一种用于肺癌诊断的microrna标志物组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及microrna标志物组合在肺癌检测和诊断中的应用，以及其用作肺癌治疗的潜在分子靶点。


背景技术：

2.近年来，随着检查仪器准确性的提高和公众对健康检查意识的提高，肺部磨玻璃结节(ggn)的检出率不断上升。有研究报告，在接受胸部计算机断层扫描(ct)检查的患者中，ggn的患病率约为1.8-2.6％。在连续3-5年的随访中，发现尽管ggn生长缓慢，但恶性肿瘤的可能性约为29-34％，高于实体结节，ggn的风险因结节大小和遗传背景等因素而异。
3.美国胸科医师学会、国家综合癌症网络和英国胸科学会指南对单纯ggn的治疗采取了保守态度。此外，在指南的年度更新中，这种保守态度变得越来越明显，人们认为纯ggn可以在干预前生长》2cm。然而，基于固体成分》5mm的ggn的理论转移风险，近年来医学界对混合密度的ggn(含固体成分)越来越警惕。此外，研究人员制定的严格标准认为，固体成分《3mm ggn的存在是安全的。分析表明，无论固体成分如何，结节直径都是疾病进展的独立危险因素。与较小结节相比，ggns》10mm的单纯实性结节或ggns》8mm的部分实性结节的恶性风险显著增加。其他研究也证实ggns》10mm可作为疾病进展的预测因子。根据2016年亚洲关于肺结节的共识，直径为≤5毫米或直径》5毫米和《8毫米建议每年复查一次。一些固体结节≤建议对8mm患者进行3个月、12个月和24个月的随访，然后进行年度随访；一些直径》8mm的实性结节建议每3个月复查一次，并给予抗炎治疗。
4.然而，体检后在肺部检测到ggn的患者，其特征是神经紧张、睡眠和进食障碍，并要求切除结节。虽然患者在听了医生的专业解释后暂时得到了缓解和安慰，但一些患者可能在几天后出现焦虑，在随访期间定期到诊所就诊，并不断报告焦虑和恐惧的感觉。实现ggn的全面和客观诊断对于避免过度积极的侵入性治疗或错过治疗机会至关重要。因此，近年来，准确诊断已成为影像学、胸外科和呼吸科临床研究的重点。随着基因测序技术的不断发展，下一代测序技术(ngs)已被广泛应用于肿瘤的早期筛查和准确诊断/治疗。通过ngs准确诊断ggn对治疗具有重要意义。
5.microrna(mirnas)是一类长度约为22个核苷酸的非编码小rna，在许多病理过程中发挥作用，如肿瘤发生和肿瘤转移。在多种人类肿瘤中发现了mirna的异常表达和功能，mirna可作为肿瘤治疗的生物标志物和新药靶点。据报道，当细胞受损时，大量mirna会释放到外周血。许多研究发现，循环mirna可能成为非小细胞肺癌(nsclc)诊断的潜在生物标志物。研究还通过ngs在早期肺癌患者和健康志愿者的血液中筛选出腺癌和鳞状细胞癌的特定候选mirna，这将有助于肺癌患者的早期诊断和更成功的治疗。因此，microrna可以作为一种有效的肿瘤标志物用于癌症的检测和诊断，甚至可以作为肿瘤治疗的靶点，指导临床用药。
6.各种研究提示肿瘤组织microrna的表达与肿瘤发病及预后相关，并且外周血血清作为一种常规的检测方式，其临床应用便捷，利于推广，并且microrna在血清中能够长期稳
定存在，而血清中microrna表达谱的变化与肿瘤的发生密切相关，因此血清microrna在肿瘤诊疗中具有较高的应用价值。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是提供一种可用于用于肺癌诊断的microrna标志物组合，其中microrna标志物组合包含5个microrna，分别是has-mir-200b,has-mir-183,has-mir-429,has-mir-96,和has-mir-135b，这个microrna标志物组合与肺癌发病率呈正相关，检测效率高，针对性强。
8.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于肺癌诊断的microrna标志物组合，所述microrna标志物组合包括has-mir-200b,has-mir-183,has-mir-429,has-mir-96,和has-mir-135b。
9.一种用于肺癌诊断的microrna标志物组合的应用，所述microrna标志物组合可用于肺癌辅助诊断或检测。
10.进一步地，
11.(1)筛选肺癌患者癌组织与正常人群肺组织差异表达的microrna；
12.(2)验证肺癌患者血清与非癌对照血清差异表达的microrna，评估其作为肺癌患者血清候选标志物，用于肺癌检测和诊断的可能性。
13.本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于肺癌诊断的microrna标志物组合及其应用，研究表明has-mir-200b,has-mir-183,has-mir-429,has-mir-96,和has-mir-135b在肺癌组织和肺癌患者血液中都呈高表达，与肺癌的发生呈正相关，并且参与调控肺癌的发生和进展，是潜在的肺癌检测和诊断的生物标志物。将这5个microrna组合后，其对肺癌诊断的敏感性和特异性得到了显著的提高，通过二代测序技术可以在分子水平上实现对肺癌的检测和诊断，其敏感性高，特异性强，同时，这5个microrna组合为标志物，有望成为肺癌辅助诊断和检测的一种新手段。
附图说明
14.图1为各种类型肺癌组织中microrna组合表达水平比较。
15.图2为microrna组合在肺癌组织中表达的roc曲线(gse74190)。
16.图3为microrna组合在肺癌组织中表达的roc曲线验证(gse19945)。
17.图4为microrna组合在肺癌患者血清中表达的roc曲线(gse137140)。
具体实施方式
18.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
19.具体实施例
20.1研究对象的收集
21.病例为ncbi(national center for biotechnology information，美国国家生物技术信息中心)数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)下载的二代测序数据，包括gse74190、gse19945和gse137140这三个数据集。
22.gse74190数据包含136个组织样本，包括36个腺癌、3个癌前病变、6个细支气管肺
泡癌、17个小细胞肺癌、30个鳞状细胞癌和44个健康组织。使用美国安捷伦公司的agilent-019118human mirna microarray v1 g4470a测序平台进行分析。gse19945数据包含63个通过手术切除获得的肺癌组织样本。这些样本包括35例小细胞肺癌、11例大细胞神经内分泌癌、4例腺癌、5例鳞状细胞癌和8例健康肺。使用美国安捷伦公司的human 0.6k mirna microarray g4471a测序平台进行分析。gse137140包括3924份样本的外周血循环mirna图谱，其中包括术前肺癌患者血清1566份、术后肺癌患者血清180份和非癌症健康对照1774份。该分析使用日本东丽工业公司的3d-gene human mirna v21_1.0.0测序平台进行分析。
23.2肺癌组织中差异表达microrna的筛选
24.使用r软件(版本3.6.3)limma包对下一代测序数据执行规范化和log2转换，识别差异表达microrna的阈值设定为|log2(fc)|》1.0，调整后的p值小于0.05表示有统计学意义的差异。使用r软件提取表达数据，然后用于构建预测模型。对于gse74190数据集，将所有样本分为六组：腺癌、癌前病变、细支气管肺泡癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌和健康组织组。与健康对照组相比，腺癌中上调和下调基因分别为31和35；在癌前病变中分别为22和12；细支气管肺泡癌分别为24和13；小细胞肺癌分别为74和88；鳞状细胞癌分别为52和66。对各个类型肿瘤中上调的microrna进行取交集，结果获得了5个上调的mirna(has-mir-200b、has-mir-183、has-mir-429、has-mir-96和has-mir-135b)在所有类型的肺癌中均显著共表达(结果见图1)。随后，使用r软件分析各组中这5个mirna的表达，并通过spss绘制roc曲线，发现这5个基因的auc值》0.843(范围：0.843
–
0.984)，敏感性》90.9％(范围：90.9
–
97.7％)，特异性》75.0％(范围：75.0
–
100.0％)(结果见表1)。随后组合分析发现5个上调microrna组合的auc为0.997，敏感性为97.7％，特异性为100.0％(结果见图2)。
25.表1：microrna在肺癌组织中的表达及诊断意义(gse74190)
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随后在gse19945数据集中验证了这5个microrna。发现除了has-mir-135b外，其他4个mirna的表达与gse14190数据集中观察到的一致。值得注意的是，与健康对照组相比，has-mir-135b的表达也上调；然而，差异无统计学意义(倍数变化＝1.9070，p＝0.084)。同样使用r软件分析各组中这5个mirna的表达，并通过spss绘制roc曲线，发现这5个基因的auc值》0.707(范围：0.707
–
0.982)，敏感性》67.3％(范围：67.3
–
94.5％)，特异性》87.5％(范围：87.5
–
100.0％)(结果见表2)。随后组合分析发现5个上调microrna组合的auc为1.000，敏感性为100.0％，特异性为100.0％(结果见图3)。
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表2：microrna在肺癌组织中的表达及诊断意义(gse19945)
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3肺癌患者血清中差异表达microrna的验证
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随后选取gse137140数据集将这个microrna组合在肺癌患者血清中进行了验证。发现血液中这5个microrna的表达与组织中报道的一致。用spss软件构建了这5个microrna的roc曲线，所有auc值均》0.655(范围：0.655
–
0.885)，敏感性》35.6％(范围：35.6
–
69.6％)，特异性》98.3％(范围：98.3
–
99.2％)(结果见表3)。组合分析发现5个上调microrna组合的auc为0.897，敏感性为91.5％，特异性为75.7％(结果见图4)。
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表3：microrna在肺癌患者血清中的表达及诊断意义(gse137140)
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以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。