以在酶置
换疗法中使用。不同hgalc蛋白的组合可以在酶置换疗法中使用。在此类实施例中，hgalc蛋白可以使用合适的产生系统在体外产生(参考例如c.lee等人,2005年10月1日,酶置换疗法在球状细胞脑白质病变的小鼠模型的早期临床表型中产生实质性改善(enzyme replacement therapy results in substantial improvements in early clinical phenotype in a mouse model of globoid cell leukodystrophy),《美国实验生物学联合会会刊(faseb journal)》,19(11):1549-51,2005年10月)。hgalc蛋白可以被调配用于通过任何合适途径(包含但不限于静脉内、腹膜内或鞘内途径)递送(例如，悬浮于生理相容的生理盐水溶液中)。合适剂量的范围可以为1mg/kg到20mg/kg或5mg/kg到10mg/kg，并且可以每周再施用一次或按需或多或少频繁地施用(例如，每隔一天一次、每两周一次等)。使用csf施用haavhu68.galc载体，脑和血清中的galc水平可以是超生理而无毒性的，并且可以观察到cns和pns中的经改善的神经运动功能和髓鞘形成。当新生csf施用随后是在出生后条件动物模型中进行骨髓移植时，在不存在明显体征的情况下，可以延长存活期(例如，延长到》300天)。在症状发生前克拉伯患者中，单次小脑延髓池注射aav.cgalc可以提供表型校正、存活期增加、神经传导归一化和/或经改善的脑mri。
[0166]
在某些实施例中，raav.hgalc疗法在hsct或bmt(例如，likd或jkd)之后提供。然而，在某些实施例中，raav.hgalc提供不需要hsct或bmt的充足的galc水平。
[0167]
治疗的目标是通过基于raav的cns-和pns-引导的基因疗法功能性地置换患者的缺陷型galc。可以通过评估以下eikd或likd的症状中的一个或多个症状的改善来测量用于eikd或likd患者的疗法的功效：哭闹和烦躁、痉挛状态、握拳、失笑、头控差和喂养困难；精神和运动退化、高张性或低张性、癫痫、失明、耳聋和增加的存活期(对于eikd，在无治疗的情况下，死亡通常发生在2岁之前；对于likd，存活期可以增加到3到5岁)。另外，对于这些和其它克拉伯患者，可以通过以下评估治疗功效：可以通过成像(例如，磁共振成像(mri))监测影响外周神经和cns白质两者的髓鞘形成障碍和脱髓鞘的减少(深部脑白质和齿状/小脑白质)；异常神经传导速度(ncv)和/或脑干听觉诱发电位(baep)的减少；可以在脑脊液和/或血浆中观察到增加的galc水平；和/或减少的鞘氨醇半乳糖苷累积。
[0168]
提供了一种包括重组腺相关病毒(raav)的组合物，所述raav包括靶向中枢神经系统中的细胞的aav衣壳以及已经包装在所述aav衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括对成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白进行编码的半乳糖神经酰胺酶编码序列，所述成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白具有seq id no:10中的氨基酸序列，所述蛋白处于引导所述蛋白质表达的调控序列的控制下，所述载体基因组进一步包括将所述载体基因组包装在aav衣壳中所必需的aav反向末端重复序列。
[0169]
在某些实施例中，提供了一种可用于治疗克拉伯病的组合物，所述组合物包括具有cb7.ci.hgalc.rbg的载体基因组的raavhu68。在一个实施例中，载体基因组具有(seq id no:19)的编码序列。
[0170]
在某些实施例中，提供了在用于校正由galc缺陷引起的外周神经功能障碍的方法中和/或在用于治疗由galc缺陷引起的呼吸衰竭和运动功能丧失的方法中的组合物的用途。在某些实施例中，所述方法包括施用包括重组腺相关病毒(raav)原液的组合物，所述raav包括：(a)aav衣壳，所述aav衣壳靶向中枢神经系统中的细胞并且具有(b)包装在所述aav衣壳中的载体基因组；以及(b)载体基因组，所述载体基因组包括半乳糖神经酰胺酶编
码序列，所述半乳糖神经酰胺酶编码序列对成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白进行编码，所述成熟半乳糖神经酰胺酶蛋白具有seq id no:10中的氨基酸序列，所述蛋白处于引导所述蛋白质表达的调控序列的控制下，其中所述载体基因组进一步包括将所述载体基因组包装在aav衣壳中所必需的aav反向末端重复序列。
[0171]
在某些实施例中，鞘内递送如本文提供的raav.hgalc组合物以治疗患有早期婴儿克拉伯病的患者。在某些实施例中，鞘内递送如本文提供的组合物以治疗患有晚期婴儿克拉伯病(likd)的患者。在某些实施例中，鞘内递送如本文提供的raav.hgalc组合物以治疗患有青少年克拉伯病(jkd)的患者。在某些实施例中，鞘内递送如本文提供的raav.hgalc组合物以治疗患有青年或成年发作性克拉伯病的患者。在某些实施例中，raav.hgalc组合物与造血干细胞移植(hsct)、骨髓移植和/或底物减少疗法作为共疗法施用。在某些实施例中，raav.hgalc组合物通过计算机断层扫描(ct)引导的枕骨下注射以单剂量施用于小脑延髓池中(小脑延髓池内)。
[0172]
raav.hgalc的施用稳定了如通过存活率测量的疾病进展，从而预防可能支持癫痫的新里程碑、发作和频率的采集的发展性和运动里程碑的丧失。因此，在某些实施例中，提供了用于监测治疗的方法，其中例如在30天、90天和/或6个月测量端点，并且然后例如在2年短期随访时间段期间每6个月测量端点。在某些实施例中，测量频率减少到在长期外延期间每12个月一次。考虑到靶群体中疾病的严重程度，受试者可能已经通过纳入掌握了运动技能，并且进行发展并随后丧失了其它运动里程碑，或者尚未示出运动里程碑发展的迹象。因此，评估跟踪达到所有运动里程碑的年龄以及丧失所有运动里程碑的年龄。在某些实施例中，里程碑包含例如以下中的一种或多种：无支撑坐直、用手和膝盖爬行、辅助站立、辅助行走、单独站立和/或单独行走。在某些实施例中，治疗会引起癫痫活动延缓发作和/或癫痫事件的频率减少。
[0173]
在某些实施例中，监测受试者的治疗的方法使用临床量表来定量治疗对适应性行为、认知、语言、运动功能和/或健康相关生活质量的发展和变化的影响。量表和领域包含例如贝利婴幼儿发展量表(bayley scales of infant and toddler development，评估婴幼儿在以下五个领域的发展：认知、语言、运动、社会情感和适应性行为)、文兰适应性行为量表(vineland adaptive behavior scales，第三版)(评估从出生到成年(0-90岁)在以下五个领域内的适应性行为：交流、日常生活技能、社交、运动技能和适应不良行为)、皮博迪发展运动量表(peabody developmental motor scales，第二版)(测量从出生到五岁儿童的相关运动功能；评估集中在以下六个领域：反射、静止、运动、物体操纵、抓握和视觉-运动整合)、婴幼儿生活质量问卷(itqol)(为2个月婴儿到5岁幼儿设计的健康相关生活质量的家长报告量度)以及马伦早期学习量表(mullen scales of early learning，评估68月龄以下婴幼儿的语言、运动以及感知能力)。在某些实施例中，通过评价髓鞘形成、与髓鞘形成相关的功能性结果和潜在疾病生物标志物来监测或测量治疗的效果。在某些实施例中，在治疗受试者之后，中枢和外周脱髓鞘进展缓慢或停止。可以通过白质区域的弥散张量磁共振成像(dt-mri)各向异性测量和皮质脊髓运动束的纤维跟踪来跟踪中枢脱髓鞘，其中的变化是疾病状态和进展的指标。通过对运动神经(腓深神经、胫骨神经和尺骨神经)和感觉神经(腓肠神经和正中神经)的神经传导速度(ncv)研究，可以间接测量外周脱髓鞘，以监测指示生物活性髓鞘变化的波动(即f波和末端潜伏期、振幅或应答的存在或不存在)。
[0174]
在某些实施例中，提供了一种在施用raav.hgalc之后监测治疗的方法，其中对于在治疗前没有出现显著视力丧失的受试者，评价所述受试者的视力丧失的延缓或视力丧失的不存在。因此，视觉诱发电位(vep)的测量用于客观地测量对视觉刺激的应答作为中枢视力损害或丧失的指标。在某些实施例中，使用例如脑干听觉诱发应答(baer)测试监测受试者在治疗后的听力损失。在某些实施例中，提供了一种在施用raav.hgalc之后监测治疗的方法，其中测量受试者的鞘氨醇半乳糖苷水平。
[0175]
应注意的是，术语“一个(a)”或“一个(an)”是指一个或多个。因此，术语“一个”或“一种”、“一或多个”和“至少一个”在本文可互换地使用。
[0176]
词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”、“包括(comprising)”和“包含(including)”将被解释为是包含性而非排他性的。词语“由
……
组成(consist)”、“由
……
组成(consisting)”及其变体将被解释为是排他性的而非包含性。虽然说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的，但是在其它情况下，也意图使用“由
……
组成”或“基本上由
……
构成”的语言来解释和描述相关的实施例。
[0177]
如本文所使用的，除非另有说明，否则术语“约”意指相对于给定参考的10％(
±
10％)的变化性。
[0178]
如本文所使用的，“疾病”、“病症”和“病状”可互换地用于指示受试者的异常状态。
[0179]
术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并且包括rna或rna和蛋白质的产生。关于rna，术语“表达”或“翻译”尤其涉及肽或蛋白质的产生。表达可以是暂时的或可以是稳定的。
[0180]
如本文所使用的，“表达盒”是指核酸分子，所述核酸分子包括编码序列、启动子，并且可以包含用于其的其它调控序列。在某些实施例中，载体基因组可以含有两个或更多个表达盒。在其它实施例中，术语“转基因”可以与“表达盒”互换使用。通常，用于产生病毒载体的这种表达盒含有本文所描述的基因产物的编码序列，所述编码序列侧接有病毒基因组的包装信号和其它表达控制序列，如本文描述的序列。
[0181]
缩写“sc”是指自身互补的。“自身互补aav”是指其中由重组aav核酸序列所携带的编码区已经被设计成形成分子内双链dna模板的构建体。感染后，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scaav将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链dna(dsdna)。参见例如d m mccarty等人,“自身互补重组腺相关病毒(scaav)载体独立于dna合成而促进高效转导(self-complementary recombinant adeno-associated virus(scaav)vectors promote efficient transduction independently of dna synthesis)”,《基因疗法》,(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。自身互补aav在例如美国专利第6,596,535号；7,125,717；第7,456,683号中描述，这些美国专利中的每个美国专利以全文引用的方式并入本文中。
[0182]
术语“异源性”当结合蛋白质或核酸使用时表明蛋白质或核酸包括在自然界中未发现彼此间的相同关系的两个或更多个序列或子序列。例如，核酸通常是重组地产生的，具有来自不相关基因的布置成产生新的功能性核酸的两个或更多个序列。例如，在一个实施例中，核酸具有来自一种基因的布置成引导编码序列从不同基因表达的启动子。因此，关于编码序列，启动子是异源的。
[0183]“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有所关注的基因的表达盒包装在病
毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒粒子，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，其不能产生子代病毒粒子，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)
”‑
仅含有所关注的基因，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。
[0184]
在许多情况下，raav颗粒被称为dnase抗性的。然而，除此核酸内切酶(dnase)之外，其它核酸内切酶和核酸外切酶也可以用于本文所描述的纯化步骤中，以去除污染性核酸。可以选择此类核酸酶以降解单链dna和/或双链dna以及rna。此类步骤可以含有单个核酸酶或针对不同靶标的核酸酶的混合物，并且可以是核酸内切酶或核酸外切酶。
[0185]
术语“核酸酶抗性”表示aav衣壳已经在表达盒周围完全组装，所述表达盒被设计成将基因递送到宿主细胞并保护这些包装的基因组序列在被设计成去除产生过程中可能存在的污染性核酸的核酸酶温育步骤期间免于降解(消化)。
[0186]
如本文所使用的，“有效量”是指在靶细胞中递送和表达一定量的来自载体基因组的基因产物的raav组合物的量。可以基于动物模型而不是人类患者来确定有效量。本文描述了合适的鼠类模型的实例。
[0187]
除非在本说明书中另有定义，否则本文所使用的技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员和参照公开文本所通常理解的相同含义，这为本领域的技术人员提供了本技术中使用的许多术语的通用指南。
[0188]
实例
[0189]
以下实例仅是说明性的，并且不旨在限制本发明。
[0190]
[0191]
[0192]
[0193][0194]
实例1-重组aavhu68.hgalc
[0195]
raavhu68.hgalc是携带对人galc进行编码的工程化的序列的aav。raavhu68.hgalc的aavhu68衣壳在氨基酸水平上与aav9 99％相同。在aav9[seq id no:4]与aavhu68衣壳[seq id no:2]之间不同的两个氨基酸定位在衣壳的vp1(67和157)和vp2(157)中，并且在图1中被标识出来。还参见wo 2018/160852，其通过引用并入本文中。
[0196]
raavhu68.hgalc是使用对侧接有aav itr的转基因盒进行编码的aav顺式质粒、对aav2 rep和aavhu68 cap基因(paav2/hu68.kanr)进行编码的aav反式质粒和辅助腺病毒质粒(padδf6.kanr)通过hek293细胞的三重质粒转染产生的。
[0197]
a.aav载体基因组质粒序列元件
[0198]
图2中示出了载体基因组的线性映射。载体基因组含有以下序列元件：
[0199]
反向末端重复序列(itr)：itr是源自侧接载体基因组的所有组件的aav2(130bp，genbank：nc_001401)的相同、相反互补序列。当以反式方式提供aav和腺病毒辅助功能时，itr功能既充当载体dna复制的起点，又充当载体基因组的包装信号。如此，itr序列表示载体基因组复制和包装所需的唯一顺式序列。
[0200]
人巨细胞病毒立即早期增强子(cmv ie)：从人源性cmv(382bp，genbank：k03104.1)获得的这种增强子序列增加了下游转基因的表达。
[0201]
鸡β肌动蛋白启动子(ba)：这种普遍存在的启动子(282bp，genbank：x00182.1)以驱动任何cns细胞类型中的转基因表达。
[0202]
嵌合内含子(ci)：混合内含子由鸡β肌动蛋白剪接供体(973bp，genbank：x00182.1)以及兔β珠蛋白剪接受体元件组成。内含子是转录的，但却通过剪接从成熟的mrna中去除，从而将其任一侧的序列放在一起。表达盒中内含子的存在已经示出有助于将mrna从核转运到细胞质，因此增强用于翻译的稳定水平的mrna的累积。这是旨在用于增加水平的基因表达的基因载体中的常见特征。
[0203]
编码序列：人galc基因的工程化的cdna对人半乳糖神经酰胺酶蛋白进行编码，所述人半乳糖神经酰胺酶蛋白是负责水解和降解髓鞘半乳糖脂(2055bp；685氨基酸[aa]，
genbank：eaw81361.1)的溶酶体酶。
[0204]
兔β珠蛋白聚腺苷酸化信号(rbg polya)：rbg polya信号(127bp，genbank：v00882.1)促进顺式转基因mrna的高效聚腺苷酸化。此元件充当转录终止的信号、新生转录物的3
′
端处的特异性切割事件以及添加长聚腺苷酸尾的信号。
[0205]
b.反式质粒：paav2/1.kanr(p0068)
[0206]
图21中呈现了aav2/hu68反式质粒paav2/hu68.kanr(p0068)。
[0207]
aav2/hu68反式质粒是paav2/hu68.kanr(p0068)。paav2/hu68.kanr质粒的长度为8030bp并且对复制和包装aav载体基因组所要求的四个野生型aav2复制酶(rep)蛋白进行编码。paav2/hu68.kanr质粒还对三种wt aavhu68病毒粒子蛋白衣壳(cap)蛋白进行编码，所述cap蛋白组装成aav血清型hu68的病毒粒子外壳，以容纳aav载体基因组。
[0208]
为了产生paav2/hu68.kanr反式质粒，去除来自质粒paav2/9n(p0061-2)的(对源自pbluescript ks载体的质粒主链上的野生型aav2 rep和aav9 cap基因进行编码的)aav9 cap基因，并用aavhu68 cap基因置换。氨苄青霉素抗性(ampr)基因也被卡那霉素抗性(kanr)基因置换，从而产生paav2/hu68.kanr(p0068)。这种克隆策略将aav p5启动子序列(其一般驱动rep表达)从rep的5
′
端重新定位到cap的3
′
端，从而在rep的上游留下截短的p5启动子。此截短的启动子用于下调rep的表达，并因此使载体产量最大化(图21)。
[0209]
已通过直接测序验证了质粒的所有组分部分。
[0210]
c.腺病毒辅助质粒：paddeltaf6(kanr)
[0211]
(图22b)呈现了腺病毒辅助质粒paddeltaf6(kanr)。
[0212]
质粒paddeltaf6(kanr)的大小为15,770bp。质粒含有对于aav复制重要的腺病毒基因组的区域；即e2a、e4和va rna(腺病毒e1功能由hek293细胞提供)。然而，质粒不含其它腺病毒复制或结构基因。质粒不含对于复制至关重要的顺式元件，如腺病毒itr；因此，期望不产生感染性腺病毒。质粒源自ad5的e1、e3缺失分子克隆(pbhg10，基于pbr322的质粒)。将缺失引入到ad5中以消除不必要的腺病毒基因的表达并将腺病毒dna的量从32kb减少到12kb(图22a)。最后，用卡那霉素抗性基因替代氨苄青霉素抗性基因以产生padeltaf6(kanr)(图22b)。保留在此质粒中的e2、e4和vai腺病毒基因以及存在于hek293细胞中的e1对于aav载体产生都是必需的。根据图30和图31示出的流程图分别产生了载体并制备了调配物。
[0213]
实例2-在galc缺陷型twitcher小鼠模型中的aavhu68.hgalc递送
[0214]
以下描述的研究使用twitcher小鼠模型来建立将对工程化的人galc序列(seq id no:9)进行编码的raavhu68载体(图2)递送到csf中的潜能，以便达到galc表达水平的治疗水平并挽救疾病的若干种生物标志物。图4b中提供了twitcher小鼠研究的综述。
[0215]
twitcher小鼠是1976年在杰克逊实验室(jackson laboratory)被鉴别为自发突变的克拉伯病的自然发生的近亲繁殖的模型(kobayashi t.等人,(1980)《脑研究(brain research)》,202(2):479-483)。受影响的小鼠对twitcher功能缺失等位基因(twi)是纯合的，所述功能缺失等位基因由galc基因中的g到a突变组成。这种突变引起早期终止密码子(w339x)。截短的galc蛋白具有接近0％的残余酶活性，所述酶活性类似于在患有婴儿型克拉伯病的患者中观察到的galc活性水平。杂合载剂小鼠(twi/+)是表现型正常的。
[0216]
疾病在twitcher小鼠中的进展是充分证明的(图4a)，并且表5中呈现了多种神经
病理学和行为缺陷拟表型婴儿克拉伯病。就如婴儿克拉伯病患者一样，小鼠体内的galc缺陷导致细胞毒性脂质中间体(即鞘氨醇半乳糖苷)累积。twitcher小鼠也显示出通过吞噬的、充满鞘氨醇半乳糖苷的球状细胞大量浸润pns和cns白质，所述球状细胞被认为源自巨噬细胞和/或小神经胶质谱系(tanaka k.等人,(1988)《脑研究》,454(1):340-346；levine s.m.等人,(1994)《国际发育神经学期刊(intl j dev neuro.)》,12(4):275-288)。这会引起脱髓鞘，其是克拉伯患者的关键疾病印记之一。在最初的正常髓鞘形成时间段之后，受影响的twitcher小鼠由于形成髓磷脂的许旺细胞的死亡而在10日龄之后脱失pns中的髓磷脂(jacobs j.m.等人,(1982)《神经科学杂志(j neurol sci.)》,55(3):285-304)并且由于形成髓磷脂的少突胶质细胞的死亡而在20日龄之后脱失cns中的髓磷脂。很可能因为这种延缓，这些小鼠的外周神经中的脱髓鞘比cns中的脱髓鞘更为严重(suzuki k.和suzuki k.(1983)《美国病理学杂志(the american journal of pathology)》,111(3):394-397)。最终，twitcher小鼠在症状发作之后显示出一致且迅速的神经系统恶化，可以在症状发作时的婴儿克拉伯患者中类似地观察到所述神经系统恶化。这些小鼠的行为症状包含与在人类患者中观察到的运动表型相似的运动表型，包含出现于大约20日龄的震颤、抽搐和后腿无力。小鼠最终进展到人道端点，其特征在于在约40日龄时体重严重下降和瘫痪(wenger d.a.,(2000)《今日之分子医学(molec med today.)》,6(11):449-451)。
[0217]
婴儿克拉伯患者表现出与twitcher小鼠类似的临床特征。因此，twitcher小鼠模型足以评估raavhu68.hgalc的功效(挽救酶活性以改善存活率、运动功能以及脑和神经病理学)，以支持婴儿克拉伯指征。如下所述使用twitcher小鼠的研究证明了在单次icv施用(在icm技术上不可行的小鼠模型中，这是最有效的施用途径)之后raavhu68.hgalc在相关组织中表达活性galc酶、挽救存活期、改善运动功能并改善cns和pns的组织病理学的功效。
[0218]
症状发生前新生twitcher小鼠
[0219]
本研究的目的是建立在twitche小鼠模型中实现最大功效的最优roa、衣壳血清型和剂量范围。症状发生前新生小鼠被选择用于这些研究，以便最大化地改变观察到的疾病救护。
[0220]
为了建立最优roa，将通过注射到颞静脉中的iv途径与icv途径进行比较，因为这两种途径可以转导新生动物中的cns和pns。在pnd 0，以1.00
×
10
11
gc剂量向症状发生前twitcher小鼠(twi/twi)iv施用raavhu68.hgalc或以2.00
×
10
10
gc的5倍更低剂量icv施用raavhu68.hgalc。选择iv剂量，因为其对应于1.00
×
10
14
gc/kg，即实现cns转导所需的高剂量，并且选择5倍更低icv剂量，因为直接施用于csf中促进在低剂量下的cns转导。作为对照，用媒剂(pbs)icv注射症状发生前年龄匹配的twitcher小鼠。当到达由体重》最大体重的20％和/或后肢瘫痪限定的人道端点时，对动物实施安乐死，并记录存活期。与未经处理的对照相比，以更高剂量(1.00
×
10
11
gc)iv施用raavhu68.hgalc提供了一些存活期益处。然而，与iv施用相比，以5倍更低剂量(2.00
×
10
10
gc)icv施用raavhu68.hgalc授予优越的存活期益处(图5)。因此，选择了icv roa以供后续研究。
[0221]
为了鉴定用于对人galc进行编码的载体基因组的神经系统递送的最佳aav衣壳，测试了四种不同的aav衣壳。所述衣壳包含aav血清型3b(aav3b)、aav血清型5(aav5)、aav血清型1(aav1)以及aav血清型hu68(raavhu68.hgalc)。每种aav载体以2.00
×
10
10
gc的剂量通过icv施用，这是之前确立的低剂量和roa以有效延长症状发生前twitcher小鼠的存活期，
同时允许短研究持续时间(图5)。作为对照，在pnd 0向症状发生前twitcher小鼠组仅icv施用媒剂(pbs)。虽然所有四种衣壳与媒剂处理的对照相比增强了存活率，但是aavhu68衣壳(raavhu68.hgalc)产生了超出aav3b、aav5和aav1的优越的存活率(图6)。因此，选择了aavhu68衣壳(raavhu68.hgalc)以供后续研究。
[0222]
为了确定剂量范围，在pnd 0以2.00
×
10
10
gc、5.00
×
10
10
gc或1.00
×
10
11
gc的剂量向新生症状发生前twitcher小鼠icv施用raavhu68.hgalc。作为对照，在pnd 0向年龄匹配的症状发生前twitcher(twi/twi)小鼠以及未受影响的杂合子(twi/+)和野生型小鼠icv施用媒剂(pbs)。
[0223]
在pnd 35，使用棒测定评估小鼠的移动性和协调性
[0224]
(图7)。转棒仪是小鼠在其上奔跑的加速棒，并且测定开始与小鼠从棒上跌落的时间点之间的时延被认为与运动协调性相关。选择pnd 35时间点，因为这是受影响的twitcher小鼠在达到人道安乐死端点之前显示出可测量运动缺陷的时间点。转棒仪测定揭示了raavhu68.hgalc施用之后的运动和协调性的部分挽救。挽救程度似乎依赖于剂量，并且最高raavhu68.hgalc剂量(1.00
×
10
11
gc)观察到显著更长的跌落延迟(p《0.01)(图7)。
[0225]
在转棒仪测定之后，跟踪所有处理组的存活期。与媒剂处理的twitcher(twi/twi)对照相比，观察到在pnd 0在症状发生前施用raavhu68.hgalc的twitcher(twi/twi)小鼠的存活期的剂量依赖性增加。观察到施用1.00
×
10
11
gc的最高raavhu68.hgalc剂量的小鼠的最长中值存活期(130天)(图8)。
[0226]
如果在症状发作之前向twitcher小鼠施用，这些鉴定最优roa、衣壳和剂量范围的poc实验累计地证明raavhu68.hgalc在保持神经运动功能和延长存活期方面的功效。
[0227]
有症状twitcher小鼠
[0228]
因为想要重现与症状发作之后被纳入患者相似的环境，本研究的目的是检验在行为症状发作之前疾病病理的早期(pnd 12；被称为“早期有症状的”)期间或在小鼠显示出行为症状时疾病病理的晚期(pnd 21；被称为“晚期有症状的”)期间施用的raavhu68.hgalc的功效。此外，pnd 0小鼠具有相当于早产胎儿的脑发育成熟度，而pnd 12和pnd 21分别翻译为2-月-龄和9-月-龄，(www.translatingtime.org)，这更加接近地重现意图用于fih的婴儿群体。
[0229]
在pnd 12，以1.00
×
10
11
gc或2.00
×
10
11
gc的剂量向早期有症状twitcher小鼠icv施用raavhu68.hgalc，而在pnd 21，以2.00
×
10
11
gc的更高剂量向另一组晚期有症状twitcher小鼠icv施用raavhu68.hgalc。选择1.00
×
10
11
gc的较低剂量进行施用，因为发现其是增加twitcher小鼠的存活期的最有效剂量(以上所述)。因为假设患有更严重脱髓鞘的小鼠可能需要更高剂量，所以在pnd 21，2.00
×
10
11
gc的更高raavhu68.hgalc剂量还用于处理小鼠。作为对照，在pnd 12，仅向早期有症状twitcher小鼠(twi/twi)和未受影响的杂合子(twi/+)icv施用媒剂(pbs)，并且来自研究1的历史数据用于与在pnd 0施用1.11
×
10
11
gc的twitcher小鼠(twi/twi)进行比较。
[0230]
在pnd 35，使用转棒仪测定评估小鼠的移动性和协调性，所述时间是twitcher小鼠(twi/twi)显示出可测量运动缺陷的时间点。转棒仪测定揭示了当在pnd 0时以1.00
×
10
11
gc(p《0.01)的剂量向症状发生前twitcher小鼠或在pnd 12以1.00
×
10
11
gc(p《0.001)或2.00
×
10
11
gc(p《0.01)的剂量向早期有症状小鼠施用raavhu68.hgalc时的运动和协调性
的部分挽救。当在pnd 21向晚期有症状twitcher小鼠施用2.00
×
10
11
gc的raavhu68.hgalc剂量时，没有观察到运动和协调性的显著挽救(图9)。
[0231]
在转棒仪测定之后，跟踪所有处理组的存活期。与媒剂处理的twitcher对照相比，在向pnd 12时的早期有症状twitcher小鼠和pnd 21时的晚期有症状twitcher小鼠两者施用raavhu68.hgalc之后，观察到了更长的存活期。然而，当在pnd 12以2.00
×
10
11
gc的高剂量向早期有症状twitcher小鼠施用raavhu68.hgalc时，获得了最大存活率(图10)。
[0232]
twitcher小鼠的存活期和神经运动功能的改善累积地表明如果在疾病较早阶段施用，那么raavhu68.hgalc可以更有效。
[0233]
有症状twitcher小鼠的药理学研究
[0234]
本研究的目的是评估raavhu68.hgalc施用之后的药理学、功能性和组织病理学读数。因为之前的研究会为了促进存活率分析而在人道端点时处死动物，这排除了在twitcher小鼠和媒剂处理对照的年龄匹配时间点收集药理学和组织学读数。因此，本研究检验这些端点。
[0235]
在pnd 12，以2.00
×
10
11
gc的剂量向早期有症状twitcher小鼠(twi/twi)icv施用raavhu68.hgalc。在pnd 12，向年龄匹配的未受影响的twitcher杂合子(twi/+)和野生型小鼠icv施用pbs作为对照。选择2.00
×
10
11
gc的raavhu68.hgalc剂量用于poc，以实现最大功效，并且因为处于脑发育成熟度相当于2-月-龄婴儿(www.translatingtime.org)的动物pns脱髓鞘发作之后不久，所以选择pnd 12作为给药日，这反映出用于fih试验的预期的婴儿群体。
[0236]
从pnd 22开始，每天监测所有小鼠的临床体征。pnd 22被选择作为这种评估的第一时间点，因为这是可在twitcher小鼠中观察到行为表型的最早天数之一。使用如表1中详述的未公开的抱握能力、步态、震颤、驼背和皮毛质量的评估对临床体征进行评分。这些度量基于小鼠通常呈现的症状有效评估twitcher小鼠的临床状态。0以上的得分表明临床恶化。
[0237]
表1.小鼠的临床评分评估
[0238][0239]
利用这项评估，在pnd 12向早期有症状twitcher小鼠(twi/twi)施用raavhu68.hgalc表现出接近0的临床得分，这与野生型和未受影响的twitcher杂合子(twi/+)的得分相当。相比之下，年龄匹配的媒剂处理的twitcher(twi/twi)小鼠在大多数时间进程内表现出更高的评估得分，表明临床恶化(图11a)。
[0240]
作为补充性功能测定，在pnd 35进行转棒仪测试以评估神经运动表型。在pnd 12施用raavhu68.hgalc的早期有症状twitcher小鼠(twi/twi)表现的跌落延迟与野生型和未受影响的twitcher杂合子(twi/+)的跌落延迟相当，而年龄匹配的媒剂处理的twitcher小鼠表现出显著更短的跌落延迟(p《0.05)，这说明神经运动功能的恶化(图11b)。
[0241]
为了确定在与组织学改善相关的功能性端点施用raavhu68.hgalc的观察到的益处，在pnd 40对所有小鼠进行尸检，并对后肢坐骨神经进行组织学检查。选择pnd 40作为尸检时间点，因为这是未经处理或媒剂处理的twitcher小鼠到达人道端点的近似年龄并且也是神经病理最严重的时间点。选择坐骨神经进行组织学分析，因为与cns相比，其外周神经更容易受到twitcher小鼠的脱髓鞘的影响。此外，缺乏通过hsct对患者的pns进行的校正仍然是婴儿患者中重要的未满足的需求，因此检查raavhu68.hgalc施用对pns的影响是受关注的。
[0242]
对坐骨神经切片进行处理以可视化髓磷脂(暗染色)和球状细胞(亮染色)(图12)。在pnd 40，媒剂处理的野生型对照的坐骨神经富含髓磷脂并且一般无球状细胞浸润。然而，在媒剂处理的有症状twitcher小鼠(twi/twi)中，在坐骨神经中观察到严重的几乎全部的脱髓鞘，伴随有神经增厚和球状细胞浸润。相比之下，在pnd 12施用raavhu68.hgalc的有症状twitcher小鼠(twi/twi)的坐骨神经中保留了髓磷脂，虽然没达到在年龄匹配的野生型小鼠中正常观察到的程度。与媒剂处理的twitcher小鼠相比，在raavhu68.hgalc处理的twitcher小鼠的神经中还观察到较少的球状细胞。这些数据与功能端点相关，表明在疾病进展早期期间施用raavhu68.hgalc的有症状twitcher小鼠的经改善的临床得分和神经运动功能可能与潜在的疾病神经病理学发作的逆转或延迟相关。
[0243]
最终，尸检日(pnd 40)从野生型小鼠和twitcher小鼠中获取脑、肝和血清的样品，以定量转基因产物(即galc)的活性水平。使用基于荧光团的galc活性测定定量galc，以确认在raavhu68.hgalc施用之后，aav载体被转导并且功能酶被表达。野生型动物用作此测定的对照，并且twitcher杂合子(twi/+)被排除在外，因为这些小鼠的galc活性水平降低，即使没有可观察到的表型。因为神经系统是galc递送的靶组织，所以对脑进行检查，并且对肝和血清进行检查以评估在外周器官系统中的转导。
[0244]
以2.00
×
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11
gc的剂量icv施用raavhu68.hgalc之后28天，观察到twitcher(twi/twi)的脑、肝和血清中的galc活性的超生理水平，所述水平高于在媒剂处理的twitcher(twi/twi)小鼠和野生型对照的相同组织中观察到的水平(图13a-图13c)。
[0245]
数据累计地表明，向早期有症状twitcher小鼠施用raavhu68.hgalc导致galc活性的超生理水平，这与不太严重的临床症状、神经运动功能障碍、pns脱髓鞘和球状细胞神经病理学相关。
[0246]
骨髓移植与raavhu68.hgalc施用的组合的效应
[0247]
此研究调查了raavhu68.hgalc和骨髓移植(bmt)的双重疗法的潜在益处。因为克拉伯病的突出的神经炎性组成，因此对这种组合疗法进行调查。理论上，存在协同效应，因为hsct提供了cns中的galc酶的另外来源(来自源自于移植细胞和raavhu68.hgalc转导的神经元的巨噬细胞/小胶质细胞)，同时raavhu68.hgalc对pns进行校正，所述校正不受hsct的影响。此外，本研究还检查了不同的组合治疗设计，以评估raavhu68.hgalc在以下患者中是否有效：1)通过nbs程序首先接受hsct随后进行基因疗法的患者和/或2)首先接受基因疗法随后进行hsct(如果符合条件的话)的患者。
[0248]
表2中总结了组合疗法研究。
[0249]
表2.小鼠的aav和bmt组合疗法的研究
[0250][0251]
以1.00
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11
gc的剂量施用raavhu68.hgalc。
[0252]
接受bmt的所有小鼠在bmt程序之前还经历使用白消安进行1-2天的清髓性处理，以减小内源骨髓细胞的数量。
[0253]
*历史对照用于这些组。第5组是来自研究1的历史对照。第6组是来自研究2的历史对照。第7组是由来自研究1的n＝8小鼠(pnd 0)和来自研究2的n＝4小鼠(pnd 12)组成的历史对照。
[0254]
缩略语：aav，腺相关病毒；bmt，骨髓移植；gc，基因组拷贝；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pnd，出生后天数；tbd，待确定。
[0255]
使用1.00
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gc的raavhu68.hgalc剂量，因为预期组合疗法会产生更好应答，这允许的aavhu68.hgalc的剂量比在先前raavhu68.hgalc单一疗法研究中使用的剂量更低。在存活率、体重和神经观察方面评估raavhu68.hgalc的功效(例如，震颤和异常抱握反射的存在)。
[0256]
图14a-图14b中示出了第1-3组的存活率数据。到目前为止，在pnd 0通过用icv施用raavhu68.hgalc处理症状发生前twitcher小鼠(twi/twi)随后是在pnd 10进行bmt的组合实现了最佳存活率(第2组)。在无明显体征的情况下，存活期延长到》300天。基于先前描述的临床评估(表1)，这些小鼠的身体状况似乎更好，显示出没有明显步态异常和无抱握的
轻微震颤(分析仍继续进行；数据未示出)。raavhu68.hgalc之前接受bmt的小鼠(第3组)目前仍存活(n＝3/7)，但所述小鼠表现出明显震颤、一些步态异常和较轻体重。然而，结合bmt的白消安处理方案对年龄小于10日龄的小鼠是有毒的，并且第2组和第3组两者中的小鼠在bmt之前或之后不久都表现出死亡率增加，无论组合疗法的顺序如何。第4组被注射以模拟向早期有症状患者施用基因疗法随后是bmt的临床相关情况。
[0257]
这些数据累计地表明，与单独地每种处理相比，将raavhu68.hgalc处理与后续bmt组合可以在克拉伯病的鼠类模型中提供更好的功效。
[0258]
实例3-鉴定twitcher小鼠模型中的raavhu68.galc的最小有效剂量(med)
[0259]
使用制造用于非人灵长类动物药理学-毒理研究的毒物学载体批次在twitcher小鼠中进行med研究。本研究包含至少两个时间点并且评价四个剂量水平，以确定med、药理学和组织病理学(功效和安全性)。基于试点剂量范围研究和扩展到人类时的最大可行性剂量选择剂量水平。在pnd 12通过icv注射动物，以模拟早期有症状患者。与年龄匹配的对照相比，一些动物在注射后一个月被处死(当所处理的媒剂达到人道端点时)，以获得药理学和功效读数(与研究3的设计相似)。剩余小鼠被跟踪，直到人道端点为止，以评估处理对存活期的影响。进行生命评估(体重、临床评分和转棒仪测定)的人员对小鼠处理和基因型均不知情。
[0260]
med是通过分析存活期益处、临床评分、体重、使用转棒仪测定的神经运动功能、靶器官中的galc活性水平以及cns和pns中的神经病理的校正(即髓鞘化改善、球状细胞浸润减少)来确定的。
[0261]
下表3和表4中呈现了研究设计和研究进度表。
[0262]
表3.鼠类med研究设计
[0263][0264]
缩略语：csf，脑脊液；n，动物数量；wt，野生型，itffv，鞘内最终调配物缓冲液(itffb)
[0265]
表4.研究进度表
pathol.)》,66(2):375-8；wenger d.a.(2000)《今日之分子医学》,6(11):449-451；bradbury a.m.等人,(2018)《人类基因疗法》,29(7):785-801)。
[0272]
表5.克拉伯病的鼠类和犬类模型以及与人类早期婴儿表现的比较
[0273][0274][0275]
缩略语：a，腺嘌呤；c，胞嘧啶；cns，中枢神经系统；g，鸟嘌呤；galc，半乳糖神经酰胺酶；kb，千碱基；pns，外周神经系统；w339x，位置339处变为终止密码子的色氨酸；y158s，位置158处酪氨酸到丝氨酸取代。
[0276]
本研究的目的是通过评价与大型动物疾病模型中的raavhu68.hgalc类似的aav载体的功效来评估治疗方法的可扩展性。为此，利用天然存在的克拉伯病的犬类模型，通过预期临床途径(icm)向所述犬类模型施用与对galc的工程化的犬类版本进行编码的raavhu68.hgalc类似的载体(aavhu68.cb7.ci.cgalcco.rbg)(图3)。为了限制对外来转基因的过度免疫应答的风险，选择galc的犬类版本作为转基因，但载体的其它元件相当于raavhu68.hgalc(包含普遍存在的cb7启动子和aavhu68衣壳)。
[0277]
图23提供了研究设计。在2-3周龄时以3.00
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10
13
gc的剂量向犬(n＝总共7只)icm注射表达galc的aav载体(n＝4只受影响的犬)或媒剂(人工csf；n＝2只受影响的犬；n＝1只健康野生型同窝犬)。选择动物的年龄以确保犬在行为症状发作之前尽早进行处理，因为与在稍后时间点处理的有症状小鼠相比，raavhu68.hgalc被发现在症状发生前twitcher小鼠中更有效(参见实例2)。
[0278]
组名称
[0279][0280]
给药后，每天监测动物(笼侧观察)，每周称重并且每两周一次录像。还接受脑mri，并定期接受完整身体检查、神经系统检查、神经传导记录和baer记录。这些检查的目的是评估cns和pns的完整性。功效读数包含脑髓鞘形成(注射后8周通过mri、baer和最终端点的组织学评估)、外周神经髓鞘形成(通过ncv和最终端点的组织学评估)、神经系统检查和身体检查(体重、步态、反射、本体感受、每两周一次对在开放区域中玩耍的犬进行录像)。另外，还评估了药理学、安全性和载体生物分布，因为所注射的载体与raavhu68.hgalc相当，并且使用了预期临床roa(icm施用)。神经传导评估测量神经的完整性作为髓鞘完整性的间接测量结果。除了测试cns(即脑干)的听觉通路中的传导和髓鞘完整性之外，baer记录类似于ncv。安全读数包含注射前第0天以及第14、28、56、70、120和180天(每次
±
2天)的定期细胞血计数(cbc)、血清化学和凝血。当体积允许用于研究疾病校正(脂质组学、鞘氨醇半乳糖苷浓度)和wbc计数(脑脊液细胞增多)作为安全读数时，还对csf进行处理以进行脂质组学生物标志物分析和细胞计数。在第56天，通过mri(t1和t2加权)检查犬以观察cns中的髓鞘形成。在以下所示的时间点处的基线上评估csf和血清两者中的galc的酶活性，以测量在cns和pns中分泌的活性治疗酶的数量。选择每个测定的研究天数以最大限度地减少动物的镇静状态，同时在适当的时间点收集与犬的已知克拉伯病进展相对应的完整数据(图15)。
[0281]
收集血液和csf以进行安全性和生物标志物分析。对组织的综合清单进行采样以进行组织病理学分析，以便确定raavhu68.hgalc施用是否会减少脱髓鞘和神经炎症。通过生物分布评估raavhu68.hgalc的转导和表达。galc酶活性读数(图24b和图24c)表明所有经处理的克拉伯犬都具有到csf中的快速酶分泌。
[0282]
在症状发生前克拉伯犬中，单次小脑延髓池注射剂量为3.00
×
10
13
gc的raavhu68.cgalc提供了表型校正(图25e)、存活期增加(图24a)、神经传导归一化(图25a-图25d)、正常血液工作以及经改善的脑mri(图29a和图29b)，展示了方法的可扩展性。脑组织学示出相对于对照，raavhu68.cgalc克拉伯犬中的髓鞘形成改善(图26a)和神经炎症减少(小脑白质中的iba1染色)(图26b)。在这项研究中最初用表达galc的载体或媒剂给药的犬都没有出现不良事件。施用raavhu68.cgalc的克拉伯犬表现出正常生长(图27)，并且基于csf脑脊液细胞增多(图28a)和组织病理学病变(图28b)的不存在，在六个月时没有观察到毒性。由于克拉伯病进展(包含后肢严重瘫痪、尿失禁、头摇和不能走动的共济失调)，必须在第8周和第12周对媒剂处理的犬实施安乐死。在注射后45周以上，所有经载体处理的犬都显得愉悦、警觉且无症状，并且全部都经过克拉伯犬的最长预期寿命。
[0283]
下表6中呈现了研究进度表和端点。
[0284]
[0285][0286]
实例5-非人灵长类动物的毒理学研究
[0287]
毒理学研究使用与小鼠med研究中使用的相同的raavhu68.hgalc载体批次进行，并且在nhp中进行，因为所述nhp更好地复制人类的尺寸和cns解剖结构，并且可以使用临床roa(icm)进行处理。预计尺寸、解剖结构和roa的类似性产生代表性载体分布和转导曲线，这允许比小鼠或犬更准确地评估毒性。另外，与啮齿动物或犬类模型相比，在nhp中进行更严格的神经系统评估，从而允许更敏感地检测cns毒性。
[0288]
icm载体施用导致csf隔室内的立即载体分布。可以通过脑质量来缩放剂量，所述脑质量提供了csf隔室的大小的近似值。剂量转换基于新生小鼠的0.15g脑质量(gu z等人,(2012)《公共科学图书馆期刊(plos one)》,7(7):e41542.)、青少年-成年小鼠的0.4g脑质量(gu z.等人,(2012)《公共科学图书馆期刊》,7(7):e41542.)、青少年和成年恒河猴的90g脑质量(herndon j.g.等人,(1998)《衰老神经生物学(neurobiol aging.)》,19(3):267-72)、犬的60g脑质量、4-12月龄婴儿的800g脑质量以及成年人的1300g脑质量(dekaban a.s.,(1978)《神经病学年鉴(ann neurol.)》,4(4):345-56)。表7中示出了nhp毒理学研究的剂量、鼠类med研究的剂量和等效人剂量。
[0289]
表7.鼠类med研究、nhp毒理学研究的载体剂量和等效的犬和人剂量：
[0290][0291]
缩略语：gc，基因组拷贝；med，最低有效剂量；nhp，非人灵长类动物。
[0292]
根据疾病目标选择青少年恒河猴，以便在解剖学上与所提议的1/2期研究群体相似。nhp毒理学研究的剂量反映了1/2期临床研究中使用的剂量，并且考虑到以下进行选择：1)来自药理学研究的结果；以及2)在考虑最大可行剂量的情况下，将药理学研究的剂量转化到nhp和人类。
[0293]
相应地，在成年恒河猴中进行180天符合glp的安全性研究，以研究icm施用后raavhu68.cb7.ci.cgalcco.rbg(raavhu68.hgalc)的毒理学。选择180天的评估期，因为这给予分泌的转基因产物足以在施用icm aav后达到稳定的平台水平的时间。表8和表9中概
述了研究设计。青少年恒河猴(大约1.5岁)接受总计4.50
×
10
12
gc或总计1.50
×
10
13
gc(或媒剂)。当按脑质量(假设小鼠为0.4g，恒河猴为90g)缩放时，选择的剂量水平与在med研究中评估的剂量水平相当。高剂量相当于在克拉伯犬模型中评估的剂量(假设脑重为60g)。执行基线神经检查、临床病理学(具有差异的细胞计数、临床化学和凝血板)、csf化学和csf细胞学。在载体(或媒剂)施用后，每日监测动物的不适和异常行为迹象。
[0294]
在载体或媒剂施用后30天，每周一次进行血液和csf临床病理学评估以及神经检查，并且此后每30天进行一次。在基线和此后的每个30天时间点，通过干扰素γ(ifn-γ)酶联免疫斑点(elispot)测定评估抗aavhu68 nab和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)对aavhu68和galc产物的应答。
[0295]
raavhu68.hgalc或媒剂施用之后90天或180天，对动物实施安乐死，并且采集组织以进行全面的显微镜组织病理学检查。组织病理学检查的重点是cns组织(脑、脊髓和背根神经节)和肝，因为其是icm施用raavhu68载体之后转导最多的组织。另外，在尸检时，从全身性循环(ecd)、脾和引流cns的淋巴结中采集淋巴细胞以评估在这些器官中对衣壳和转基因产物两者均具有反应性的t细胞的存在。采集组织并存档，以防任何发现需要对载体生物分布进行进一步分析。
[0296]
表8.恒河猴glp毒理学研究(组名称)
[0297][0298]
缩略语：f，雌性；glp，良好实验室规范；icm，小脑延髓池内；m，雄性；na，不适用。roa，施用途径。
[0299]
表9.恒河猴研究进度表
[0300]
[0301]
[0302]
[0303][0304]a被评估动物的数量
[0305]b包含全血计数和差异(血液学)、临床化学和凝血板
[0306]c包含临床病理学和生物标志物缩略语：nab，中性抗体；pbmc，外周血单核细胞；csf，脑脊液；clin path，临床病理学；pk，药物代谢动力学的
[0307]
实例6-使用raavhu68.hgalc治疗克拉伯病
[0308]
fih试验是在患有由galc基因中的纯合或复合杂合突变引起的婴儿型克拉伯病的小儿患者中单次icm施用raavhu68.hgalc的1/2期剂量递增研究。这种fih试验纳入并治疗至少12名受试者，所述受试者被随访2年，其中根据“fda行业指南：施用人类基因疗法产品后的长期随访(fda guidance for industry:long term follow-up after administration of human gene therapy products)”草案中描述的针对腺病毒载体的推荐长期随访(ltfu)在给药之后继续总共5年的ltfu(2018年7月)。主要目的是评估raavhu68.hgalc的安全性和耐受性。本研究的次要目的是评估raavhu68.hgalc对疾病相关评估(包含存活期、适龄神经认知测量和适龄运动和/或语言评估)的影响。这些端点是在与疾病专家和临床医生协商后选择的，并基于对患有婴儿克拉伯病的未经治疗的患者的疾病演变的观察。
[0309]
任选地，可以评价hsct和aav基因疗法的组合疗法。
[0310]
fih是raavhu68.hgalc的开放标签、多中心、剂量递增研究，以评价患有婴儿型克拉伯病的小儿受试者的安全性、耐受性和探究性功效端点。在向受试者交错、顺序给药的情况下，剂量递增阶段评估了单次icm施用两个剂量水平的raavhu68.hgalc的安全性和耐受性。raavhu68.hgalc剂量水平是基于来自glp nhp毒理学研究和鼠类(med)研究的数据确定的，并且由低剂量g(施用于队列1)和高剂量(施用于队列2)组成。预计两个剂量水平都赋予治疗益处，但要理解的是，如果耐受的话，预期更高剂量是有利的。低剂量之后是高剂量的
这种顺序评估使得能够鉴定被测剂量的最大耐受剂量(mtd)。最终，扩展队列(队列3)接受了mtd的raavhu68.hgalc(图16)。施用载体之后(治疗后1周内)快速galc酶产生提供了延长的治疗窗。
[0311]
由于婴儿克拉伯病的特点是一旦出现症状病程就发展迅速，并且考虑到一些新生儿在出生时就出现疾病迹象，因此所提议的研究设计允许基于研究者对所述受试者的收益-风险评估在向队列1(低剂量)和队列2(高剂量)中的第一位患者给药后30天同时纳入受试者。这样做的基本原理是，由于患者经历疾病进展而错过治疗窗的风险将超过在对下一位患者给药之前延长安全性随访的潜在益处。患者在几周内经历实质性疾病进展的此类场景被认为可能是导致在纽约通过nbs鉴定的eikd患者中观察到的不良移植结果的原因(wasserstein m.p.等人,(2016)《遗传学与医学》18(12):1235-1243)，从而强调了患者迅速转诊治疗的需要。
[0312]
独立的安全委员会对队列之间和第二队列的完全纳入后的所有累积安全性数据进行安全审查，以提出关于进一步进行试验的建议。安全委员会还会在观察到安全审查触发(srt)的任何时间进行审查。每个队列中的第一受试者与第二受试者之间的1个月给药间隔允许评估指示急性免疫反应、免疫原性或其它剂量限制性毒性的ae以及与继发于发生在非临床研究中的2到4周内的dgr转导的感觉神经病理学发展的预期时间进程一致地呈现自身的任何感觉神经病变的临床审查。
[0313]
另外的受试者被纳入到接受mtd的扩展队列。这些另外的受试者的纳入不需要受试者之间的4周观察窗(图16)。任选地，这种队列接受hsct和raavhu68.hgalc的组合治疗。
[0314]
所有经治疗的受试者被随访2年，以评估安全简况并表征raavhu68.hgalc的药效学和功效性质。在研究的ltfu时间段期间对受试者随访另外3年(给药后总共5年)以评估长期临床结果，这符合草案“fda行业指南：施用人类基因疗法产品后的长期随访”(2018年7月)。
[0315]
表10.首次人临床试验方案概要
[0316]
[0317]
[0318][0319]
[0320]
统计方法
[0321]
没有计划对安全性评价进行统计学比较；所有结果仅是描绘性的。列出数据并产生汇总表。
[0322]
对次级端点和探究性端点执行统计学比较。将每个时间点的测量结果与每个受试者的基线值进行比较，并且将来自年龄匹配的健康对照的数据与来自具有相当队列特性的克拉伯病患者的自然历史数据进行比较，其中每个端点都可用。
[0323]
所有数据均呈现在受试者数据列表中。分类变量使用频率和百分比进行汇总，并且连续变量使用描述性统计(非缺失性观察、平均值、sd、中值、最小值和最大值的数量)进行汇总。图形显示以适当形式呈现。
[0324]
群体原理
[0325]
研究群体-小儿患者
[0326]
fih集中于9月龄前症状发作的婴儿受试者，所述受试者代表由于hsct不适合这些患者而具有最高未满足需求的患者。此外，这些患者的病程非常具有破坏性，具有在运动和认知障碍两者的表现方面同质的快速且高度可预测的衰退(bascou n.等人,(2018)《罕见病杂志》13(1):126)。事实上，在9月龄之前呈现出症状的患者的病程类似于早期婴儿克拉伯病，伴有快速且严重的认知和运动障碍进展，并且在出现疾病的初始体征和症状后无法获得任何功能性技能。预计这些患者中的大多数会在生命的最初几年内死亡(2年存活率范围为26-50％(duffner p.k.等人,(2011)《小儿科神经学(pediatr neurol.)》,45(3):141-8；beltran-quintero m.l.等人,(2019)《罕见病杂志》14(1):46)。在9月龄与12月龄之间发作的婴儿的表型更可变，其中有些表现出严重的早期婴儿克拉伯病表型，而另一些则表现出具有(接近)正常认知和明显更好的适应性和精细运动技能的较不严重的疾病表现，这使得难以预测在9月龄与12月龄之间发作的新诊断患者的表型(bascou n.等人,(2018)《罕见病杂志》13(1):126)。因此，所述群体仅限于《9月龄时症状发作的受试者，所述受试者的可预测且快速衰退支持在合理的随访期内进行稳健的研究设计和功能结果评价。对于这个组，期望治疗稳定疾病进展并防止技能丧失，如获得性发育和运动里程碑、延长存活期、延缓或预防癫痫的发展。
[0327]
尽管有共同的潜在病理生理学，但成人克拉伯表型和病程明显比破坏性婴儿克拉伯病更温和，因此成人疾病稳定的证明不能提供相信婴儿克拉伯病的疗法的理由。重要的是，成人克拉伯病的发作高度可变，并且进展较慢且更可变，在数年到数十年间出现衰退(jardim l.b.等人,(1999)《神经病学档案(arch neurol.)》56(8):1014-7；debs r.等人,(2013)《遗传性代谢病杂志(j inherit metab dis.)》36(5):859-68)。设计可以在拖延的自然病程的背景下明确证明研究性疗法的功效的临床试验将是非常具有挑战性的。hsct提供能够稳定或甚至改善疾病表现的治疗选项的事实是另一个重要的考虑因素(sharp m.e.等人,(2013)《遗传性代谢病杂志报道(jimd rep.)》10:57-9；laule c.等人,(2018)《神经成像杂志(journal of neuroimaging)》,28(3):252-255)。最终，nbs在美国没有被广泛采用，并且在欧洲也不可用，并且模糊不清的、非特异性的临床表现意味着成人克拉伯病仍然未被诊断出来，并且因此接近此类患者还是极其罕见的(wasserstein m.p等人,(2016)《遗传学与医学》18(12):1235-1243)。
[0328]
研究群体-排除患有严重疾病的受试者
[0329]
考虑到克拉伯病伴随有cns损伤的性质被认为在很大程度上是不可逆的，而且在婴儿群体中疾病进展非常迅速，预计raavhu68.hgalc将在无疾病或患有轻度到中度疾病的患者中赋予最大益处潜能，所述患者没有表现出仅与疾病晚期阶段相关的体征，包括耳聋、失明、伴随有原始反射丧失的严重虚弱(escolar m.l.等人,(2006)《儿科学(pediatrics)》.118(3):e879-89)。另外，与具有中度体征和症状的患者相比，在非常晚期的疾病中，异常瞳孔反射、不平稳的眼球运动或视觉追踪困难更常见，并且通常不会在疾病早期阶段观察到(escolar m.l.等人,(2006)《儿科学》.118(3):e879-89)。因此，这些体征中的多于一种体征的证据被认为是晚期疾病的指标并导致从试验中排除。由于重度残疾，这些患者将不太可能从疗法中获得实质性益处，在低水平的临床功能下超出疾病稳定被排除在外，益处/风险特性将是不利的，并且所述患者将对将排除raavhu68.hgalc功效评价的各种临床和仪器评估表现出地板效应。由于疾病后遗症的晚期状态，因此这一群体也可能对非治疗相关安全性问题呈现出更高风险，并且被排除在此试验之外。
[0330]
患有临床癫痫的患者不排除在试验之外，除非研究者认为儿童具有晚期疾病的其它体征并且将不太可能从治疗中受益。这是因为1)癫痫并非与晚期疾病唯一相关，2)癫痫是试验的端点，并且排除患有癫痫的患者可能会使研究偏向于不太容易发生癫痫的群体。
[0331]
研究群体-包含症状发生前受试者
[0332]
症状发生前婴儿克拉伯病患者被排除在研究的剂量递增部分(队列1和队列2)之外，其中只评估raavhu68.hgalc。对于这些患者，至少在美国，hsct被认为是治疗选项和精选治疗，即使其仅用于延缓疾病进展。普遍的美国kol意见是，在这一群体中测试未经证实的研究性疗法将被认为是不道德的，因为极窄的治疗窗将有效地剥夺患者获得至少提供部分益处所示的治疗(即，如果基因疗法证明不成功，则不太可能有时间用hsct来“挽救”)。因此，raavhu68.hgalc应保留给最明确未满足需求的患者(即有体征和症状但不适合进行hsct的婴儿克拉伯病患者)。
[0333]
本临床前研究证实了基因治疗和组合的hsct的功效优于单独使用任何一种方法，因此hsct和raavhu68.hgalc的组合疗法在fih研究中被评估为扩展队列(队列3)。符合本文件中概述的标准的有症状患者和症状发生前患者两者都符合纳入资格，因为这个队列评价了raavhu68.hgalc在hsct的背景下的安全性和功效，并且只有在临床前数据提供相信经改善的功效优于单独的hsct的理由才会继续。
[0334]
研究群体-降低年龄限制的理由
[0335]
考虑到症状发作可能在临产期或甚至在子宫内发生，治疗应尽快发生，以使潜在益处最大化。因此，研究的最小年龄被选为给药时1月龄，因为当前的共识指南推荐在合格患者中在1月龄之前进行hsct(kwon j.m.等人,(2018)《罕见病杂志》13(1):30)。要求受试者年满1个月或以上允许受试者和家人在其有资格参加此试验之前考虑其它形式的标准护理治疗。
[0336]
选择年龄下限的另一个考虑因素是确保治疗，并且icm手术特别可以在此类年轻患者中安全地进行。在宾夕法尼亚大学的介入放射学专家仔细审查1或2周龄大婴儿的成像扫描后证实，只要治疗的基本原理得到支持，对1-月-龄的婴儿进行ct引导的icm施用没有特定的解剖学问题。
[0337]
端点
[0338]
除了测量安全性和耐受性作为主要端点外，基于当前文献并且与专注于研究克拉伯病的主要临床医生协商来选择此研究的次级和探究性药效学和功效端点。预计这些终点将在此群体中表现出有意义的功能和临床结果。在30天、90天和6个月时测量端点，并且然后在2年短期随访时间段期间每6个月测量一次，除了需要镇静和/或腰椎穿刺之外，如图18a-18c所呈现的。在长期扩展期期间，测量频率降低为每12个月一次。选择这些时间点以促进全面评估raavhu68.hgalc的安全性和耐受性。考虑到未经治疗的婴儿克拉伯患者的疾病进展速率快，还选择了早期时间点和6个每月间隔。这允许在随访期内对经治疗的受试者进行全面的药效学和临床功效评估，因为在所述随访期存在未经治疗的对比者数据。在raavhu68.hgalc施用后，根据草案“fda行业指南：施用人类基因疗法产品后的长期随访”(2018年7月)，将继续监测受试者的安全性和功效持续总共5年。
[0339]
疾病进展和临床结果
[0340]
考虑到婴儿群体的快速且均匀的疾病进展速率(duffner p.k.等人,(2011)《小儿科神经学》,45(3):141-8；bascou n.等人,(2018)《罕见病杂志》13(1):126)，主要结果评估的2年随访被认为足以评估raavhu68.hgalc随时间推移的影响。另外，治疗后5年的ltfu对于评估长期结果以及治疗在类似或优于在hsct之后症状发生前患者中观察到的结果的功能水平下延长存活期和稳定患者中是否有效方面是非常实用的。
[0341]
raavhu68.hgalc的施用稳定了如通过存活率测量的疾病进展，从而预防可能支持癫痫的新里程碑、发作和频率的采集的发展性和运动里程碑的丧失。对于大多数被诊断患有早期婴儿克拉伯病的患者，死亡通常发生在生命的前3年，其中并入在7-12个月症状发作的患者的晚期婴儿群体的中值死亡率延长到5年(duffner p.k.等人,(2012)《小儿科神经学》,46(5):298-306)。通过将纳入标准限制在9个月或之前发作的患者，群体具有更严重的早期婴儿样表型和病程(bascou n.等人,(2018)《罕见病杂志》13(1):126)。考虑到在未经治疗的婴儿克拉伯病中看到快速衰退，使用raavhu68.hgalc进行治疗在随访时间段期间延长了预期寿命。运动里程碑发展取决于受试者纳入时的年龄和疾病阶段(bascou n.等人,(2018)《罕见病杂志》13(1):126；beltran-quintero m.l.等人,(2019)《罕见病杂志》14(1):46)。考虑到靶群体中疾病的严重程度，受试者可能已经通过纳入掌握了运动技能，并且进行发展并随后丧失了其它运动里程碑，或者尚未示出运动里程碑发展的迹象。因此，评估跟踪达到所有运动里程碑的年龄以及丧失所有运动里程碑的年龄。基于表11中概述的世界卫生组织(who)标准，为六个粗大里程碑定义了运动里程碑成就。
[0342]
表11.粗大运动里程碑的who执行标准
[0343]
[0344][0345]
改编自(wijnhoven t.m.等人,(2004)《食物营养公报(food nutr bull)》。25(增刊1):s37-45)。缩略语：who，世界卫生组织。
[0346]
考虑到患有婴儿克拉伯病的受试者可能在生命的第一周或第一月内发展出症状，并且第一who运动里程碑的采集(无支撑下坐直)在4月龄之前通常不表现出来(中值：5.9月龄)，这个端点可能缺乏对评价治疗益处(特别是针对在治疗时具有更多明显症状的受试者)的程度的敏感性。出于这个原因，还包含了可以应用于婴儿的适龄发育性里程碑的评估(sharp m.e.等人,(2013)《遗传性代谢病杂志报道》10:57-9)。一个缺点是已公开的工具旨在供临床医生和父母使用，并且在典型的里程碑获取年龄附近组织技能，而没有参考正常范围。然而，相对于未经治疗的患有婴儿克拉伯病的儿童或神经型儿童的典型获取时间，数据对于总结随时间推移保持、获取或丧失发育性里程碑可以是信息性的。
[0347]
虽然癫痫不是婴儿群体的主要症状，但大约30-60％的婴儿患者将最终在疾病的后期出现癫痫(duffner p.k.等人,(2011)《小儿科神经学》,45(3):141-8)。癫痫活动的延缓发作使得能够确定用raavhu68.hgalc进行治疗是否可以预防或延缓这一群体的癫痫发作或降低癫痫事件的频率。要求父母保存癫痫日志，所述癫痫日志跟踪癫痫的发作、频率、长度和类型。这些条目将在每次访问时由临床医生讨论并解释。
[0348]
作为探究性措施，临床量表用于定量raavhu68.hgalc对适应性行为、认知、语言、运动功能和健康相关生活质量的发展和变化的影响。所提出的每项措施都已在克拉伯群体或相关群体中使用。
[0349]
以下简要描述了量表和相关领域：
[0350]
·
贝利婴幼儿发展量表(第三版)：评估婴幼儿在以下五个领域的发展：认知、语言、运动、社会情感和适应性行为。所有领域都在试验中进行评估。
[0351]
·
文兰适应行为量表(第三版)：跨五个域评估从出生到成年(0-90岁)的适应性行为：交流、日常生活技能、社交、运动技能和适应不良行为。从v2到v3的改进并入一些问题，以使人们更好地理解发育性残疾。
[0352]
·
皮博迪发育运动量表-第二版：测量从出生到五岁儿童的相关运动功能。评估集中在以下六个领域：反射、静止、运动、物体操纵、抱握和视觉-运动整合
[0353]
·
婴幼儿生活质量问卷(itqol)：为2月龄婴儿到5岁幼儿设计的健康相关生活质量的家长报告量度。
[0354]
·
马伦早期学习量表：评估最大68月龄的婴幼儿的语言、运动和感知能力。
[0355]
疾病生物标志物
[0356]
为了评估raavhu68.hgalc对疾病病理的影响，测量了髓鞘形成的变化、与髓鞘形成相关的功能结果以及潜在的疾病生物标志物。作为疾病的主要标志，在施用raavhu68.hgalc的情况下，中枢和外周脱髓鞘减慢或停止进展。通过白质区域的弥散张量磁共振成像(dt-mri)各向异性测量和皮质脊髓运动束的纤维跟踪来跟踪中枢脱髓鞘，其中的变化是疾病状态和进展的指标(mcgraw p.等人,(2005)《放射学(radiology)》,236(1):
221-30；escolar m.l.等人,(2009)《美国神经放射学杂志(ajnr am jneuroradiol)》,30(5):1017-21)。通过对运动神经(腓深神经、胫骨神经和尺骨神经)和感觉神经(腓肠神经和正中神经)的神经传导速度(ncv)研究来间接测量外周脱髓鞘，以监测指示生物活性髓鞘变化的波动(即f波和末端潜伏期、振幅或应答的存在或不存在)。
[0357]
视力损害的发展在早期婴儿克拉伯中很常见，其中根据一项研究，61.2％的群体在疾病的某个时间点出现视力丧失(duffner p.k.等人,(2011)《小儿科神经学》,45(3):141-8)。与癫痫类似，视力丧失不是常见的表现症状。这提供了评估raavhu68.hgalc延缓或预防治疗前未发生显著视力丧失的受试者的视力丧失的能力的机会。因此，视觉诱发电位(vep)的测量用于客观地测量对视觉刺激的应答作为中枢视力损害或丧失的指标。听力损失在疾病进展期间也很常见，并且通过脑干听觉诱发应答(baer)测试测量听觉异常的早期迹象。
[0358]
galc负责水解鞘氨醇半乳糖苷。克拉伯病中galc的缺陷导致鞘氨醇半乳糖苷在中枢和外周累积。已提议将鞘氨醇半乳糖苷水平升高作为克拉伯病的指标(escolar m.l.等人,(2017)《分子遗传学与新陈代谢》,121(3):271-278)。虽然有证据支持其用于检测早期和严重婴儿克拉伯病例，但在治疗后可能难以解释鞘氨醇半乳糖苷水平随时间推移的波动，因为鞘氨醇半乳糖苷水平在晚期疾病中也可能减退。因此，仅鞘氨醇半乳糖苷水平减退的证据不足以证明治疗效果，除非其伴随着临床疾病的稳定。
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(序列表自由文本)
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本说明书中引用的所有文件通过引用并入本文中，随本文一起提交的序列和序列表文本(文件名“18-8584pct_st25.txt”)也通过引用并入本文中。于2019年2月26日提交的美国临时专利申请第62/810,708号、于2019年3月12日提交的美国临时专利申请第62/817,482号、于2019年7月23日提交的美国临时专利申请第62/877,707号以及于2019年10月17日提交的美国临时专利申请第62/916,652号与其序列表一起以全文引用的方式并入。尽管已经参考特定实施例描述了本发明，但是应当理解的是，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。