基于rt-raa荧光方法检测乙型脑炎病毒的试剂和试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于荧光方法rt-raa检测乙型脑炎病毒的试剂和试剂盒。
背景技术：
2.乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(japanese encephalitis virus，jev)引起的虫媒性的人畜均可感染的中枢神经系统的传染性疾病。该病往往会伴随出现一些神经系统表现的症状，比如高热、狂暴、精神沉郁或者严重昏迷等症状。jev的爆发，常常局限在一定的地理气候位置上的分布，同时也具有明显的气候周期性，多数发生于夏秋两个季节，这两季也是蚊类散播传染病频繁产生的季节，属于自然界的疫源性虫媒散播传染病。
3.当仔猪感染病毒后，往往很容易侵袭仔猪的脑部组织，从而出现一系列的神经系统的严重症状，甚至出现死亡的危险；母猪感染病毒后，在怀孕阶段，容易造成母猪流产、产生死胎；公猪感染乙型脑炎病毒后，可引起公猪的睾丸炎或不育，但致死率较母猪来说不高。实际上该病虽然死亡率较低，但其感染持续时间长，病毒危害范围大，容易造成严重的损失和威胁。
4.重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,raa)是近年新兴的一种核酸检测技术，该方法通过加入重组酶和结合蛋白，使得核酸扩增能在37-42℃条件下快速进行，一般在15-30min即可判定结果。raa已被广泛应用于病原体的快速检测，与rt-pcr和rt-lamp方法相比较，该方法检测时间更短，检测灵敏度与rt-qpcr和rt-lamp基本一致。
5.针对乙型脑炎的病原的检测可以使用rt-pcr、rt-qpcr、rt-lamp等方法进行检测，也有rt-rpa-lfd检测方法(梁辉.流行性乙型脑炎rt-rpa-lfd检测方法的建立与评价[d].华南农业大学,2016.)的报道。
技术实现要素：
[0006]
本发明所要解决的技术问题是如何快速检测乙型脑炎病毒或如何制备检测乙型脑炎病毒的rt-raa试剂盒。
[0007]
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了检测乙型脑炎病毒的试剂盒。所述试剂盒包括检测乙型脑炎病毒的组合物。所述组合物可包括引物jev-raa-f2、jev-raa-r1和探针。所述引物jev-raa-f2的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述jev-raa-r1的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。所述探针的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。
[0008]
上文所述试剂盒可为基于荧光rt-raa技术的试剂盒。
[0009]
上文所述试剂盒中，所述组合物还可含有rt荧光基础反应单元。所述rt荧光基础反应单元可包含单链dna结合蛋白、重组酶、逆转录酶和/或dna聚合酶。
[0010]
所述rt荧光基础反应单元可来源于荧光型rt-raa核酸扩增试剂盒。所述rt荧光基础反应单元可为冻干粉。
[0011]
上文所述试剂盒中，所述组合物还可含有镁离子缓冲液。所述镁离子缓冲液可为
和醋酸镁。
[0012]
上文所述试剂盒中，所述探针具可有下述任一修饰或其组合：
[0013]
a1)在所述探针的5’端起第31位碱基上标记荧光基团。
[0014]
a2)在所述探针的5’端33位碱基标记淬灭基团。
[0015]
a3)在所述探针的5’端的31位和32位碱基中间用四氢呋喃修饰。
[0016]
a4)在所述探针的3’末端碱基用c3-spacer标记。
[0017]
所述荧光基团可为6-羧基荧光素(i6fam)。所述四氢呋喃修饰基团可为dspacer(idsp)。所述淬灭基团可为ibhq1。
[0018]
为了解决上述技术问题，本发明还提供了检测乙型脑炎病毒的系统。所述系统可含有上文所述的试剂盒和/或组合物和荧光检测仪器。
[0019]
上文所述试剂盒可为基于荧光rt-raa技术的试剂盒。所述荧光检测仪器可为荧光定量pcr仪。
[0020]
上文所述的检测乙型脑炎病毒的组合物也属于本发明的保护范围。
[0021]
上文所述的组合物的各组分可为液体和/或固体粉末。
[0022]
上文所述的组合物在乙型脑炎病毒检测或辅助检测中的应用也属于本发明的保护范围。
[0023]
上文所述应用中，所述检测或辅助检测的rt-raa反应条件可为39℃恒温反应30min。
[0024]
上文所述的组合物在制备乙型脑炎病毒检测或辅助检测产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0025]
上文所述的乙型脑炎病毒可为猪乙型脑炎病毒。
[0026]
本发明实施例中建立了基于荧光rt-raa技术的检测乙型脑炎病毒试剂盒，该试剂盒只需39℃条件下反应30min就可以准确检测出待测样本中是否含有乙型脑炎病毒，且具有很高的灵敏性和特异性，最低检测极限为5.5
×
101copies/μl的jev阳性标准质粒转录本，可以应用于临床中乙型脑炎病毒的快速高效检测，具有良好的应用前景。
附图说明
[0027]
图1为引物筛选结果。1：f2/r1；2：f2/r3；3：f1/r3；4：f1/r2；5：f3/r1；6：f2/r1；7：f1/r3；8：f3/r2；9：f3/r3。横坐标为时间，纵坐标为荧光值。
[0028]
图2为rt-raa敏感性结果。1为阳性对照，2-7阳性标准质粒浓度分别为5.5
×
10
6-5.5
×
101copies/μl，具体为：2代表5.5
×
106copies/μl，3代表5.5
×
105copies/μl，4代表5.5
×
104copies/μl，5代表5.5
×
103copies/μl，6代表5.5
×
102copies/μl，7代表5.5
×
101copies/μl，8为阴性对照。横坐标为时间，纵坐标为荧光值。
[0029]
图3为rt-raa检测方法特异性结果1：jev；2：pedv；3：svv；4：tgev；5：getv；6：prrsv；7：阴性对照。横坐标为时间，纵坐标为荧光值。
[0030]
图4为临床样品rt-raa方法检测结果1：样品；2：阳性对照；3：阴性对照。横坐标为时间，纵坐标为荧光值。
具体实施方式
[0031]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0032]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]
本发明实施例中jev病毒毒株、临床样品和其他对照病毒的来源如下，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明，不可用作其他用途：
[0034]
乙型脑炎病毒jev-sc-1毒株保存于四川农业大学动物生物技术中心，相关文献：蔡雨函,周远成,朱玲,王赟,徐志文.3株猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定及增值特性[j].中国兽医学报,2014,34(06):915-922。
[0035]
临床样品是从四川省8个地区(成都、德阳、绵阳、巴中、南充、遂宁、眉山和乐山)的34个生猪养殖场采集的75份猪流产胎儿的样品。
[0036]
塞内卡病毒(svv)保存于四川农业大学动物生物技术中心，相关文献：peng kenan et al.isolation and phylogenomic analysis of two senecavirus a isolates in sichuan province,2018.[j].virus genes,2020.
[0037]
蓝耳病毒(prrsv)保存于四川农业大学动物生物技术中心，相关文献：zhao j,zhu l,huang j,yang z,xu l,gu s,huang y,zhang r,sun x,zhou y,xu z.genetic characterization of a novel recombined porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2 among nadc30-like,jxa1-like and tj-like strains.vet med sci.2021may；7(3):697-704.doi:10.1002/vms3.402.epub 2020 dec 5.pmid:33277984；pmcid:pmc8136965。
[0038]
盖塔病毒(getv)保存于四川农业大学动物生物技术中心，相关文献：江朝源,李飞,曾喻兵,彭珂楠,张儒博,杜佩珊,冯宇,殷鑫欢,朱玲,徐志文.四川省猪源盖塔病毒的分离鉴定及遗传进化分析[j].中国人兽共患病学报,2019,35(09):805-814。
[0039]
流行性腹泻病毒(pedv)保存于四川农业大学动物生物技术中心，相关文献：付梦瑾,朱玲,吴云飞,等.猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及增殖规律[j].中国兽医科学,2013,043(011):1133-1139。
[0040]
猪传染性胃肠炎病毒(tgev)保存于四川农业大学动物生物技术中心，相关文献：代洪波,陈蕾,朱玲,等.猪传染性胃肠炎病毒四川株的分离鉴定与一步生长曲线的测定[j].中国兽医科学,2012(12):18-23。
[0041]
实施例一、jev病毒质粒标准品的制备
[0042]
使用rna提取试剂盒提取乙型脑炎病毒jev-sc-1株的rna，对得到的rna进行反转录得到全长cdna。
[0043]
使用jev-f4和jev-r4引物(表1)对jev-sc-1株病毒cdna进行扩增，将扩增产物胶回收后与pmd 19-t simple vector进行连接，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞培养后提取质粒并测定浓度。对质粒进行pcr扩增(扩增引物为表1中的jev-f4和jev-r4)并将扩增产物进行测序鉴定，测序结果与genbank中登录的jev序列进行比较。测序结果显示为jev-sc-1
株的部分序列，将鉴定结果正确的质粒分装后于-80℃保存，得到jev病毒质粒标准品。
[0044]
实施例二、rt-raa检测jev病毒的反应体系和引物筛选
[0045]
1.引物和探针设计
[0046]
参照genbank所收录乙型脑炎病毒sa-14-14-2(genbank登录号：jn604986.1)毒株的e基因(序列表中序列1所示)设计1对rt-pcr引物、3对rt-raa引物和一条rt-raa探针jev-raa-p(表1)。
[0047]
表1：引物和探针序列
[0048][0049][0050]
注：jev-raa-p引物5’端起第31位核苷酸t上标记荧光基团6-羧基荧光素(i6famdt)、距5’端33位核苷酸t标记荧光淬灭基团bhq1(ibhq1dt)，第31位核苷酸t和32位核苷酸g中间用四氢呋喃(thf)dspacer修饰(序列4中idsp所示)，3’末端核苷酸用c3-spacer修饰。y为简并碱基，代表c或t。
[0051]
2.rt-raa反应体系
[0052]
将三条正向引物和三条反向引物进行组合，使用组合的9对引物(jev-raa-f1/jev-raa-r1、jev-raa-f1/jev-raa-r2、jev-raa-f1/jev-raa-r3、jev-raa-f2/jev-raa-r1、jev-raa-f2/jev-raa-r2、jev-raa-f2/jev-raa-r3、jev-raa-f3/jev-raa-r1、jev-raa-f3/jev-raa-r2、jev-raa-f3/jev-raa-r3)对实施例一中得到的jev病毒质粒标准品进行rt-raa检测。
[0053]
荧光rt-raa使用荧光型rt-raa核酸扩增试剂盒(江苏奇天基因生物科技有限公司，f00001)中的rt荧光基础反应单元(包含单链dna结合蛋白、重组酶、逆转录酶和dna聚合酶)和镁离子缓冲液(醋酸镁，浓度280mmol/l)作为启动剂，rt-raa反应体系总体积为50μl，各试剂成及反应体系见表2，通过荧光定量pcr仪进行测定结果，扩增条件设置为39℃。将变性温度、退火温度和延伸温度都设定为39℃，反应约30min。最终选取可以在最短时间内扩增到目的曲线的引物进行下一步的试验。
[0054]
表2：rt-raa反应体系
[0055][0056]
3.rt-raa引物筛选
[0057]
将实施例一中得到的jev病毒质粒标准品通过荧光定量pcr仪使用步骤2中的rt-raa反应体系进行测定后，发现jev-raa-f2/jev-raa-r1引物组合反应起峰时间最短，反应峰值最高(图1中编号1所示)，因此rt-raa反应最佳的引物组合为jev-raa-f2/jev-raa-r1。
[0058]
实施例一中得到的jev病毒质粒标准品经过核酸浓度测定后得到初始浓度为5.5
×
106copies/μl，使用去rna酶ddh2o进行10倍倍比稀释至5.5
×
100copies/μl，并用ddh2o作为阴性模板，使用jev-raa-f2/jev-raa-r1引物在39℃条件下反应30min，来确定rt-raa荧光检测方法的最低检出量。结果显示rt-raa检测方法的最低检测量为5.5
×
101copies/μl(图2中7所示起峰时间)
[0059]
实施例三、rt-raa检测jev病毒的敏感度试验和特异性试验
[0060]
1.rt-raa敏感度试验
[0061]
将实施例一中制备得到的jev阳性标准质粒测定浓度后使用去rna酶ddh2o进行10倍梯度稀释，按照公式计算拷贝数，公式如下：(6.02
×
10
23
)
×
(浓度
×
10-9
)
÷
(片段长度
×
660)＝拷贝数。并用ddh2o作为阴性模板，在最佳反应条件，来确定rt-raa荧光检测方法的最低检出量。
[0062]
结果显示同实施例二步骤3的检测结果，rt-raa检测方法的最低检测量为5.5
×
101copies/μl。
[0063]
2.rt-raa特异性试验
[0064]
利用建立的rt-raa荧光检测方法对提取的乙型脑炎病毒(jev)、塞内卡病毒(svv)、蓝耳病毒(prrsv)、盖塔病毒(getv)、流行性腹泻病毒(pedv)、株传染性胃肠炎病毒(tgev)核酸进行特异性检测，来评价实施例二中rt-raa检测方法对jev病毒检测的特异性。
[0065]
病毒rna提取：使用柯菲特(香港)国际贸易有限公司的通用型rna提取试剂盒提取rna，具体步骤参考试剂盒说明书：
①
柱平衡：向离心吸附柱中加入500μl溶液rbl，12000rpm/min离心2min，弃去废液。
②
取300μl病毒液于新的ep管中，并加入350μl溶解液rlt，用移液器吹打均匀。
③
12000rpm/min离心2min后取上清于新的ep管中。
④
缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀后将溶液转移至吸附柱中，12000rpm/min离心30s，弃去滤液。
⑤
向吸附柱中加入350μl漂洗液rw，12000rpm/min离心30s，弃去滤液。
⑥
项吸附柱中央加入80μl的dnaseⅰ工作液，室温静置5min。
⑦
向吸附柱中加入350μl漂洗液rw，12000rpm/min离心30s，弃去滤液。
⑧
项吸附柱中加入500μl漂洗液rw2,12000rpm/min离心30s，弃去滤液。
⑨
重复步骤
⑧
。
⑩
1200rpm/min离心3min，将吸附柱放入一个新的1.5ml ep管中，向吸附膜中央
加入30-100μl rnase free ddh2o,12000rpm/min,离心1min，得到rna溶液。六种病毒rna溶液浓度均为105tcid
50
/0.1ml。
[0066]
利用实施例二中rt-raa建立的rt-raa荧光检测方法对提取的乙型脑炎病毒(jev)、塞内卡病毒(svv)、蓝耳病毒(prrsv)、盖塔病毒(getv)、流行性腹泻病毒(pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)的核酸进行检测。结果显示，经过rt-raa荧光检测，jev病毒核酸样品在反应5min后出现荧光信号显著增强(图2中1所示)，其他病毒样品均未检测出荧光信息(图3中2-7所示)。说明所建立的rt-raa荧光检测方法具有很好的特异性，能特异性检测jev病毒。
[0067]
实施例四、rt-raa对临床样品的检测
[0068]
采集来自四川周边城市各地区(成都、德阳、绵阳、南充、眉山、遂宁和乐山)规模化养猪场的75份猪流产胎儿样品。进行取样研磨提取rna后，利用本发明实施例二中所建立的rt-raa荧光检测方法与荧光定量rt-pcr方法同时进行检测样品中是否存在jev病毒，来比较两种方法的符合率，验证所建立的基于荧光rt-raa检测jev病毒的可行性。
[0069]
猪场的75份流产胎儿样品进行检测，两种方法均检测出同一份阳性样品(表3中来自眉山采集的一份样品)存在jev病毒，阳性检出率都为1.33％。rt-raa荧光检测jev病毒的方法与荧光定量rt-pcr检测jev病毒的方法符合率为100％。
[0070]
表3：临床样品检测结果
[0071][0072]
综上，本发明建立了一种快速高效的荧光rt-raa检测jev病毒的相关的试剂和试剂盒，该试剂盒只需39℃条件下反应30min就可以准确检测出待测样本中是否含有乙型脑炎病毒，且具有很高的灵敏性和特异性，最低检测极限为5.5
×
101copies/μl的jev阳性标准质粒转录本，可以应用于临床中乙型脑炎病毒的快速高效检测。
[0073]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，
可以进行一些基本特征的应用。