1.本发明属于益生菌技术领域，具体涉及一种耐酸耐胆汁盐定植能力强的益生菌组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，人们逐渐从人体中分离出益生菌菌株，从益生菌的菌种定位至菌株水平，开发安全菌株的功能方向，比如干酪乳杆菌、lgg和bb12这些明星菌株，在多种疾病(肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心脑血管等) 中发挥了重要的作用。
3.大量研究表明益生菌能够维持肠道菌群平衡，促进肠道对营养物质的吸收，增强人体的免疫功能，同时能抑制肠道腐败菌的生长繁殖及代谢产物的产生。但益生菌发挥作用的前提是必须能适应人体的低ph的胃酸环境和高渗透压的胆盐环境，并且具有较强的黏附能力，才能定植于肠道，从而发挥生理功效。因此，筛选出具有耐酸耐胆汁盐且强定植黏附能力的菌株对于开发新型微生态制剂和功能性健康食品具有重要意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种耐酸耐胆汁盐定植能力强的益生菌组合物及其制备方法和应用，所述益生菌组合物能够耐胃酸环境、高胆盐环境，黏附能力强，抑制肠道有害菌群，可应用于调节肠道菌群和助消化等方面。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种耐酸耐胆汁盐定植能力强的益生菌组合物，所述益生菌组合物的菌种选自：鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)ai-11、发酵乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)ai-25、动物双歧杆菌乳亚种 (bifidobacterium animalis subsp.lactis)ai-01和两歧双歧杆菌 (bifidobacterium bifidum)ai-91中的任意两种。
7.优选的，所述益生菌组合物的菌种包括：鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合，或动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91的组合。
8.优选的，所述所述鼠李糖乳杆菌ai-11的保藏编号为cgmcc no.21745；
9.所述发酵乳杆菌i-25的保藏编号为cgmcc no.21746；
10.所述动物双歧杆菌乳亚种ai-01的保藏编号为cgmcc no.21747；
11.所述两歧双歧杆菌ai-91的保藏编号为cgmcc no.21780。
12.本发明还提供了上述益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：将所述益生菌组合物的菌种接种到mrs肉汤培养基上厌氧发酵20～28h。
13.优选的，所述菌种的接种体积均为所述厌氧发酵的体系体积的1％；所述体系中还包括益生元。
14.本发明还提供了一种耐酸耐胆汁盐定植能力强的益生菌制剂，包括利用上述制备方法得到的发酵液，或所述发酵液的加工制品。
15.本发明还提供了上述益生菌组合物或上述益生菌制剂在制备调节肠道菌群的产品中的应用。
16.优选的，所述产品包括食品、饲料或药物。
17.本发明还提供了一种调节肠道菌群的食品，所述食品内包括上述益生菌组合物或上述益生菌制剂。
18.本发明还提供了一种调节肠道菌群的药品，所述药品的有效成分包括上述益生菌组合物或上述益生菌制剂。
19.有益效果：本发明提供了一种耐酸耐胆汁盐定植能力强的益生菌组合物，鼠李糖乳杆菌ai-11、发酵乳杆菌ai-25、动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91中的任意两种的菌种组合，可耐受ph2.5的胃酸液，2h 后的活菌存活率达到100％；其中鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25 的组合可耐受0.09％(w/v，0.09g/100ml)的胆汁盐浓度，动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91的组合可耐受0.3％的胆汁盐浓度，保证能够有效经过胃酸环境，到达肠道定植；并且鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合、动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91的组合对肠上皮细胞caco-2具有较强的黏附能力，较明星菌株鼠李糖乳杆菌gg 和发酵乳杆菌cect5716有优势。而且本发明所述益生菌组合物或益生菌制剂，可抑制肠道有害菌群：明显抑制大肠杆菌的生长、明显抑制奇异变形杆菌的生长，所以可将其应用于制备调节肠道菌群、助消化的产品中。
20.生物保藏信息
21.鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)ai-11，于2021年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，具体保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.21745；
22.发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)ai-25，于2021年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，具体保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.21746；
23.动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)ai-01，于2021年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (cgmcc)，具体保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.21747；
24.两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)ai-91，于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，具体保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.21780。
附图说明
25.图1为革兰氏染色后菌体形态图，其中a为鼠李糖乳杆菌ai-11，b为发酵乳杆菌ai-25，c为动物双歧杆菌乳亚种ai-01，d为两歧双歧杆菌ai-91；
26.图2为不同益生菌对caco-2细胞的黏附能力的结果，图中ai-11
※
ai-25 表示鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合，ai-91
※
ai-01表示两歧双歧杆菌ai-91和动物双歧杆菌乳亚种ai-01的组合。
具体实施方式
27.本发明提供了一种耐酸耐胆汁盐定植能力强的益生菌组合物，所述益生菌组合物的菌种选自：鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)ai-11、发酵乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)ai-25、动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)ai-01和两歧双歧杆菌 (bifidobacterium bifidum)ai-91中的任意两种。
28.本发明所述益生菌组合物的菌种优选包括：鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合，或动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91 的组合。在本发明中，所述鼠李糖乳杆菌ai-11、发酵乳杆菌ai-25、动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91均已在中国专利cn113080461a 中进行公开，并完成了保藏，所述所述鼠李糖乳杆菌ai-11的保藏编号为 cgmcc no.21745；所述发酵乳杆菌i-25的保藏编号为cgmcc no.21746；所述动物双歧杆菌乳亚种ai-01的保藏编号为cgmcc no.21747；所述两歧双歧杆菌ai-91的保藏编号为cgmcc no.21780。
29.在本发明实施例中，经k-b纸片扩散实验验证，鼠李糖乳杆菌ai-11、发酵乳杆菌ai-25、动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91对九种抗生素(庆大霉素、万古霉素、卡那霉素、克林霉素、链霉素、氨苄西林、青霉素、红霉素、氯霉素)的敏感性都很高，均不耐药；且鼠李糖乳杆菌 ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合，和动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91的组合均对大肠杆菌和奇异变形杆菌具有较强的抑制效果。
30.本发明还提供了上述益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：将所述益生菌组合物的菌种接种到mrs肉汤培养基上厌氧发酵20～28h。
31.本发明在进行厌氧发酵前，优选将组合菌种进行共同接种，而后进行共同培养，且所述组合的接种体积比为1:1，且所述组合中各菌种的接种体积优选均为所述厌氧发酵的体系体积的1％，且所述体系中优选还包括益生元。本发明所述益生元优选包括低聚异麦芽糖、水苏糖、低聚果糖、低聚木糖、赤藓糖醇、菊粉、异麦芽酮糖醇、山梨糖醇、乳糖醇和抗性糊精中的一种或多种的组合，更优选的针对鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合时，所述益生元包括水苏糖、低聚果糖和菊粉中一种或多种的组合；当针对动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91的组合时，所述益生元包括低聚异麦芽糖、水苏糖、低聚果糖和异麦芽酮糖醇中的一种或多种的组合。本发明所述益生元的加入体积优选为所述体系体积的1％。本发明所述厌氧发酵的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。本发明所述厌氧发酵的时间优选为24h。经本发明所述厌氧发酵后，获得的发酵液可作为制备相应益生菌制剂的原料。
32.本发明还提供了一种耐酸耐胆汁盐定植能力强的益生菌制剂，包括利用上述制备方法得到的发酵液，或所述发酵液的加工制品。
33.本发明所述加工制品优选包括：浓缩后的液态益生菌制剂、发酵液干燥后得到的粉状益生菌制剂、发酵液中分离菌体制备的菌粉、或所述菌粉重悬后得到的液态益生菌制剂。本发明所述重悬所利用的分散液优选包括培养液、缓冲液或去离子水。本发明所形成的粉状益生菌制剂、菌粉或液态益生菌制剂在保藏期具有较好的稳定性。本发明所述益生菌制剂可以用于食品、饲料或药品的生产。
34.本发明还提供了上述益生菌组合物或上述益生菌制剂在制备调节肠道菌群的产品中的应用。
35.本发明所述产品的种类优选包括食品、饲料或药物，且所述食品优选功能食品和/或膳食补充剂，以及固体饮料。本发明所述食品更具体的可为益生菌粉、发酵乳制品、含乳饮料或乳酪等。
36.本发明还提供了一种调节肠道菌群的食品，所述食品内包括上述益生菌组合物或上述益生菌制剂。
37.本发明所述食品优选与上述相同，在此不再赘述。
38.本发明还提供了一种调节肠道菌群的药品，所述药品的有效成分包括上述益生菌组合物或上述益生菌制剂。
39.本发明对所述药品的剂型并没有特殊限定，所述药品中优选还包括药学上可接受的辅料。
40.下面结合实施例对本发明提供的一种耐酸耐胆汁盐定植能力强的益生菌组合物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
41.本发明的各实施例中，实验数据表示为mean
±
s.e.m.数据采用prismversion 5.0(graphpad,san diego,ca,usa)进行统计。组间差异采用one-way anova跟随tukery’s multiple comparison test的方法进行统计。 p《0.05时具有显著的统计学差异。
42.实施例1
43.菌株的筛选与鉴定
44.采用选择性培养基(mrs琼脂培养基)，从健康青年人和儿童肠道分离得到菌株，具体方法如下：用无菌竹棒挑取自然排出的粪便2～3克，置于无菌采集管中，1小时内加入50ml无菌水，振荡制成匀浆。用无菌水连续稀释10倍浓度到10-5
；取不同稀释度的样品0.1ml涂布于两种选择性培养基上，37℃厌氧培养48h；取出培养皿，挑不同形态特征的单菌落，转接至液体mrs肉汤培养基，37℃厌氧培养24h后送测序公司检测鉴别菌种，将确定的菌株连续传代3次后可冷冻保藏。
45.筛选得到的鼠李糖乳杆菌ai-11的单菌落形态为白色至半透明，表面凸起，边缘规则呈圆形，菌株形态为粗短直杆，排列规则(图1中a)。经过 16s rdna分子鉴定，发现ai-11菌株的16s rdna序列(seq id no.1)同源性最高的为鼠李糖乳杆菌属(lactobacillus rhamnosus)，序列相似性高达100％。因此结合形态和分子鉴定，确定ai-11菌株属于鼠李糖乳杆菌 (lactobacillus rhamnosus)。
46.发酵乳杆菌ai-25的单菌落形态为透明色，表面凸起，边缘呈规则圆形，菌株形态为直杆，长短不一，排列规则，(图1中b)。经过16s rdna分子鉴定，发现ai-25菌株的16s rdna序列(seq id no.2)同源性最高的为发酵乳杆菌属(lactobacillus fermentum)，序列相似性高达100％。因此结合形态和分子鉴定，确定ai-25菌株属于发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)。
47.动物双歧杆菌乳亚种ai-01的单菌落形态为白色至半透明色，表面凸起，边缘规则呈圆形；菌株形态为短直杆，一端有时呈分叉状，排列规则(图1 中c)。经过16s rdna分子鉴定，发现ai-01菌株的16s rdna序列(seqid no.3)同源性最高的为动物双歧杆菌乳亚种属(bifidobacterium animalissubsp.lactis)，序列相似性高达99.92％。因此结合形态和分子鉴定，确定 ai-01菌株属于动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)。
48.两歧双歧杆菌乳亚种ai-91的单菌落形态为透明色，表面凸起，边缘规则呈圆形；菌株形态为短细直杆，顶端有时呈分叉状，排列不规则(图1中 d)。经过16s rdna分子鉴定，发现ai-91菌株的16s rdna序列(seq idno.4)同源性最高的为动物双歧杆菌乳亚种属(bifidobacterium animalissubsp.lactis)，序列相似性高达99.54％。因此结合形态和分子鉴定，确定 ai-91菌株属于动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)。
49.吸取静置培养20～24h的菌混悬液按1％接种量接种至mrs肉汤培养基中，放置37℃培养箱静置培养20～24h，作传代操作，重复传代3次；于无菌冻存管中加入40％甘油与传代2次的益生菌菌液，体积比例为1:1。放置
ꢀ‑
20℃储存。
50.实施例2
51.菌株的安全性评价
52.将实施例1得到的-20℃冻存的甘油管鼠李糖乳杆菌ai-11、发酵乳杆菌 ai-25、动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91接种复苏于正常 mrs肉汤培养基中，进行3次转接活化培养(37℃厌氧培养24h)，活化后的培养液用于抗生素敏感性实验。
53.将活化后的鼠李糖乳杆菌ai-11、发酵乳杆菌ai-25、动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91取0.5ml，均匀涂布于mrs琼脂平皿表面，待吹干，将庆大霉素、万古霉素、卡那霉素、克林霉素、链霉素、氨苄西林、青霉素、红霉素、氯霉素的药敏纸片贴在琼脂表面，置于37℃培养箱培养 24h，观察琼脂表面菌株的生长情况。若抗生素纸片周围出现明显的透明圈，则用直尺测量透明圈的直径以判断供试菌株是否具有药敏性。同时选用金黄色葡萄球菌作为药敏实验的质控菌株。供试菌株是否具有对各种抗生素的抗性依据美国临床和实验室标准化协会(clinical and laboratory standardsinstitute，clsi)制定的相关标准(见表1)判断。
54.表1药敏纸片含量及抗药性判断标准
55.[0056][0057]
表2 k-b纸片扩散的实验结果
[0058][0059]
注：表中“s”表示益生菌对抗生素表现出敏感s效果，“i”表示益生菌对抗生素表现出中介i效果，“r”表示益生菌对抗生素表现出耐药r效果，“/”表示益生菌无需进行此抗生素的安全性评估。
[0060]
k-b纸片扩散实验结果显示，鼠李糖乳杆菌ai-11、发酵乳杆菌ai-25、动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91对九种抗生素的敏感性都很高，均不耐药，具有较高的安全性。
[0061]
实施例3
[0062]
共培养菌株对胃酸液的耐受性实验
[0063]
将实施例1得到的-20℃冻存的甘油管菌株，接种复苏于正常mrs肉汤培养基中，进行3次转接活化培养，活化后的鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25分别以1％接种体积
接种mrs肉汤，37℃厌氧培养24h，取培养好的组合菌按照10％的比例分别接种于ph分别为1.5、2.5、3.5、4.5的mrs 肉汤培养基中，放置37℃培养箱，分别在接种后的第0h、1h、2h取样作计数处理。动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91组合、鼠李糖乳杆菌gg和发酵乳杆菌cect5716对胃酸耐受性实验操作同上。
[0064]
分别以单一菌株进行1％的接种，除接种单一菌株外，其余操作均与实施例3相同，测定单一菌株对胃酸液的耐受性。
[0065]
结果如表3～10所示，鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合、两歧双歧杆菌ai-91和乳双歧杆菌ai-01的组合，均可耐受ph2.5及以上的酸性环境，在ph 2.5中3h，仍可100％存活，具有较好的耐受能力。而明星菌株鼠李糖乳杆菌gg和发酵乳杆菌cect5716具有在ph 2.5中3h，存活率分别降低至69％和42％。
[0066]
表3鼠李糖乳杆菌ai-11与发酵乳杆菌ai-25组合的耐酸能力评估(单位： cfu/ml)
[0067][0068]
表4动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91组合耐酸能力评估(单位：cfu/ml)
[0069][0070][0071]
表5鼠李糖乳杆菌gg耐酸能力评估(单位：cfu/ml)
[0072][0073]
表6发酵乳杆菌cect5716耐酸能力评估(单位：cfu/ml)
[0074][0075]
表7鼠李糖乳杆菌ai-11耐酸能力评估(单位：cfu/ml)
[0076][0077]
表8发酵乳杆菌ai-25耐酸能力评估(单位：cfu/ml)
[0078][0079]
表9乳双歧杆菌ai-01耐酸能力评估(单位：cfu/ml)
[0080]
[0081]
表10两歧双歧杆菌ai-91耐酸能力评估(单位：cfu/ml)
[0082][0083]
实施例4
[0084]
共培养菌株体外胆汁盐耐受性实验
[0085]
将实施例1得到的-20℃冻存的甘油管菌株，接种复苏于正常mrs肉汤培养基中，进行3次转接活化培养，活化后的鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25分别以1％接种体积接种mrs肉汤，37℃厌氧培养24h，取培养好的组合菌按照10％的比例分别接种于不同浓度的胆汁盐，在接种后的第 0h、1h、2h取样作计数处理。动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌 ai-91组合、鼠李糖乳杆菌gg和发酵乳杆菌cect5716对胆汁盐耐受性实验操作同上。
[0086]
分别以单一菌株进行1％的接种，除接种单一菌株外，其余操作均与实施例4相同，测定单一菌株对体外胆汁盐的耐受性。
[0087]
结果如表11～18所示，鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合可耐受0.09％及以下浓度胆汁盐，两歧双歧杆菌ai-91和乳双歧杆菌ai-01 的组合可耐受0.2％及以下浓度胆汁盐，优于鼠李糖乳杆菌gg和发酵乳杆菌 cect5716。
[0088]
表11鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25组合耐牛胆汁盐能力评估(单位：cfu/ml)
[0089][0090]
表12动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91组合耐牛胆汁盐能力评估(单位：cfu/ml)
[0091][0092]
表13鼠李糖乳杆菌gg耐牛胆汁盐能力评估(单位：cfu/ml)
[0093][0094]
表14发酵乳杆菌cect5716耐牛胆汁盐能力评估(单位：cfu/ml)
[0095][0096]
表15鼠李糖乳杆菌ai-11耐牛胆汁盐能力评估(单位：cfu/ml)
[0097][0098]
表16发酵乳杆菌ai-25耐牛胆汁盐能力评估(单位：cfu/ml)
[0099][0100][0101]
表17乳双歧杆菌ai-01耐牛胆汁盐能力评估(单位：cfu/ml)
[0102][0103]
表18两歧双歧杆菌ai-91耐牛胆汁盐能力评估(单位：cfu/ml)
[0104][0105]
实施例5
[0106]
共培养菌株对肠道caco-2细胞黏附能力实验
[0107]
将实施例1得到的-20℃冻存的甘油管菌株，接种复苏于正常mrs肉汤培养基中，进行3次转接活化培养，活化后的鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25按分别以1％接种体积接种mrs肉汤，37℃厌氧培养24h，备用。 caco-2细胞培养于10％dmem高糖培养基中，每2天传代一次，细胞长满后进行黏附实验。
[0108]
将培养好的caco-2细胞用胰蛋白酶消化，制成105个/ml浓度的细胞悬液，向预先已放置盖玻片的6孔板中加入2ml细胞悬液，37℃，5％co2细胞培养箱中培养。待细胞铺满盖玻片后，吸出旧培养液，无菌pbs洗涤2 次，每孔加入1ml益生菌菌悬液与1ml细胞培养液混合，37℃，5％co2培养箱中孵育1h，再用37℃的pbs溶液洗玻片3～4次，用胰蛋白酶消化细胞，用全培养基终止消化，将细胞及细胞上黏附的细菌收集，制成单细胞悬液，用于活菌计数。每个组细胞培养皿的细胞悬液用血细胞计数板对细胞个数进行计数。根据活菌计数的结果以及对应培养皿细胞计数的结果.计算益生菌对caco-2细胞的黏附效果。
[0109]
黏附指数以100个细胞上黏附的细菌数表示。动物双歧杆菌乳亚种ai-01 和两歧双歧杆菌ai-91组合、鼠李糖乳杆菌gg和发酵乳杆菌cect5716对肠道caco-2细胞黏附实验操作同上。
[0110]
结果如图2所示，两歧双歧杆菌ai-91和乳双歧杆菌ai-01的组合、鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合、鼠李糖乳杆菌gg和发酵乳杆菌cect5716对肠道caco-2细胞黏附指数(菌体数目/100 caco-2 cells) 分别为2.52
×
103、1.20
×
103、1.11
×
103、5
×
102。
[0111]
实施例6
[0112]
共培养菌株对大肠杆菌的抑制作用
[0113]
将实施例1得到的-20℃冻存的甘油管菌株，接种复苏于正常mrs肉汤培养基中，进行3次转接活化培养，活化后的鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25按分别以1％接种体积接种mrs肉汤，37℃厌氧培养24h后取菌液上清；将生长至平衡期的大肠杆菌菌液用m’s缓冲液稀释100倍，取550 μl于营养琼脂平皿中，使用无菌棉签将菌液涂布均匀；待琼脂表面菌液晾干后，于平皿均匀放置4个牛津杯；每个牛津杯中加入200μl相应的益生菌菌液、上清、中性上清；放置37℃培养过夜测量平皿抑菌圈。动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91组合、鼠李糖乳杆菌gg和发酵乳杆菌cect5716对大肠杆菌的抑菌实验操作同上。
[0114]
结果见表19，鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合、两歧双歧杆菌ai-91和乳双歧杆菌ai-01的组合对大肠杆菌具有较好的抑菌效果，明显优于鼠李糖乳杆菌gg和发酵乳杆菌cet。
[0115]
表19益生菌组合对大肠杆菌的抑菌作用(单位：mm)
[0116][0117][0118]
实施例7
[0119]
共培养菌株对奇异变形杆菌的抑制作用
[0120]
将实施例1得到的-20℃冻存的甘油管菌株，接种复苏于正常mrs肉汤培养基中，进行3次转接活化培养，活化后的鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25按分别以1％接种体积接种mrs肉汤，37℃厌氧培养24h后取菌液上清；将生长至平衡期的奇异变形杆菌菌液用m’s缓冲液稀释5000倍，取550μl于营养琼脂平皿中，使用无菌棉签将菌液涂布均匀；待琼脂表面菌液晾干后，于平皿均匀放置4个牛津杯；每个牛津杯中加入200μl相应的益生菌菌液、上清、中性上清；放置37℃培养过夜测量平皿抑菌圈。动物双歧杆菌乳亚种ai-01和两歧双歧杆菌ai-91组合、鼠李糖乳杆菌gg和发酵乳杆菌cect5716对奇异变形杆菌的抑菌实验操作同上。
[0121]
结果见表20，鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合、两歧双歧杆菌ai-91和乳双歧杆菌ai-01的组合对奇异变形杆菌具有较好的抑菌效果，明显优于鼠李糖乳杆菌gg和发酵乳杆菌cet。
[0122]
表20益生菌组合对奇异变形杆菌的抑菌作用(单位：mm)
[0123][0124]
实施例8
[0125]
筛选适宜菌株的益生元
[0126]
通过在添加有1％益生元的mrs肉汤中培养每个组合菌株，将组合菌株 37℃培养24～48h，在试验期间，通过分光光度计测定培养物的浊度观察细菌生长，如表21所示，对于鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25组合最好的促进剂是1％的水苏糖、低聚果糖和菊粉；两歧双歧杆菌ai-91和乳双歧杆菌ai-01组合最好的促进剂是1％的低聚异麦芽糖、水苏糖、低聚果糖和异麦芽酮糖醇。
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表21益生元对活菌数的影响
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益生元ai-11
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ai-25ai-91
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ai-01低聚异麦芽糖+++水苏糖++++低聚果糖++++低聚木糖+-低聚半乳糖
‑‑
赤藓糖醇-+菊粉++-异麦芽酮糖醇++山梨糖醇-++木糖醇
‑‑
乳糖醇-+抗性糊精+-[0129]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。