一种以磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶c的方法
技术领域
1.本发明涉及一种固定化磷脂酶c的方法，尤其涉及一种以引入磁性的单宁酸-壳聚糖粒子的共价固定磷脂酶c的方法。


背景技术：

2.单宁酸(tannic acid，ta)是植物的次生代谢产物，由不同酯化程度的乙醇酸和葡萄糖分子组成。单宁酸上的酚羟基可以形成氢键、疏水键等，羟基作为活性基团可以被化学修饰获得更多的反应位点，从而拓展其应用方向，为提高单宁酸与其他物质反应所生成化学键的强度，可进行氨基改性得到氨基化单宁酸。可以将氨基化单宁酸与fe3o4磁性纳米粒子结合做固定化磁性载体。
3.作为自然界唯一一种碱性多糖，壳聚糖(cs)上存在大量活性基团如氨基、羟基。采用高碘酸钠和环氧氯丙烷处理，将羟基改性成环氧基并进一步氧化成醛基，醛基活化的壳聚糖既可以作为磁性载体的一部分，提高载体的反应性和生物相容性，又可以代替戊二醛的交联剂作用，降低固定化酶的过度交联和微毒性。
4.磷脂酶c(plc)能够特异性水解磷脂，在对磷脂的水解过程中，主要反应基团为-cooh，而-nh2位于非活性中心可以作为酶的固定化位点。正因如此，活化后壳聚糖的醛基与plc的-nh2反应，避免了固定化过程中对酶活性中心的侵占，从而避免其活性的降低。
5.因此，选择磁性单宁酸壳聚糖载体与磷脂酶c结合制备固定化酶，能够有效解决游离酶稳定性和重复使用性差的缺陷，维持较高催化活性的前提下，使固定化酶具有高耐受性并可多次磁分离，可以广泛应用于不同类型酶的固定化中，对生物催化剂的产业化应用具有重要的指导意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶c的方法。通过对单宁酸的氨基修饰及壳聚糖的醛基活化，得到的具有氨基和醛基磁性单宁酸-壳聚糖载体，其中活化后的壳聚糖即是载体的一部分，又能作为交联剂使载体与磷脂酶c结合。所制备的磁性固定化酶具有较高的稳定性、拓宽的ph和温度区间以及较好的重复使用性，其中适宜ph区间为6.0～7.5，适宜温度区间为50～70℃，重复使用7次，相对活力能够达到79％。
7.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种以磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶c的的方法，包括以下步骤：
8.(1)fe3o4磁性纳米粒子的制备
9.在氮气保护下向烧杯中加入fecl3·
6h2o和fecl2·
4h2o，连续搅拌，逐滴加入28％的氨水并在50℃下加热，持续反应一段时间至颜色不再改变，冷却至室温后磁分离，制备的fe3o4磁性纳米粒子用去离子水多次洗涤至中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下
保存。
10.(2)单宁酸的氨基修饰与磁性单宁酸粒子的制备
11.20ml 25％氨水与2mg单宁酸在室温下搅拌2h，随后加入30ml 0.1mol/lhcl终止反应，并在通风橱中蒸发24h。离心后得到的氨基化单宁酸在真空干燥箱中至完全干燥。将2mg氨基化单宁酸与4mg fe3o4磁性纳米离子溶解于ph6.8磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀后在振荡培养箱中200rpm下反应2h，制备的氨基单宁酸磁性粒子用去离子水多次洗涤至中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存。
12.(3)壳聚糖的醛基活化
13.将0.3g cs溶于50ml 1％的醋酸溶液中搅拌30min，再加入50ml 1mol/l的naoh溶液搅拌30min。加热至45℃并加入2ml环氧氯丙烷反应2h，随后加入6ml 37％的丙酮和3.8g/lnabh4溶液，反应30min再后加入6ml环氧氯丙烷，此时混合物在25℃下反应18h。制备出醛基活化的壳聚糖用去离子水多次洗涤至中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存。
14.(4)磁性载体与磷脂酶c的交联固定
15.将50ml 5000u/mlplc与0.45mg壳聚糖和1g磁性氨基化单宁酸粒子加入到100ml的ph10碳酸氢盐缓冲溶液中，搅拌30min后至振荡培养箱中200rpm下反应24h，磁分离后制备出的固定化磷脂酶c先用碳酸氢盐缓冲溶液洗涤三次，再用去离子水洗涤至ph为中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存。
具体实施方式：
16.具体实施方式一：磁性单宁酸-壳聚糖粒子载体作为载体，在反应温度50℃，反应时间为3h，plc添加量为2000、3000、4000、5000、6000、7000和8000u/ml的条件下时，考察plc添加量对固定化酶的活力的影响。
17.具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于反应温度分别为35、40、45、50、55和60℃，考察反应温度对固定化酶的活力的影响。
18.具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于反应时间分别为2、3、4、5、6、7和8h，考察反应时间对固定化酶的活力的影响。
19.具体实施方式四：分别选用磁性固定化plc和游离plc，对100g毛油进行脱胶反应2h，在60℃条件下，在ph 4～8的范围分别进行试验，测定游离酶和固定化酶的酶活力。
20.具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式五的不同点在于在ph 7.0，40～80℃的范围进行试验，测定游离酶和固定化酶的酶活力。
21.具体实施方式六：在最适ph和最适温度的条件下研究酶的重复使用效果。


技术特征：
1.一种以环氧基修饰的磁性壳聚糖纳米粒子为载体的固定化磷脂酶c的方法，其特征通过以下步骤实现：步骤一：在氮气保护下向烧杯中加入fecl3·
6h2o和fecl2·
4h2o，连续搅拌，逐滴加入28％的氨水并在50℃下加热，持续反应一段时间至颜色不再改变，冷却至室温后磁分离，制备的fe3o4磁性纳米粒子用去离子水多次洗涤至中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存；步骤二：20ml 25％氨水与2mg单宁酸在室温下搅拌2h，随后加入30ml0.1mol/l hcl终止反应，并在通风橱中蒸发24h；离心后得到的氨基化单宁酸在真空干燥箱中至完全干燥；将2mg氨基化单宁酸与4mg fe3o4磁性纳米离子溶解于ph6.8磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀后在振荡培养箱中200rpm下反应2h，制备的氨基单宁酸磁性粒子用去离子水多次洗涤至中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存；步骤三：将0.3g cs溶于50ml 1％的醋酸溶液中搅拌30min，再加入50ml1mol/l的naoh溶液搅拌30min；加热至45℃并加入2ml环氧氯丙烷反应2h，随后加入6ml 37％的丙酮和3.8g/lnabh4溶液，反应30min再后加入6ml环氧氯丙烷，此时混合物在25℃下反应18h；制备出醛基活化的壳聚糖用去离子水多次洗涤至中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存；步骤四：将50ml 5000u/ml plc与0.45mg壳聚糖和1g磁性氨基化单宁酸粒子加入到100ml的ph10碳酸氢盐缓冲溶液中，搅拌30min后至振荡培养箱中200rpm下反应24h，磁分离后制备出的固定化磷脂酶c先用碳酸氢盐缓冲溶液洗涤三次，再用去离子水洗涤至ph为中性，并在40℃下真空干燥箱内完全干燥，4℃下保存；步骤五：磁性单宁酸-壳聚糖粒子载体作为载体，在反应温度50℃，反应时间为3h，plc添加量为2000、3000、4000、5000、6000、7000和800u/ml的条件下时，考察plc添加量对固定化酶的活力的影响。保证其他条件不变调整反应温度分别为35、40、45、50、55和60℃，考察反应温度对固定化酶的活力的影响。保证其他条件不变调整反应时间分别为2、3、4、5、6、7和8h，考察反应时间对固定化酶的活力的影响；步骤六：分别选用磁性固定化plc和游离plc，对100g毛油进行脱胶反应2h，在60℃条件下，ph 4～8的范围分别进行试验，测定游离酶和固定化酶的酶活力。在ph7.0、40～80℃的范围进行试验，测定游离酶和固定化酶的酶活力；步骤七：在最适ph和最适温度的条件下，将固定化磷脂酶c应用在大豆毛油脱胶中，重复使用8次并测定固定化酶的酶活力重复使用效果。2.根据权利要求1所述的一种磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶c的方法，其特征在于步骤五中最佳固定化条件为plc添加量5000u/ml，反应温度50℃，反应时间3h。3.根据权利要求1所述的一种磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶c的方法，其特征在于步骤六中最适ph和最适温度分别为7.0和65℃。4.根据权利要求1所述的一种磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶c的方法，其特征在于步骤七中固定化酶重复使用7次仍保留79％的相对活力。

技术总结
本发明涉及磁性固定化酶领域，公开了一种以磁性单宁酸-壳聚糖粒子为载体的固定化磷脂酶C的方法。采用氨基修饰处理单宁酸，醛基活化处理壳聚糖，制备了磁性单宁酸壳聚糖粒子，以此载体与磷脂酶C结合得到固定化酶。固定化过程中，醛基壳聚糖作为交联剂，大量的醛基分别与改性后单宁酸的氨基和磷脂酶C非活性中心上的氨基反应，分别生成席夫碱键，以此方法最终生产出一种稳定性和重复使用性较好的固定化磷脂酶C。本发明的重点集中在解决固定化过程中活性中心的侵占而导致的催化活性的降低；两种天然物质的应用，使载体具有更好的生物相容性，避免了常规载体的对环境的污染，对生物催化剂的产业化应用具有重要的指导意义。化剂的产业化应用具有重要的指导意义。


技术研发人员：于殿宇 王宁 王彤 杨欣润 仲文 周晓男 潘明喆 王立琦 江连洲
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2021.11.23
技术公布日：2022/2/15