0.015％，余量为去离子水。
11.进一步地，所述玻璃试管内保存液的ph为7.2。
12.进一步地，在100ml容器中依次加入抑制剂i、抑制剂ii、edta-k3、柠檬酸、咪唑，加入适量的去离子水，搅拌待其完全溶解后，用去离子水定容到100ml的体积，测定溶液的ph值，过滤后即得保存液，然后每管玻璃试管加入250ul保存液即得保存管。
13.进一步地，所述游离dna样本为血循环稀有细胞，特别是循环肿瘤细胞(ctc)、循环胎儿细胞(cfc)和循环干细胞(csc)。
14.应用领域有：
15.1、无创产筛nipt(non-invasive prenatal testing)
16.稳定血液标本中母体和胎儿游离dna，广泛应用于21、18、23号染色体异常，性染色体异常，其它染色体数目及结构异常，双胎nipt，无创单基因遗传病，孕妇孕期肿瘤检查等。
17.2、循环肿瘤dna(circulating tumor dna,ct dna)
18.稳定血液标本中ct dna，广泛应用于肺癌、结肠癌，乳腺癌，黑色素瘤、脑胶质瘤检查等。
19.3、其它：器官移植游离dna检测。
20.本发明是与现有技术相比，有益效果包括：
21.1、本发明可有效保护血循环稀有细胞，确保细胞富集过程稳定。为准确测dna和rna提供保障。
22.2、本发明使用的配方可有效保鲜血液样本，保存有效期及保存温度条件比市场上已有技术提高一个级别。
23.3、本发明使用的配方能有效抑制血浆中核酸降解酶，有效避免因核酸酶降解dna和rna而造成全血白细胞不稳定，离体后容易凋亡释放dna。
附图说明
24.图1为本发明所实现的sample
ⅰ‑
day1保存的波形图。
25.图2为对照组sample
ⅰ‑
day1-streck保存的波形图。
26.图3为本发明所实现的sample
ⅰ‑
day5保存的波形图。
27.图4为对照组sample
ⅰ‑
day5-streck保存的波形图。
28.图5为本发明所实现的sample
ⅱ‑
day5保存的波形图。
29.图6为对照组sample
ⅱ‑
day5-streck保存的波形图。
30.图7为本发明所实现的sample
ⅱ‑
day5保存的波形图。
31.图8为对照组sample
ⅱ‑
day5-streck保存的波形图。
32.图9为本发明所实现dna浓度比较示意图。
33.图10为本发明所实现文库浓度比较示意图。
34.图11为本发明所实现测序gc％比较比较示意图。
35.图12为本发明所实现chr13染色体reads密度分布图。
36.图13为本发明所实现chr18染色体reads密度分布图。
37.图14为本发明所实现chr21染色体reads密度分布图。
38.图15为本发明所实现dna保存1天后的白细胞形态对比图。
39.图16为streck保存1天后的白细胞形态对比图。
40.图17为对照组1保存1天后白细胞形态对比图。
41.图18为对照组2保存1天后白细胞形态对比图。
42.图19为对照组3保存1天后白细胞形态对比图。
43.图20为本发明所实现dna保存3天后的白细胞形态对比图。
44.图21为streck保存3天后的白细胞形态对比图。
45.图22为对照组1保存3天后白细胞形态对比图。
46.图23为对照组2保存3天后白细胞形态对比图。
47.图24为对照组3保存3天后白细胞形态对比图。
48.图25为本发明所实现dna保存5天后的白细胞形态对比图。
49.图26为streck保存5天后的白细胞形态对比图。
50.图27为对照组1保存5天后白细胞形态对比图。
51.图28为对照组2保存5天后白细胞形态对比图。
52.图29为对照组3保存5天后白细胞形态对比图。
53.图30为本发明所实现dna保存7天后的白细胞形态对比图。
54.图31为streck保存7天后的白细胞形态对比图。
55.图32为对照组1保存7天后白细胞形态对比图。
56.图33为对照组2保存7天后白细胞形态对比图。
57.图34为对照组3保存7天后白细胞形态对比图。
58.图35为本发明dna保存管管与其他管白细胞计数示意图。
59.图36为本发明dna保存管管与其他管中性粒细胞计数示意图。
60.图37为本发明dna保存管管与其他管淋巴细胞计数示意图。
61.图38为本发明dna保存管管与其他管单核细胞计数示意图。
62.图39为本发明dna保存管管与其他管嗜碱性细胞计数示意图。
63.图40为本发明dna保存管管内5组血液样本中性粒细胞计数对比图。
64.图41为本发明dna保存管管内5组血液样本淋巴细胞计数对比图。
65.图42为本发明dna保存管管内5组血液样本单核细胞计数对比图。
66.图43为本发明dna保存管管内5组血液样本嗜酸性粒细胞计数对比图。
67.图44为本发明dna保存管管内5组血液样本嗜碱性粒细胞计数对比图。
具体实施方式
68.为了更清楚地表述本发明，下面结合附图对本发明的具体实现作进一步地描述。
69.本发明所实现的用于游离dna保存方法，通过玻璃试管保存有保存液，通过所述保存液来保存游离dna样本，所述制剂包括：抑制剂1.25～2.5％、edta-k3 0.03～0.08％、柠檬酸0.01～0.04％、咪唑0.008-0.015％，余量为去离子水。
70.所述玻璃试管内保存液的ph为7.2。
71.具体地说，在100ml烧杯中依次加入抑制剂i、抑制剂ii、edta-k3、柠檬酸、咪唑，加入适量的去离子水，搅拌待其完全溶解后，用去离子水定容到100ml的体积，测定溶液的ph值，过滤后即得保存液，然后每管子加入250ul保存液即得保存管。
72.所述游离dna样本为血循环稀有细胞，特别是循环肿瘤细胞(ctc)、循环胎儿细胞(cfc)和循环干细胞(csc)。
73.实施例1.
74.在100ml烧杯中依次加入抑制剂i、抑制剂1.25％、edta-k3 0.03％、柠檬酸0.01％、咪唑0.008％，加入适量的去离子水，搅拌待其完全溶解后，用去离子水定容到100ml的体积，测定溶液的ph值，过滤后即得保存液，然后每管子加入250ul保存液即得保存管。
75.用上述保存管保存游离dna，特别是循环肿瘤细胞(ctc)、循环胎儿细胞(cfc)和循环干细胞(csc)，能够在常温下有效保存被测样本7-14天。
76.实施例2.
77.在100ml烧杯中依次加入抑制剂i、抑制剂2.5％、edta-k3 0.08％、柠檬酸0.04％、咪唑0.015％，加入适量的去离子水，搅拌待其完全溶解后，用去离子水定容到100ml的体积，测定溶液的ph值，过滤后即得保存液，然后每管子加入250ul保存液即得保存管。
78.用上述保存管保存游离dna，特别是循环肿瘤细胞(ctc)、循环胎儿细胞(cfc)和循环干细胞(csc)，能够在常温下有效保存被测样本7-14天。
79.实施例3.
80.在100ml烧杯中依次加入抑制剂i、抑制剂2.0％、edta-k3 0.05％、柠檬酸0.02％、咪唑0.011％，加入适量的去离子水，搅拌待其完全溶解后，用去离子水定容到100ml的体积，测定溶液的ph值，过滤后即得保存液，然后每管子加入250ul保存液即得保存管。
81.用上述保存管保存游离dna，特别是循环肿瘤细胞(ctc)、循环胎儿细胞(cfc)和循环干细胞(csc)，能够在常温下有效保存被测样本7-14天。
82.实施例4.
83.在100ml烧杯中依次加入抑制剂i、抑制剂1.55％、edta-k3 0.04％、柠檬酸0.02％、咪唑0.009％，加入适量的去离子水，搅拌待其完全溶解后，用去离子水定容到100ml的体积，测定溶液的ph值，过滤后即得保存液，然后每管子加入250ul保存液即得保存管。
84.用上述保存管保存游离dna，特别是循环肿瘤细胞(ctc)、循环胎儿细胞(cfc)和循环干细胞(csc)，能够在常温下有效保存被测样本7-14天。
85.实施例5.
86.在100ml烧杯中依次加入抑制剂i、抑制剂1.85～2.5％、edta-k3 0.06％、柠檬酸0.03％、咪唑0.012％，加入适量的去离子水，搅拌待其完全溶解后，用去离子水定容到100ml的体积，测定溶液的ph值，过滤后即得保存液，然后每管子加入250ul保存液即得保存管。
87.用上述保存管保存游离dna，特别是循环肿瘤细胞(ctc)、循环胎儿细胞(cfc)和循环干细胞(csc)，能够在常温下有效保存被测样本7-14天。
88.实施例6.
89.在100ml烧杯中依次加入抑制剂i、抑制剂2.25％、edta-k3 0.07％、柠檬酸0.03％、咪唑0.013％，加入适量的去离子水，搅拌待其完全溶解后，用去离子水定容到100ml的体积，测定溶液的ph值，过滤后即得保存液，然后每管子加入250ul保存液即得保存
管。
90.用上述保存管保存游离dna，特别是循环肿瘤细胞(ctc)、循环胎儿细胞(cfc)和循环干细胞(csc)，能够在常温下有效保存被测样本7-14天。
91.游离dna保存管保存效果证明如下：
92.保证母血细胞(特别是白细胞)不破裂释放dna，避免稀释血浆胎儿dna成分。
93.血浆游离dna短片段不进一步降解。
94.常温下血液标本中游离dna和细胞有效稳定7-14天。
95.采用细胞代谢阻断技术抑制细胞代谢，防止细胞进入凋亡状态。
96.采用独特的离体细胞保存和活性维持技术。有效避免pcr抑制效应，保障可获得高产量和高质量dna。
97.对比方法及结论
98.样本dna的质量直接决定了建库水平，从根本上也决定了测序结果的可靠性。
99.本发明dna保存管与streck牌dna管新鲜样本与保存5天样本检查结果比较如下表所示：
[0100][0101]
其中，
[0102]ⅰ号血液样本存储1天及5天建库质量对比(本发明dna保存管对比streck管)如图1、图2、图3及图4所示。
[0103]ⅱ号血液样本存储1天及5天建库质量对比(本发明dna保存管对比streck管)如图5、图6、图7及图8所示。
[0104]
结论：
[0105]
1、建库后胎儿游离dna主要集中在260bp条带，在agilent2100的检测结果中应为一个主峰。经过长时间保存的合格血液样本，建库后260bp主峰应该变化不大，同时没有产生新杂峰。
[0106]
2、本发明dna保存管游离dna保鲜剂处理过的血液样本，符合上述要求。和streck管的对照实验结果表明，本发明dna保存管游离dna保鲜剂的保鲜效果跟streck管的保鲜效果很接近。
[0107]
dna浓度及文库浓度比较如下表及图9、10所示：
[0108][0109]
图中所示，左侧为本发明保存的结果，右侧为现有streck保存的结果。
[0110]
保存5天的血液样本建库质量对比。各样本均符合建库质量要求并成功建库。
ⅴ
号样本为经过长途运输样本，也一样可以高效建库。
[0111]
测序gc％比较如下表及图11所示：结果非常接近，且符合生物学理论值。
[0112]
样本gc含量sample
ⅲ‑
本发明dna保存管0.409sample
ⅲ‑
streck0.412sample
ⅳ‑
本发明dna保存管0.406sample
ⅳ‑
streck0.409sample
ⅴ‑
本发明dna保存管0.410sample
ⅴ‑
streck0.415
[0113]
对血液样本的过度保护，会使得在cf dna提取过程中发生胶黏作用，造成gc含量降低，影响测序随机性，对检测结果造成影响。事实证明，本发明dna保存管和streck的采血管测序gc含量水平基本一致。
[0114]
图12-图14所示，为chr13、18、21染色体reads密度分布图：各染色体密度均匀，随机性好。
[0115]
细胞形态学分析如下：
[0116]
检测方法：流式细胞技术与核酸染色法。
[0117]
检测设备：xe-2100全自动血液分析仪(其检测参数已获得美国fda认可)；
[0118]
检测参数：
[0119]
1、采用流式细胞技术和核酸染色法进行白细胞分类，不仅得到准确的白细胞五项分类结果，而且通过核酸染色(聚甲基染料)过的精确定量的幼稚粒细胞参数及各类半定量异常信息，使得结果更为可靠。
[0120]
2、该设备具有独立的wba/baso检测通道，通过专用的强溶血剂精确检测baso结果，同时获得的wbc总数，也可以有效排除难溶性红细胞、巨大血小板、血小板聚集及其他非细胞核颗粒对白细胞计数的干扰。
[0121]
检测意义：
[0122]
通过对有核细胞的精确计数，确定是否有有核细胞破裂或释放出dna，杜绝假阴性的存在。
[0123]
采集当天血液白细胞形态对比。
[0124]
1)、保存一天后白细胞形态对比：
[0125]
保存一天后各品牌保鲜管保存的样品的白细胞五项分类结果并无太大差异，5种白细胞形态可清晰分辨。其中，本发明dna保存的白细胞形态对比如图15所示，图16是
streck保存的对比图，图17-图19的对照组的对比图。
[0126]
2)、保存三天后白细胞形态对比：
[0127]
保存三天后，只有本发明dna保存管(图20)和对照2样本内血液各种白细胞形态仍然清晰可辨。其他品牌均存在不同程度的白细胞形态变化。如图20-24所示。
[0128]
3)、保存5天后白细胞形态对比：
[0129]
保存5天后，只有本发明dna保存管管内血液各白细胞形态可以分辨。其他品牌均已无法辨认白细胞形态，细胞形态已发生明显变化。如图25-29所示。
[0130]
4)、保存7天后白细胞形态对比：
[0131]
保存7天后，本发明dna保存管管内血液各白细胞形态仍能基本保存。其他品牌均已无法辨认白细胞形态。如图30-34所示。
[0132]
本发明dna保存管管与其他管白细胞计数变化如下表及图35所示：
[0133][0134]
从表中和图中可以看出，即使白细胞稳定性已经大大降低，白细胞的形态也已经完全无法区分，但白细胞的数量仍然保持相对稳定，所以光从白细胞计数不能完全体现储存管对白细胞破裂的抑制作用。
[0135]
本发明dna保存管与其他管中性粒细胞计数变化如下表及图36所示：
[0136][0137][0138]
本发明dna保存管管对中性粒细胞的保护作用至少持续了7天。
[0139]
本发明dna保存管管与其他管淋巴细胞计数对比如下表及图37所示：
[0140][0141]
血液储存7天后，本发明dna保存管管内血液中的淋巴细胞仍然保持稳定可辨的形态。
[0142]
本发明dna保存管管与其他管单核细胞计数对比如下表及图38所示：
[0143][0144]
在本次的对比试验中，单核细胞的稳定性最低。储存3天后，各储存管内单核细胞计数都有明显的下降，但本发明dna保存管管内血液单核细胞幅度稳定持平，保护效果非常出色。
[0145]
不同储存时间嗜酸性粒细胞计数变化如下表所示：
[0146][0147]
显然，本发明dna保存管管到第七天还能分辨出嗜酸性粒细胞。
[0148]
本发明dna保存管管与其他管嗜碱性细胞计数对比如下表及图39所示：
[0149][0150][0151]
部分白细胞核形态有变化，造成分类读数变化。
[0152]
本发明dna保存管管稳定性实验。
[0153]
实验目的：验证本发明dna保存管血细胞保存管保鲜效果的可重复性。
[0154]
实验内容：
[0155]
选取5个不同个体的人类血液样本，使用本发明dna保存管血细胞保存管常温采集并保存。分别在保存1天及5天进行细胞形态学分析。同时随机挑选2个样本(1号和3号样本)送往另一间实验室于采集后第9天后进行细胞形态学分析。本实验所用仪器均为xe-2000全血细胞分析仪。
[0156]
实验结果：本发明dna保存管血细胞保存管对所有5个样本均有出色的保鲜作用。
[0157]
本发明dna保存管管内5组血液样本中性粒细胞计数对比如下表及图40所示：
[0158][0159]
5个样本保存1天和5天中性粒细胞计数变化不大。保存9天的两个样本读数也没有变化。
[0160]
本发明dna保存管管内5组血液样本淋巴细胞计数对比如下表及图41所示：
[0161][0162]
所有样本保存5天后，淋巴细胞计数没有大变化。保存9天的两个样本结果也没有变化。
[0163]
本发明dna保存管管内5组血液样本单核细胞计数对比如下表及图42所示：
[0164][0165]
即使是所有白细胞中最不稳定的单核细胞，所有样本都基本保持稳定计数。
[0166]
本发明dna保存管管内5组血液样本嗜酸性粒细胞计数对比如下表及图43所示：
[0167][0168]
保存5天5个样本嗜酸性粒细胞计数都很稳定。
[0169]
保存9天的样本同样出色地通过了试验。
[0170]
本发明dna保存管管内5组血液样本嗜碱性粒细胞计数对比如下表及图44所示：
[0171][0172]
嗜碱性粒细胞数量稀少，仪器少量的错认也会造成计数误差比较大。
[0173]
实验结论：
[0174]
1、本发明dna保存管血细胞保存管可以在常温下保持白细胞形态完整5天以上，其他品牌保存管只能保存1-3天。
[0175]
2、本发明dna保存管管更适合用于长时间常温保存血液(如血液常温快递运输)。
[0176]
以上所述乃是本发明之具体实施例及所运用之技术原理，若依本发明之构想所作之改变，其所产生之功能作用仍未超出说明书及图式所涵盖之精神时，均应在本发明之范围内。