交联乳蛋白共沉淀物
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技术领域
3.本发明涉及交联乳蛋白共沉淀物的制备，该制备包括用转谷氨酰胺酶进行处理；以及该交联乳蛋白共沉淀物在酸化乳产品生产中的用途。


背景技术：

4.可以通过转谷氨酰胺酶等酶使动物源性和植物源性蛋白质的氨基酸交联。转谷氨酰胺酶(ec 2.3.2.13)催化蛋白质分子中存在的谷氨酰胺氨基酸残基与赖氨酸氨基酸残基之间共价键的产生。
5.在酸奶等酸化乳产品的制造中使用能改善质地的转谷氨酰胺酶是已知的。使用转谷氨酰胺酶有助于增加黏度并减少脱水收缩。因此，使用转谷氨酰胺酶能够降低例如酸奶的蛋白质含量，而对质地没有负面影响。
6.酪蛋白酸钠通常是通过从乳中分离出酪蛋白并将其转化为酪蛋白酸钠来制备。
7.wo 2007/026053(维利奥有限公司(valio))披露，将经转谷氨酰胺酶处理并经阳离子交换的脱脂乳粉添加至脱脂酸奶乳中使得脱脂酸奶的黏度增加以及乳清分离(脱水收缩)减少。
8.wo 2007/060288(维利奥有限公司)披露了一种制造例如酸奶的方法，其中将转谷氨酰胺酶、酶活化化合物(诸如酵母提取物或谷胱甘肽)和酸化剂添加至蛋白质源中，在这样的情况下该酶在酸化期间具有活性。蛋白质源可以是乳，或者其可为通过添加例如乳渗透物、乳清和/或乳糖部分而具有降低的蛋白质含量的乳。
9.wo 2014/001642(维利奥有限公司)披露了一种用于生产具有类似于人造肉的微观结构的酪蛋白产品的方法，其中用转谷氨酰胺酶处理酪蛋白浓缩物起始材料。
10.guyot和kulozik,international dairy journal[国际乳品杂志]21(2011)628-635已研究了在酸化之前将经转谷氨酰胺酶处理的脱脂乳粉添加至酸奶乳中的效果。对蛋白质强化脱脂乳进行热处理以灭活固有的tgase抑制剂，接着进行tgase处理、酶灭活和喷雾干燥。将经tgase处理的脱脂乳粉添加至脱脂乳中并生产酸奶。此被视为对完整的酸奶乳进行tgase处理的替代方案。与添加未经处理的smp生产的酸奶样品相比，该替代方案显示出更高的黏度和更低的血清损失。此外，使用经tgase处理的smp，在酸奶乳中添加较少的乳粉即可达到相同的黏度水平。因此，在减少smp量的情况下生产出在结构性能方面具有相当特性的酸奶。作者建议进一步研究乳粉中不同的酪蛋白与乳清蛋白比率的影响。
[0011]
本发明的目的是生产与具有相同蛋白质含量水平的标准酸奶相比例如在黏度、坚实度和/或黏聚性方面具有良好结构特性的酸奶。具体来说，希望在不增加蛋白质含量的情况下生产这样的酸奶。
[0012]
另一个目的是生产可用于例如改善酸奶的质地特性的交联乳蛋白源，该酸奶为诸
如具有低至中等蛋白质含量的酸奶，例如具有与乳相同或更低的蛋白质含量的酸奶。


技术实现要素：

[0013]
令人惊讶地发现，可以通过以下方式来获得具有有益特性的交联乳蛋白共沉淀物：加热乳基质，接着降低ph，分离经沉淀的蛋白质以及用转谷氨酰胺酶处理所述蛋白质。优选地，在转谷氨酰胺酶处理之后包括巴氏杀菌(pasteurization)步骤。
[0014]
将经沉淀的乳蛋白与包含例如钙和乳糖的乳清分离。出于各种原因，许多消费者希望要使用乳蛋白共沉淀物的最终产品中的乳糖含量较低，一个原因是乳糖含量较低的产品将具有降低的碳水化合物含量和减少的卡路里。
[0015]
如此获得的交联乳蛋白共沉淀物可有利地用于酸奶等酸化乳产品的生产中以改善黏度和稠度。当使用本发明的乳蛋白共沉淀物时，即使乳蛋白含量相对较低，仍能获得具有良好质地的酸化乳产品。
[0016]
从成本的角度来看，低乳蛋白含量是有益的。
[0017]
本发明的方法的另一个优点是在酸奶酸化之前通过巴氏杀菌处理使转谷氨酰胺酶失活。这意味着不需要进行标记，因为酸奶中没有活性酶。另一个优点是，在转谷氨酰胺酶处理之前，对乳基质的热处理将使乳中的任何内源性转谷氨酰胺酶抑制剂失活。此外，与用转谷氨酰胺酶处理酸奶乳中的全部蛋白质的方法相比时，仅处理部分蛋白质的本发明的方法使用较少的转谷氨酰胺酶且因此降低了成本。
[0018]
与使用例如经喷雾干燥的脱脂乳粉来改善酸奶质地的现有方法相比的另一个优点是，在本发明的方法中，能避免干燥和重构(reconstitution)的步骤。干燥尤为昂贵。根据本发明的方法生产例如酸奶的乳品厂能够使用其自己的乳资源来生产交联乳蛋白共沉淀物并在酸化之前将其加回到酸奶乳中。
[0019]
因此，本发明涉及一种用于制备交联乳蛋白共沉淀物的方法，该方法包括：
[0020]
(a)在使得超过50％w/w、优选地超过80％w/w的乳清蛋白变性的条件下加热包含酪蛋白和乳清蛋白的乳基质；
[0021]
(b)将步骤(a)的经加热的乳基质的ph调节至ph为4-4.7、优选地4.5-4.7，从而使至少80％w/w的该乳蛋白沉淀；
[0022]
(c)分离包含步骤(b)的经沉淀的乳蛋白的部分，从而获得乳蛋白共沉淀物，并且可选地添加水；
[0023]
(d)将步骤(c)的乳蛋白共沉淀物的ph调节至ph为6-7，从而溶解至少80％w/w的该经沉淀的乳蛋白；
[0024]
(e)用转谷氨酰胺酶处理步骤(d)的溶解的乳蛋白共沉淀物，从而获得交联乳蛋白共沉淀物。
[0025]
在一个优选的实施例中，所述方法进一步包括：
[0026]
(f)对步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物进行巴氏杀菌。
[0027]
本发明进一步涉及可通过该方法获得的交联乳蛋白共沉淀物。
[0028]
本发明还涉及一种用于制备酸化乳产品的方法，该方法包括：
[0029]
(a)将上文所定义的交联乳蛋白共沉淀物与乳基质混合以获得混合乳基质，其中该混合乳基质中10％-30％的总蛋白质获自该交联乳蛋白共沉淀物；以及
[0030]
(b)酸化步骤(a)的混合乳基质以获得酸化乳产品。
[0031]
本发明进一步涉及可通过所述方法获得的酸化乳产品。
具体实施方式
[0032]
本发明涉及一种用于制备交联乳蛋白共沉淀物的方法，该方法包括：
[0033]
(a)在使得超过50％w/w、优选地超过80％w/w的乳清蛋白变性的条件下加热包含酪蛋白和乳清蛋白的乳基质；
[0034]
(b)将步骤(a)的经加热的乳基质的ph调节至ph为4-4.7、优选地4.5-4.7，从而使至少80％w/w的该乳蛋白沉淀；
[0035]
(c)分离包含步骤(b)的经沉淀的乳蛋白的部分，从而获得乳蛋白共沉淀物，并且可选地添加水；
[0036]
(d)将步骤(c)的乳蛋白共沉淀物的ph调节至ph为6-7，从而溶解至少80％w/w的该经沉淀的乳蛋白；
[0037]
(e)用转谷氨酰胺酶处理步骤(d)的溶解的乳蛋白共沉淀物，从而获得交联乳蛋白共沉淀物。
[0038]
在一个优选的实施例中，所述方法进一步包括：
[0039]
(f)对步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物进行巴氏杀菌。
[0040]
在另一个实施例中，所述方法进一步包括：
[0041]
(ff)浓缩和/或干燥步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物或步骤(f)的经巴氏杀菌的交联乳蛋白共沉淀物。
[0042]
在另一个实施例中，步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物或步骤(f)的经巴氏杀菌的交联乳蛋白共沉淀物不进行干燥。
[0043]
在本发明的上下文中，乳蛋白共沉淀物是包含共沉淀乳清蛋白的酪蛋白。该乳蛋白共沉淀物是通过以下方式获得的：通过热处理使乳基质中的乳清蛋白变性，接着酸化以使酪蛋白与变性的乳清蛋白共沉淀。
[0044]
酪蛋白是常见于哺乳动物乳中的相关磷蛋白家族。酪蛋白约占牛乳中蛋白质的80％。众所周知，酪蛋白于ph 4.6和20℃下沉淀。
[0045]
如在此使用的，术语“乳清蛋白”是在酪蛋白于ph 4.6和20℃下沉淀后保持可溶于乳清(milk serum/whey)中的一组乳蛋白(farrell等人,nomenclature of the proteins of cows’milk[牛乳中蛋白质的命名法]-第六版,journal of dairy science[乳品科学杂志],第87卷,第6期,2004年6月,第1641-1674页)。
[0046]
变性的乳清蛋白会在或大约在ph 4.6与酪蛋白共沉淀。
[0047]
如在此使用的，术语“乳基质”可以涵盖任何获自哺乳动物的乳或乳产品，优选地为牛乳、母绵羊乳或山羊乳，更优选地为牛乳。在一个实施例中，乳基质可以是全脂乳、低脂乳(诸如含1％脂肪的乳)、含0.1％脂肪的乳、半脱脂乳或脱脂乳。乳基质可以是复构的脱脂乳粉。
[0048]
乳基质可能经过标准化和/或均质化。乳基质可能经过巴氏杀菌或其他方式的热处理。
[0049]
乳基质中的蛋白质含量优选为至少3.5％。
[0050]
在本发明的方法的步骤(a)中，在使得超过50％w/w、优选地超过80％w/w的乳清蛋白变性的条件下加热包含酪蛋白和乳清蛋白的乳基质。
[0051]
大多数乳清蛋白在加热时会变性且然后例如在ph 4.6下会沉淀。可以使用本领域已知的任何方法来确定在步骤(a)中已变性的乳清蛋白的百分比。例如，fang qian,jiayue sun,di cao、yanfeng tuo,shujuan jiang和guangqing mu,korean j food sci anim resour[韩国动物资源食品科学杂志]2017；37(1):44-51中描述的方法。在此，使用native-page技术来分析天然乳清蛋白。
[0052]
替代性地，可以确定在加热前乳基质的上清液中乳清蛋白的相对量(w1)和在步骤(a)中加热后乳基质的上清液中乳清蛋白的相对量(w2)并将变性的乳清蛋白的比率s(％)计算为：
[0053]
s＝(w1-w2)*100/w1％
[0054]
w1可以通过以下方式确定：获取加热前的乳基质样品并确定酪蛋白在ph 4.6和20℃下沉淀前后的可溶性蛋白质的总量。类似地，w2可以通过以下方式确定：获取加热(步骤(a))后的乳基质样品并确定酪蛋白和变性的乳清蛋白在ph 4.6和20℃下沉淀前后的可溶性蛋白质的总量。
[0055]
在本发明的方法的步骤(a)中，可以将包含酪蛋白和乳清蛋白的乳基质加热至80℃-100℃、优选地85℃-95℃的温度并保持1-15分钟、优选地5-15分钟。
[0056]
为避免任何可能的疑问：在本发明的上下文中，当提及步骤(a)-(f)中任一者时，这是指上文描述的用于制备交联乳蛋白共沉淀物的方法的步骤(a)-(f)，而且也是指下文描述的用于制备酸化乳产品的方法的步骤(a)-(f)。方法步骤(a)-(f)在两种方法中相同且因此步骤(a)-(f)中任一者的任何优选的实施例同样很好地适用于用于制备交联乳蛋白共沉淀物的方法以及用于制备酸化乳产品的方法。
[0057]
在步骤(a)的热处理与步骤(b)的ph调节之间，可以将经加热的乳基质冷却例如至15℃-40℃或至20℃-25℃(诸如至室温)。
[0058]
在步骤(b)中，将步骤(a)的经加热的乳基质的ph调节至ph4-4.7、优选地ph 4.5-4.7，从而使至少80％w/w的乳蛋白沉淀。为避免疑问，这意味着使酪蛋白与乳清蛋白的总量的至少80％w/w沉淀。
[0059]
可以使用本领域已知的任何酸(例如hcl或乳酸)进行步骤(b)中的ph调节。
[0060]
在步骤(b)的ph调节与步骤(c)的分离之间，可以将经过ph调节的乳基质加热至例如40℃-60℃，且/或搅拌。
[0061]
可以通过本领域已知的任何方法(例如，通过过滤、倾析或离心)进行步骤(c)的分离。
[0062]
可以使用本领域已知的任何碱(例如naoh)进行步骤(d)中的ph调节。
[0063]
可以在步骤(c)和/或(d)中任一者中添加水，优选地在步骤(c)之后以及在步骤(d)之前或期间添加。
[0064]
在步骤(d)之前、期间或之后和/或在步骤(e)期间或之后可将温度调节至例如40℃-60℃。
[0065]
可以在例如30℃-60℃的温度下进行步骤(e)的转谷氨酰胺酶处理。技术人员会知道根据酶的最适温度所选择的温度。
[0066]
转谷氨酰胺酶可以按0.1-5tghu(a)/g乳蛋白、优选地0.2-1tghu(a)/g乳蛋白的浓度添加。用量将取决于温度和孵育时间等参数。本领域技术人员会知道如何确定最佳酶用量。
[0067]
步骤(e)的转谷氨酰胺酶处理可以进行例如30分钟至3小时。技术人员会知道如何根据处理温度和所用酶的量来调整处理时间。
[0068]
巴氏杀菌(步骤(f))可以例如在85℃下进行15秒。此巴氏杀菌可以通过以下方式进行：将交联共沉淀物添加至酸奶乳中并对混合物总体进行巴氏杀菌。在此种情形下，巴氏杀菌的时间和温度可以是例如在95℃下5分钟、在90℃下10分钟或在85℃下20分钟、或在酸奶生产中所用的其他时间/温度组合。
[0069]
在另一个实施例中，本发明涉及一种交联乳蛋白共沉淀物，其可通过上文描述的方法来获得。
[0070]
本发明进一步涉及一种特征为包含酪蛋白和乳清蛋白的交联乳蛋白共沉淀物，该交联乳蛋白共沉淀物是通过谷氨酰胺与赖氨酸之间的异肽交联键进行交联。
[0071]
可以根据masao motoki和noriki nio(1983)crosslinking between different food proteins by transglutaminase[利用转谷氨酰胺酶使不同的食物蛋白质之间交联],j.food.sci.[食品科学期刊],第48卷,第561-566页来确定酪蛋白和乳清蛋白中谷氨酰胺与赖氨酸之间异肽交联键的形成。
[0072]
本发明进一步涉及一种包含酪蛋白和乳清蛋白的交联乳蛋白共沉淀物，其中蛋白质聚合度为至少20％。
[0073]
蛋白质聚合度是转谷氨酰胺酶反应的量度。可以根据martin p.manfred huss,sabine lauber,ulrich kulozik(2007)yoghurt gel formation by means of enzymatic protein cross-linking during microbial fermentation[在微生物发酵过程中借助酶促蛋白质交联形成酸奶凝胶],food hydrocolloids[食品水解胶体],第21(4)卷,第585-595页使用凝胶渗透色谱法来确定蛋白质聚合度。
[0074]
本发明进一步涉及使用转谷氨酰胺酶来制备交联乳蛋白共沉淀物。
[0075]
本发明进一步涉及在酸化乳产品的制备中使用可通过上文描述的方法获得的交联乳蛋白共沉淀物。在另一个实施例中，本发明涉及使用可通过上文描述的方法获得的交联乳蛋白共沉淀物来增加酸化乳产品的黏度。
[0076]
在一个实施例中，本发明涉及一种用于制备酸化乳产品的方法，该方法包括将可通过上文描述的方法获得的交联乳蛋白共沉淀物与乳基质混合以获得混合乳基质，其中该混合乳基质中10％-30％的总蛋白质获自该交联乳蛋白共沉淀物；以及将该混合乳基质酸化以获得酸化乳产品。
[0077]
在一个实施例中，本发明涉及一种用于制备酸化乳产品的方法，该方法包括：
[0078]
(a)在使得超过50％w/w、优选地超过80％w/w的乳清蛋白变性的条件下加热包含酪蛋白和乳清蛋白的第一乳基质，优选地通过加热至80℃-100℃的温度并保持1-15分钟来进行；
[0079]
(b)将步骤(a)的经加热的乳基质的ph调节至ph为4-4.7、优选地4.5-4.7，从而使至少80％w/w的该乳蛋白沉淀；
[0080]
(c)分离包含步骤(b)的经沉淀的乳蛋白的部分，从而获得乳蛋白共沉淀物，并且
可选地添加水；
[0081]
(d)将步骤(c)的乳蛋白共沉淀物的ph调节至ph为6-7，从而溶解至少80％w/w的该经沉淀的乳蛋白；
[0082]
(e)用转谷氨酰胺酶处理步骤(d)的溶解的乳蛋白共沉淀物，从而获得交联乳蛋白共沉淀物；
[0083]
(f)对步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物或步骤(g)的混合乳基质进行巴氏杀菌；
[0084]
(g)将步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物或步骤(f)的经巴氏杀菌的交联乳蛋白共沉淀物与第二乳基质混合以获得混合乳基质，其中该混合乳基质中10％-30％的总蛋白质获自步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物；以及
[0085]
(h)酸化步骤(f)或(g)的混合乳基质以获得酸化乳产品。
[0086]
为避免任何可能的疑问，巴氏杀菌步骤(f)可以在步骤(g)之前或之后进行。即，可以对步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物进行巴氏杀菌(步骤(f))且然后与第二乳基质混合(步骤(g))。或者可以将步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物与第二乳基质混合(步骤(g))且然后对混合乳基质进行巴氏杀菌(步骤(f))。
[0087]
在本发明的上下文中的酸化乳产品是通过酸化生产的乳源性产品。
[0088]
在一个实施例中，通过与乳酸菌一起孵育来进行酸化，乳酸菌优选为以下各属的乳酸菌：链球菌属(streptococcus)、乳球菌属(lactococcus)、乳杆菌属(lactobacillus)、明串珠菌属(leuconostoc)、假明串珠菌属(pseudoleuconostoc)、片球菌属(pediococcus)、丙酸杆菌属(propionibacterium)、肠球菌属(enterococcus)、短杆菌属(brevibacterium)或双歧杆菌属(bifidobacterium)或其任何组合。通过与一种或多种乳酸菌一起孵育进行的酸化可以称为发酵。
[0089]
在另一个实施例中，通过与化学酸化剂、优选地葡糖酸δ-内酯(gdl)一起孵育来进行酸化。
[0090]
该酸化乳产品可以是可勺取的酸化乳产品，例如搅拌型酸奶或凝固型酸奶；或可饮用的酸化乳产品，例如饮用型酸奶。优选地，该酸化乳产品是酸奶、凝固型酸奶、搅拌型酸奶、饮用型酸奶或发酵乳。
[0091]
在一个实施例中，该酸化乳产品可以是酸奶、凝固型酸奶、搅拌型酸奶、饮用型酸奶、发酵乳、希腊酸奶、酸奶油、夸克(quark)、新鲜干酪或奶油干酪。在另一个实施例中，该酸化乳产品可以是酸奶、凝固型酸奶、搅拌型酸奶、饮用型酸奶、发酵乳、希腊酸奶、酸奶油或夸克。在一个优选的实施例中，该酸化乳产品可以是酸奶、凝固型酸奶、搅拌型酸奶、饮用型酸奶或发酵乳。
[0092]
搅拌型酸奶可以通过以下方式来生产：在发酵罐中进行酸化，在酸化后已获得希望的ph时，例如在发酵罐通过搅动来破坏所形成的酸凝胶。可以将经搅拌的产品部分地冷却至20℃-30℃并且可以添加调味成分。将经搅拌的产品泵送至灌装管线并灌装到零售容器中。然后可以冷却经搅拌的酸奶产品且然后储存。
[0093]
凝固型酸奶可以在零售容器中酸化且酸化后不要搅动。酸化后，可以将凝固型酸奶冷却且然后储存。可以在急速冷冻机隧道或冷藏室中进行冷却。
[0094]
如果使用化学酸化剂，则希望的ph可以是例如大约ph 4.5。
[0095]
如果使用微生物发酵进行酸化，则酸化后的ph可以优选地介于4与5之间。
[0096]
在一个实施例中，将酸化乳产品冷却，优选地立即冷却。
[0097]
可以在发酵罐中将经搅拌的酸奶冷却至大约20℃-25℃。然后，可以进行搅动(例如通过搅拌)来破坏凝胶。然后可以将酸奶泵送至灌装线，接着通过在冷却隧道中急速冷冻或在冷藏室中以较慢的速度冷冻进行第二个冷却步骤，达到大约5℃的储存温度。
[0098]
替代性地，对于搅拌型酸奶，可以首先搅拌酸化产品以破坏凝胶，然后通过通往灌装站的管线中的热交换器冷却至大约20℃-25℃，且然后在第二个冷却步骤中通过在冷却隧道中急速冷冻或在冷藏室中以较慢的速度冷冻而冷却至大约5℃的储存温度。
[0099]
对于凝固型酸奶，该方法可以是：在零售罐中酸化(在调温室中进行)后，通过在冷却隧道中急速冷冻或在冷藏室中以较慢的速度冷冻将酸奶冷却至大约5℃的储存温度。
[0100]
本发明用于制备酸化乳产品的方法可以进一步包括酸化后的储存步骤。该步骤可以在搅动(例如通过搅拌或泵送)和/或冷却(一次或多次)之后进行，优选地在二者之后进行。储存可以在低温下、优选地低于10℃、更优选地0℃-10℃(诸如4℃-6℃)进行。
[0101]
进行步骤(h)中的酸化直至达到希望的ph。如何选择酸化的最佳温度和孵育时间在本领域中是众所周知的。酸化可以例如在40℃-45℃下进行3-10小时，诸如4-7小时。对于嗜温培养物有时可以采用更低的温度(诸如低至32℃)。
[0102]
在一个优选的实施例中，将混合乳基质酸化至低于ph 5。
[0103]
在另一个优选的实施例中，该酸化乳产品的蛋白质含量为1％-4％，诸如2％-4％或3％-4％。
[0104]
在另一个优选的实施例中，相较于具有相同蛋白质含量但在酸化之前没有将交联乳蛋白共沉淀物添加至乳基质的情况下制备的酸化乳产品，该酸化乳产品具有增加的黏度。
[0105]
在另一个优选的实施例中，相较于具有相同蛋白质含量并以相同方式制备但未经过转谷氨酰胺酶处理的酸化乳产品，该酸化乳产品具有增加的黏度。
[0106]
在另一个优选的实施例中，相较于具有相同蛋白质含量并以相同方式制备但没有加热步骤(a)的酸化乳产品相比，该酸化乳产品具有增加的黏度。
[0107]
本发明还涉及一种酸化乳产品，其可通过上文描述的方法来获得。
[0108]
转谷氨酰胺酶
[0109]
用于本发明的方法的转谷氨酰胺酶可以获自任何来源，尤其获自丝状真菌或酵母，或者获自细菌。
[0110]
转谷氨酰胺酶可以例如源自如下属或种的菌株：蘑菇属(agaricus)，例如双孢蘑菇(a.bisporus)；ascovaginospora；曲霉属(aspergillus)，例如黑曲霉(a.niger)、泡盛曲霉(a.awamori)、臭曲霉(a.foetidus)、日本曲霉(a.japonicus)、米曲霉(a.oryzae)；念珠菌属(candida)；毛壳菌属(chaetomium)；chaetotomastia；网柄菌属(dictyostelium)，例如盘基网柄菌(d.discoideum)；镰孢属(fusarium)，例如尖孢镰孢(f.oxysporum)、腐皮镰孢(f.solani)、镰孢属物种(f.sp.)；克鲁维酵母属(kluveromyces)，例如脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)、乳酸克鲁维酵母(k.lactis)；毛霉属(mucor)，例如爪哇毛霉(m.javanicus)、高大毛霉(m.mucedo)、细孢毛霉(m.subtilissimus)；脉孢菌属(neurospora)，例如粗糙脉孢菌(n.crassa)；枝霉属(rhinocladiella)；根毛霉属(rhizomucor)，例如微小根毛霉(r.pusillus)；根霉属(rhizopus)，例如少根根霉
(r.arrhizus)、日本根霉(r.japonicus)、匍枝根霉(r.stolonifer)；核盘霉属(sclerotinia)，例如白腐核盘霉(s.libertiana)；圆酵母属(torula)；球拟酵母属(torulopsis)；木霉属(trichoderma)，例如里氏木霉(t.reesei)；毛癣菌属(trichophyton)，例如红色毛癣菌(t.rubrum)；维氏核盘菌属(whetzelinia)，例如w.sclerotiorum；束丝放线菌属(actinosynnema)，例如奇迹束丝放线菌(a mirum)；芽孢杆菌属(bacillus)，例如芽孢杆菌属物种(b.sp.)、凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、环状芽孢杆菌(b.circulans)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、休闲地芽胞杆菌(b.novalis)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、短小芽孢杆菌(b.pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)、苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)；双歧杆菌属，例如动物双歧杆菌(b.animalis)、两歧双歧杆菌(b.bifidum)、短双歧杆菌(b.breve)、婴儿双歧杆菌(b.infantis)、乳双歧杆菌(b.lactis)、长双歧杆菌(b.longum)；金黄杆菌属(chryseobacterium)；柠檬酸杆菌属(citrobacter)，例如弗氏柠檬酸杆菌(c.freundii)；梭菌属(clostridium)，例如产气荚膜梭菌(c.perfringens)；色二孢属(diplodia)，例如棉色二孢(d.gossypina)；肠杆菌属(enterobacter)，例如产气肠杆菌(e.aerogenes)、阴沟肠杆菌(e.cloacae)；爱德华氏菌属(edwardsiella)、迟钝爱德华菌(e.tarda)；欧文氏菌属(erwinia)，例如草生欧文氏菌(e.herbicola)；埃希氏菌属(escherichia)，例如大肠杆菌(e.coli)；克雷伯氏菌属(klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)；韩国生工属(kribbella)，例如，黄色韩国生工菌(k.flavida)；库茨涅尔氏菌属(kutzneria)，例如，白色库茨涅尔氏菌(k.albida)；微球菌属(miriococcum)；漆斑菌属(myrothesium)；毛霉属；脉孢菌属(neurospora)，例如粗糙脉孢菌(n.crassa)；变形杆菌属(proteus)，例如普通变形杆菌(p.vulgaris)；普罗维登斯菌属(providencia)，例如斯氏普罗维登斯菌(p.stuartii)；密孔菌属(pycnoporus)，例如朱红密孔菌(pycnoporus cinnabarinus)、血红密孔菌(pycnoporus sanguineus)；瘤胃球菌属(ruminococcus)，例如扭链瘤胃球菌(r.torques)；沙门氏菌属(salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)；沙雷氏菌属(serratia)，例如液化沙雷氏菌(s.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(s.marcescens)；希瓦氏菌属(shewanella)，例如武氏希瓦氏菌(s.woodyi)；志贺菌属(shigella)，例如弗氏志贺菌(s.flexneri)；链霉菌属(streptomyces)，例如抗生链霉菌(s.antibioticus)、栗色球孢链霉菌(s.castaneoglobisporus)、紫红链霉菌(s.violeceoruber)；栓菌属(trametes)；木霉属(trichoderma)，例如里氏木霉(t.reesei)、绿色木霉(t.viride)；耶尔森氏菌属(yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(y.enterocolitica)。
[0111]
在一个优选的实施例中，转谷氨酰胺酶源自真菌。在另一个优选的实施例中，转谷氨酰胺酶源自细菌。
[0112]
在一个优选的实施例中，转谷氨酰胺酶源自链霉菌属的菌株，优选地茂原链霉菌(s.mobaraensis)或利迪链霉菌(s.lydicus)，更优选地茂原链霉菌。
[0113]
在一个优选的实施例中，用于本发明的方法的转谷氨酰胺酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与本技术的seq id no:1或seq id no:2或其转谷氨酰胺酶活性片段具有至少50％、诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0114]
在一个优选的实施例中，用于本发明的方法的转谷氨酰胺酶具有如下氨基酸序
列，该氨基酸序列与seq id no:1或seq id no:2的成熟多肽具有至少50％、诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0115]
在更优选的实施例中，用于本发明的方法的转谷氨酰胺酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与seq id no:1具有至少50％、诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
[0116]
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(needleman-wunsch algorithm)(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)将两个氨基酸序列之间的序列同一性确定为“最长同一性”的输出结果，该算法如emboss软件包(优选地6.6.0或更高版本)(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件(european molecular biology open software suite)，rice等人,2000,trends genet.[遗传学趋势]16:276-277)中的尼德尔(needle)程序中所实施。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
[0117]
(相同的残基
×
100)/(比对长度-比对中的空位总数)
[0118]
该转谷氨酰胺酶可以是细胞外的。它可以在其n-末端具有信号序列，该信号序列在分泌过程中被切除。
[0119]
转谷氨酰胺酶可以源自本文提及的任何来源。术语“源自”在本发明的上下文中意指该酶可能从其天然存在的生物中分离，即该转谷氨酰胺酶的氨基酸序列与天然多肽具有同一性。术语“源自”还意指该酶可能在宿主生物中重组产生，其中重组产生的酶具有与天然酶具有同一性的氨基酸序列，或者具有经修饰的氨基酸序列(例如具有缺失、插入和/或被取代的一个或多个氨基酸)，即重组产生的酶是天然氨基酸序列的突变体。天然酶的含义中包括天然变体。此外，术语“源自”包括通过例如肽合成而合成产生的酶。术语“源自”还包括已经通过例如糖基化、磷酸化等在体内或体外修饰的酶。至于重组产生的酶，术语“源自”指酶的同一性而不是重组产生酶的宿主生物的同一性。
[0120]
可以通过使用任何合适的技术从微生物获得转谷氨酰胺酶。例如，酶制剂可通过发酵合适的微生物和之后通过本领域已知的方法从所得的发酵培养液或微生物分离转谷氨酰胺酶制剂而获得。转谷氨酰胺酶还可以通过使用重组dna技术而获得。这种方法通常包括培养用重组dna载体转化的宿主细胞，该载体包含编码转谷氨酰胺酶的dna序列，并且该dna序列与合适的表达信号可操作地连接，使得其能在允许酶表达的条件下在培养基中表达酶，并从培养物回收酶。还可以将dna序列掺入宿主细胞的基因组中。dna序列可以是基因组、cdna或合成来源的、或它们的任何组合，并且可以按照本领域已知的方法进行分离或合成。
[0121]
转谷氨酰胺酶可以是纯化的。如在此使用的术语“纯化的”包括基本上不含来自生产生物的不溶组分的转谷氨酰胺酶蛋白。术语“纯化的”还包括基本上不含来自获得酶的天然生物的不溶组分的转谷氨酰胺酶蛋白。优选地，还可以从酶的来源生物和培养基的一些可溶组分分离。更优选地，可以通过一种或多种单元操作来进行分离：过滤、沉淀或色谱。
[0122]
优选地，转谷氨酰胺酶是从其生产生物中纯化的。更优选地，转谷氨酰胺酶是从其生产生物中纯化的意味着转谷氨酰胺酶制剂不包含活的生产生物细胞。
[0123]
因此，转谷氨酰胺酶可以是经纯化的，即仅存在少量其他蛋白质。表述“其他蛋白
质”具体涉及其他酶。如在此使用的术语“纯化的”还指去除其他组分，特别是存在于转谷氨酰胺酶的来源细胞中的其他蛋白质并且最特别是其他酶。转谷氨酰胺酶可以是“基本上纯的”，即，不含来自其生产生物(即，例如，用于重组产生转谷氨酰胺酶的宿主生物)的其它成分。优选地，转谷氨酰胺酶为至少40％(w/w)纯、更优选地至少50％、60％、70％、80％或甚至至少90％纯的酶蛋白制剂。
[0124]
术语转谷氨酰胺酶包括酶的催化活性必需的任何辅助化合物，诸如例如合适的受体或辅因子，其可以或者可以不天然存在于反应系统中。
[0125]
转谷氨酰胺酶可以呈适于所讨论用途的任何形式，诸如例如呈干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定化液体或受保护酶的形式。
[0126]
根据本发明，可以通过本领域已知的任何方法来确定转谷氨酰胺酶活性。例如，可以通过对因在自由氨基(6-氨基己酸)与谷氨酰胺(z-gln-gly)的酰基之间形成异肽键而释放的氨进行定量来分析转谷氨酰胺酶活性，如下文所描述：
[0127]
使用的化学品和酶：
[0128]
z-gln-gly。例如西格玛公司(sigma)c6154
[0129]
6-氨基己酸。例如西格玛公司07260
[0130]
还原型l-谷胱甘肽。例如西格公司g4251
[0131]
α-酮戊二酸盐。例如西格玛公司k3752
[0132]
nadh
[0133]
l-gldh。例如罗氏制药公司(roche)107735
[0134]
mops。例如西格玛公司m-1254
[0135]
转谷氨酰胺酶标准品
[0136]
方法：
[0137]
向75myl酶溶液(溶解于0.1m mops/5mm还原型l-谷胱甘肽，ph 7.0)中添加50myl 1％6-氨基己酸和75myl 1％z-gln-gly以及75myl(含0.44g/l nadh、2.5g/lα-酮戊二酸盐的0.1m mops(ph7.0))。
[0138]
在30℃下通过动态测量来追踪340nm处的吸光度并保持5分钟。
[0139]
酶活性是相对于转谷氨酰胺酶标准品确定的，该标准品经过校准与转谷氨酰胺酶单位定义相匹配(folk,j.e.和cole,p.w.(1966)biochim.biophys.acta.[生化与生物物理学报]241,5518-5525)。结果表示为tghu(a)。
[0140]
优选的实施例
[0141]
1.一种用于制备交联乳蛋白共沉淀物的方法，该方法包括：
[0142]
(a)在使得超过50％w/w、优选地超过80％w/w的乳清蛋白变性的条件下加热包含酪蛋白和乳清蛋白的乳基质；
[0143]
(b)将步骤(a)的经加热的乳基质的ph调节至ph为4-4.7、优选地4.5-4.7，从而使至少80％w/w的该乳蛋白沉淀；
[0144]
(c)分离包含步骤(b)的经沉淀的乳蛋白的部分，从而获得乳蛋白共沉淀物，并且可选地添加水；
[0145]
(d)将步骤(c)的乳蛋白共沉淀物的ph调节至ph为6-7，从而溶解至少80％w/w的该经沉淀的乳蛋白；
[0146]
(e)用转谷氨酰胺酶处理步骤(d)的溶解的乳蛋白共沉淀物，从而获得交联乳蛋白共沉淀物。
[0147]
2.如实施例1所述的方法，该方法进一步包括：
[0148]
(f)对步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物进行巴氏杀菌。
[0149]
3.如实施例1或2中任一项所述的方法，该方法进一步包括：
[0150]
(ff)浓缩和/或干燥步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物或步骤(f)的经巴氏杀菌的交联乳蛋白共沉淀物。
[0151]
4.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，将该乳基质加热至80℃-100℃的温度并保持1-15分钟。
[0152]
5.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤(e)中，以0.1-5tghu(a)/g乳蛋白、优选地0.2-1tghu(a)/g乳蛋白的浓度添加该转谷氨酰胺酶。
[0153]
6.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该转谷氨酰胺酶与seq id no:1具有至少60％序列同源性。
[0154]
7.一种交联乳蛋白共沉淀物，其可通过如实施例1-6中任一项所述的方法来获得。
[0155]
8.转谷氨酰胺酶的用途，其用于制备交联乳蛋白共沉淀物。
[0156]
9.通过如实施例1-6中任一项所述的方法获得的交联乳蛋白共沉淀物在制备酸化乳产品中的用途。
[0157]
10.一种用于制备酸化乳产品的方法，该方法包括：
[0158]
(i)将通过如实施例1-6中任一项所述的方法获得的交联乳蛋白共沉淀物与乳基质混合以获得混合乳基质，其中该混合乳基质中10％-30％的总蛋白质获自该交联乳蛋白共沉淀物；以及
[0159]
(ii)酸化步骤(a)的混合乳基质以获得酸化乳产品。
[0160]
11.一种用于制备酸化乳产品的方法，该方法包括：
[0161]
(a)在使得超过50％w/w、优选地超过80％w/w的乳清蛋白变性的条件下加热包含酪蛋白和乳清蛋白的第一乳基质，优选地通过加热至80℃-100℃的温度并保持1-15分钟来进行；
[0162]
(b)将步骤(a)的经加热的乳基质的ph调节至ph为4-4.7、优选地4.5-4.7，从而使至少80％w/w的该乳蛋白沉淀；
[0163]
(c)分离包含步骤(b)的经沉淀的乳蛋白的部分，从而获得乳蛋白共沉淀物，并且可选地添加水；
[0164]
(d)将步骤(c)的乳蛋白共沉淀物的ph调节至ph为6-7，从而溶解至少80％w/w的该经沉淀的乳蛋白；
[0165]
(e)用转谷氨酰胺酶处理步骤(d)的溶解的乳蛋白共沉淀物，从而获得交联乳蛋白共沉淀物；
[0166]
(f)对步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物或步骤(g)的混合乳基质进行巴氏杀菌；
[0167]
(g)将步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物或步骤(f)的经巴氏杀菌的交联乳蛋白共沉淀物与第二乳基质混合以获得混合乳基质，其中该混合乳基质中10％-30％的总蛋白质获自步骤(e)的交联乳蛋白共沉淀物；以及
[0168]
(h)酸化步骤(f)或(g)的混合乳基质以获得酸化乳产品。
[0169]
12.如实施例11所述的方法，其中将该混合乳基质酸化至低于ph 5。
[0170]
13.如实施例11-12中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，将该乳基质加热至80℃-100℃的温度并保持1-15分钟。
[0171]
14.如实施例11-13中任一项所述的方法，其中在步骤(e)中，以0.1-5tghu(a)/g乳蛋白、优选地0.2-1tghu(a)/g乳蛋白的浓度添加该转谷氨酰胺酶。
[0172]
15.如实施例11-14中任一项所述的方法，其中该转谷氨酰胺酶与seq id no:1具有至少60％序列同一性。
[0173]
16.如实施例9所述的用途或如实施例10-15中任一项所述的方法，其中该酸化乳产品的蛋白质含量为1％-4％。
[0174]
17.如实施例9或16中任一项所述的用途或如实施例10-16中任一项所述的方法，其中该酸化乳产品是可勺取的酸化乳产品，诸如搅拌型酸奶或凝固型酸奶；或可饮用的酸化乳产品，诸如饮用型酸奶。
[0175]
18.如实施例9或16-17中任一项所述的用途或如实施例10-17中任一项所述的方法，其中该酸化乳产品是酸奶、凝固型酸奶、搅拌型酸奶、饮用型酸奶或发酵乳。
[0176]
19.一种酸化乳产品，其可通过如实施例10-18中任一项所述的方法来获得。
[0177]
实例
[0178]
实例概述：
[0179]
1.利用黏度计和质构分析仪进行分析的方法
[0180]
2.酸奶-参照
[0181]
3.从酸奶乳制备具有经tgase交联的共沉淀物的酸奶
[0182]
4.从酸奶乳制备具有经tgase交联的酪蛋白酸钠的酸奶
[0183]
5.制备具有经tgase交联的干酪蛋白酸钠的酸奶
[0184]
实例1
[0185]
使用黏度计测量该酸奶的黏度特性。使用波通仪器公司(perten)rva 4500仪器在25℃下以50rpm进行该测量并保持130秒。记录黏度(cp)并保持130秒。
[0186]
使用带圆柱形探头的质地分析仪测量坚实度和黏聚性，深度10mm，分析时间10秒。
[0187]
实例2-参照
[0188]
酸奶参考样品如下制备：将脱脂乳粉(丹麦阿尔乐食品公司(arla foods denmark))溶解于milliq水中(52g粉兑448g水)以获得蛋白质含量为3.9％的酸奶乳。冷却该乳至次日，届时将其在90℃下热处理10分钟并冷却至40℃(发酵温度)。用来自丹麦科汉森公司(chr.hansen,denmark)的酸奶起子培养物ch1接种该酸奶。酸化6.5小时直至ph 4.6。坚实度＝21.96g，黏聚性＝-7.93g。130秒后，黏度＝1360cp。
[0189]
实例3
[0190]
制备具有交联共沉淀物的酸奶样品。将脱脂乳粉(丹麦阿尔乐食品公司)溶解于milliq水中(52g粉兑448g水)以获得蛋白质含量为3.9％的酸奶乳。冷却该乳直至次日。
[0191]
次日，抽取20％的乳用于生产共沉淀物。将该乳加热至90℃并保持10分钟，并冷却至室温，使用1m hcl将ph调节至4.6以沉淀蛋白质。将混合物加热至55℃，并通过离心分离出84％乳清。向沉积物中添加水直至与乳清分离前的体积相同，并使用naoh将ph调节至6.7。
[0192]
将温度调节至55℃。添加茂原链霉菌转谷氨酰胺酶(0.67tghu(a)/g乳蛋白)并孵育1小时。将经转谷氨酰胺酶处理的乳添加至酸奶乳中，随即进行90℃热处理。将该乳冷却至40℃并添加起子培养物ch1(丹麦科汉森公司)。酸化直至ph 4.6。坚实度＝41.52g，黏聚性＝-10.77g。130秒后，黏度＝1849cp。
[0193]
实例4-比较
[0194]
制备具有交联酪蛋白酸钠(类似于共沉淀物但未经热处理制成)的酸奶样品。将脱脂乳粉(丹麦阿尔乐食品公司)溶解于milliq水中(52g粉兑448g水)以获得蛋白质含量为3.9％的酸奶乳。冷却该乳直至次日。
[0195]
次日，抽取20％的该乳并用于在无热处理的情况下生产酪蛋白酸钠。使用1m hcl将该乳的ph调节至4.6以沉淀蛋白质。将混合物加热至55℃，并分离出乳清。向沉积物中添加水直至与乳清分离前的体积相同，并使用naoh将ph调节至6.7。
[0196]
将温度调节至55℃。添加茂原链霉菌转谷氨酰胺酶(0.67tghu(a)/g乳蛋白)并孵育1小时。将经转谷氨酰胺酶处理的乳添加至该酸奶乳中，随即进行90℃热处理。将该乳冷却至40℃并添加起子培养物ch1(丹麦科汉森公司)。酸化直至ph 4.6。坚实度＝30.21g，黏聚性＝-5.60g。130秒后，黏度＝1096cp。
[0197]
实例5-比较
[0198]
制备具有交联酪蛋白酸钠的酸奶样品。将脱脂乳粉(丹麦阿尔乐食品公司)溶解于milliq水中(52g粉兑448g水)以获得蛋白质含量为3.9％的酸奶乳。冷却该乳直至次日。
[0199]
次日，将该乳与经转谷氨酰胺酶处理的含3.9％蛋白质的酪蛋白酸钠溶液(来自丹麦阿尔乐食品公司的酪蛋白酸钠)以80:20的比率混合以生产用于发酵的酸奶乳。通过以下方式来制备经转谷氨酰胺酶处理的酪蛋白酸钠溶液：将酪蛋白酸钠溶液加热至55℃，添加转谷氨酰胺酶(0.67tghu(a)/g乳蛋白)并孵育1小时。将经转谷氨酰胺酶处理的酪蛋白酸钠溶液添加至该酸奶中，随即进行90℃热处理。将该乳在90℃下热处理10分钟并冷却至40℃，并添加起子培养物ch1(丹麦科汉森公司)。酸化直至ph 4.6。坚实度＝25.82g，黏聚性＝-9.14g。130秒后，黏度＝1352cp。
[0200]
表1：实例2-5中的处理汇总
[0201]
[0202]
表2：实例2-5的结果汇总
[0203][0204]
如从表2中可以看出，相较于其他方法，本发明的方法(实例3)产生更高的黏度、更高的坚实度和更好的黏聚性。