1.本发明涉及饲料添加剂生产技术领域，特别是涉及一种利用冷水鱼内脏废弃物生产功能性饲料添加剂的方法。


背景技术：

2.与大宗淡水鱼相比，冷水鱼具有较高的营养价值和细嫩肉质，这使得冷水鱼市场前景广阔。冷水鱼的内脏包括：心、肝、肠、胃、鳔、胆等部位，总重量占到了整鱼的1/4～1/3，但其食用价值并不如鱼肉大，多作为废弃物，造成了资源的浪费和环境的污染。随着冷水鱼养殖规模的逐年扩大，如何有效地利用屠宰分割后的冷水鱼内脏废弃物成为了人们最为关注的问题。
3.相对于大众鱼类，冷水鱼养殖周期普遍较长，如俄罗斯鲟鱼饲养到产出鱼子酱则长达7年，这使得冷水鱼的器官组织营养成分极其丰富，富含多种必须氨基酸、必须脂肪酸、微量元素等，可作为家禽饲料中潜在的功能性添加剂。经过分割得到的冷水鱼内脏废弃物如不及时处理，极易腐败变质，失去进一步开发的价值。
4.现有技术中，提出了授权公告号为cn102349594b，授权公告日为2013年01月23日的中国发明专利文件，来解决上述存在的技术问题，该专利文献所公开的技术方案如下：一种鱼内脏的综合利用方法，它以鱼内脏为原料，原料经过适当清洗和绞碎，加入酸性蛋白酶水解和乳酸菌及酵母菌发酵，可以提取其中鱼油并制取功能性多肽饲料添加剂和鱼内脏蛋白饲料。
5.上述技术方案在实际使用过程中，会出现以下问题：（1）对比文件针对的原料为普通草鱼的内脏，该方案利用微生物的作用，分解鱼内脏酶解液，产生功能性的肽饲料，随机反应生产各类型的水解产物，水解产物不稳定，无法利用冷水鱼内脏中必须氨基酸充分的特点。
6.（2）该方案未经过发酵调控处理，发酵产物随机生成，未能有效富集功能性发酵产物。
7.（3）对比文件中，喷雾干燥生产的粉末产品中主要的功能性成分多为活性肽，不具备一定活力的乳酸菌细胞。


技术实现要素：

8.为解决上述技术问题，本发明提出了一种利用冷水鱼内脏废弃物生产功能性饲料添加剂的方法，将冷水鱼内脏废弃物经过快速的处理后，作为乳酸菌发酵底物，用以生产富含多种功能性成分的饲料添加剂，能有效解决产物不稳定和必须氨基酸利用不充分问题，并且产出中具备一定活力的乳酸菌细胞。
9.本发明是通过采用下述技术方案实现的：一种利用冷水鱼内脏废弃物生产功能性饲料添加剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a. 冷水鱼内脏进行打浆处理；b. 加入0.1%～0.3%w/w胰蛋白酶和0.02%～0.03%w/w的二丁基羟基甲苯，在30℃～35℃下，酶解5～6小时后，精滤后得到酶解精滤液；c. 配置鱼内脏液体培养基，配方如下：酶解精滤液：400～500份，蒸馏水：500～600份，葡萄糖：15～20份，酵母抽提物：2～3份，乙酸钠：3～4份，柠檬酸铵：2～3份，磷酸氢二甲：2～3份，硫酸镁：0.2～0.3份，硫酸锰：0.04～0.06份，二丁基羟基甲苯：0.1～0.2份；d. 待鱼内脏液体培养基完全溶解后，在110℃～115℃的温度和0.05mpa～0.07 mpa的压强下灭菌25～30分钟后，取出，冷却至室温，备用；e. 将乳酸菌菌种经过活化后，转接至mrs液体培养基中，增殖培养24～36小时后，按1:18～1:25的体积比，将增值后的液体培养基加入到步骤d的鱼内脏液体培养基中，厌氧培养10～14小时；f. 按1:5～1:10的重量比，加入10%浓盐水，使氯化钠的终浓度达到1%～2%，在25～30℃，保持1～2小时，得到发酵液；g. 将发酵液粗滤后，将聚合度为18～20的麦芽糊精、乳清蛋白、海藻糖和维生素c分别按照1：10～1：15、1：10～1：15、1：30～1：40和1：500～1：800的重量比加入，混合均匀后，进行喷雾干燥处理，得到粉末；h. 将步骤g得到的粉末按5:1～10:1的重量比与无水葡萄糖粉末混合，控制混合后的粉末的水分含量在5%以下，最后真空包装。
10.所述步骤a具体包括：将冷水鱼内脏清洗后沥干，将入0.3～0.5倍重量的蒸馏水和0.2～0.3倍重量的碎冰，打浆处理。
11.所述步骤a中的清洗具体指：按1:8w/w～1:10w/w的比例在清水中漂洗2～3次，所述清水中含有0.3
‰
～0.5
‰
异维c钠。
12.所述步骤a中将冷水鱼内脏清洗前还包括：宰杀分割，快速取出冷水鱼内脏，并置于-18℃～-25℃温度下，进行冻藏，备用；冻藏的冷水鱼内脏在冷藏条件下即3℃～5℃下进行自然解冻，待完全解冻后，进行清洗。
13.所述步骤b中的精滤具体指：用纱布粗滤2～3次，收集粗滤滤液，再用转鼓式微滤机进行精滤，得到酶解精滤液。
14.所述乳酸菌菌种包括乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌和干酪乳杆菌。
15.所述冷水鱼包括黑鱼、鲟鱼、三文鱼和鲑鳟鱼。
16.所述步骤g中的喷雾干燥处理具体指：利用高速离心式喷雾干燥机处理，控制进风量为30升～40升/小时，进料量为20毫升～30毫升/分钟，进风温度为140℃～160℃，出风温度为80℃～90℃。
17.所述步骤g中得到粉末后，将粉末在密闭金属盒内冷却至室温。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：1、以市面上常见的冷水鱼内脏为开发对象，结合冷水鱼组织器官蛋白质氨基酸资源优良的特点，将冷水鱼内脏酶解后作为目标乳酸菌的底物，通过调整发酵工艺参数（温度、盐含量、培养基成分等），将底物转化为具有抑菌功能和抗氧化功能的活性成分，如：细菌素和抗氧化肽等，相比于对比文件，本发明的目的性更强，产物明确，而非对比文件，仅依
靠微生物随机反应生产各类型的水解产物。
19.经过多次试验取平均值可知，最终本技术的饲料添加剂中粗蛋白含量达到30.5%；dpph自由基清除能力达到16.9%；以耐酸性的毕赤酵母为指示菌，真菌的抑菌能力，抑菌圈16.5毫米，产品中乳酸菌活菌数达到107～109cfu/g。
20.2、对比文件喷雾干燥生产的粉末产品中主要的功能性成分多为活性肽，而本发明乳酸菌发酵过程，还实现了目标乳酸菌的增殖，并通过添加保护剂（海藻糖、乳清蛋白、麦芽糊精等），提高乳酸菌在喷雾干燥和贮藏期内的活力，防止其大量死亡。因此，本发明最终产品中除了包含各类功能性代谢产物外，还包含了具有一定活力的乳酸菌细胞。
21.3、对比文件所针对的原料为普通草鱼的内脏，而本发明目的性的针对冷水鱼内脏，冷水鱼相比于普通草鱼，养殖周期更长，必须氨基酸更丰富，如：赖氨酸，更有利于作为目标乳酸菌的底物，从而更有利于被乳酸菌转化为功能性肽。
22.4、本发明中，目的性地优选了四种饲用安全的乳酸菌菌种，在发酵末期，通过添加一定浓度的食盐和调节温度，为乳酸菌营造一种特定的胁迫环境，使处于静止期的乳酸菌细胞将底物有效地转化为特定的生物活性成分。乳酸菌在发酵所产生的有机酸、细菌素等成分可称为天然的抑菌成分，替代或部分替代抗生素，除此之外，产品中还富含多种鱼内脏中和发酵过程中的功能性成分，如：活性肽、维生素、矿物质、必须脂肪酸等，达到家禽健康养殖的目的。
23.5、本发明将冷水鱼内脏的酶解物作为了乳酸菌生长的营养物质，替代或部分替代了昂贵的工业化培养基配料，降低了生产成本。
24.6、通过二丁基羟基甲苯的抗氧化和乳酸菌的厌氧发酵快速产酸的作用，避免了鱼内脏中的脂肪成分氧化哈败，解决了传统加酸方法影响后续生产的问题。
25.7、本发明中，在打浆处理过程中，添加了蒸馏水和碎冰，该添加量是根据冷水鱼内脏的特性进行的特殊设置，碎冰的加入，也可以抵消打浆过程中产生的热量，避免浆液中的活性物质高温失活。
26.8、 本发明中，鱼内脏液体培养基的配方是以酶解精滤液为主要氮源优化得到的乳酸菌培养配方，增加了二丁基羟基甲苯和单硬脂肪甘油酯，其中二丁基羟基甲苯的作用抗氧化，避免酶解精滤液功能性脂质等活性物质被氧化失活，单硬脂肪甘油酯的作用乳化，使整个液体培养基体系更稳定，不易发生分层或沉淀。
27.9、本发明中，将干燥后的粉末与无水葡萄糖粉末进行混合，达到调质的目的，使高湿的乳酸菌菌粉和低湿的无水葡萄糖粉末，降低乳酸菌粉末的水分含量，达到有效保存乳酸菌的目的。
附图说明
28.下面将结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，其中：图1为本发明的流程示意图。
具体实施方式
29.实施例1作为本发明基本实施方式，本发明包括一种利用冷水鱼内脏废弃物生产功能性饲
料添加剂的方法，包括以下步骤：a. 冷水鱼内脏进行打浆处理，其中冷水鱼具体为黑鱼。
30.b. 加入0.1%w/w胰蛋白酶和0.02%w/w的二丁基羟基甲苯，在30℃下，酶解5小时后，精滤后得到酶解精滤液。
31.c. 配置鱼内脏液体培养基，配方如下：酶解精滤液400份，蒸馏水500份，葡萄糖15份，酵母抽提物2份，乙酸钠3份，柠檬酸铵2份，磷酸氢二甲2份，硫酸镁0.2份，硫酸锰0.04份，二丁基羟基甲苯0.1份。
32.d. 待鱼内脏液体培养基完全溶解后，在110℃的温度和0.05mpa的压强下灭菌25分钟后，取出，冷却至室温，备用。
33.e. 将乳酸菌菌种经过活化后，转接至mrs液体培养基中，增殖培养24小时后，按1:18的体积比，将增值后的液体培养基加入到步骤d的鱼内脏液体培养基中，在37℃下厌氧培养10～14小时。
34.f. 按1:5的重量比，加入10%浓盐水，使氯化钠的终浓度达到1%，在25℃，保持1小时，得到发酵液。
35.g. 将发酵液粗滤后，将聚合度为18的麦芽糊精、乳清蛋白、海藻糖和维生素c分别按照1：10、1：10、1：30和1：500的重量比加入，混合均匀后，进行喷雾干燥处理，得到粉末。
36.h. 将步骤g得到的粉末按5:1的重量比与无水葡萄糖粉末混合，控制混合后的粉末的水分含量在5%以下，最后真空包装。
37.实施例2作为本发明一较佳实施方式，本发明包括一种利用冷水鱼内脏废弃物生产功能性饲料添加剂的方法，包括以下步骤：a. 冷水鱼内脏进行打浆处理，具体为：将鲟鱼内脏清洗后沥干，将入0.3倍重量的蒸馏水和0.2倍重量的碎冰，打浆处理。其中，清洗具体指：按1:8w/w的比例在清水中漂洗2～3次，所述清水中含有0.3
‰
异维c钠。
38.b. 加入0.3%w/w胰蛋白酶和0.03%w/w的二丁基羟基甲苯，在35℃下，酶解6小时后，用纱布粗滤2～3次，收集粗滤滤液，再用转鼓式微滤机进行精滤，得到酶解精滤液。
39.c. 配置鱼内脏液体培养基，配方如下：酶解精滤液500份，蒸馏水6 00份，葡萄糖20份，酵母抽提物3份，乙酸钠4份，柠檬酸铵3份，磷酸氢二甲3份，硫酸镁0.3份，硫酸锰0.06份，二丁基羟基甲苯 0.2份。
40.d. 待鱼内脏液体培养基完全溶解后，在115℃的温度和0.07 mpa的压强下灭菌30分钟后，取出，冷却至室温，备用。
41.e. 将乳酸菌菌种经过活化后，转接至mrs液体培养基中，增殖培养36小时后，按1:25的体积比，将增值后的液体培养基加入到步骤d的鱼内脏液体培养基中，厌氧培养14小时。
42.f. 按1:10的重量比，加入10%浓盐水，使氯化钠的终浓度达到2%，在30℃，保持2小时，得到发酵液。
43.g. 将发酵液粗滤后，将聚合度为20的麦芽糊精、乳清蛋白、海藻糖和维生素c分别按照1：15、1：15、1：40和1：800的重量比加入，混合均匀后，进行喷雾干燥处理，得到粉末。
44.h. 将步骤g得到的粉末按10:1的重量比与无水葡萄糖粉末混合，控制混合后的粉
末的水分含量在5%以下，最后真空包装。
45.实施例3作为本发明另一较佳实施方式，本发明包括一种利用冷水鱼内脏废弃物生产功能性饲料添加剂的方法，包括以下步骤：a. 三文鱼内脏进行打浆处理。
46.b. 加入0.2%w/w胰蛋白酶和0.02%%w/w的二丁基羟基甲苯，在32℃下，酶解5.5小时后，精滤后得到酶解精滤液。
47.c. 配置鱼内脏液体培养基，配方如下：酶解精滤液450份，蒸馏水520份，葡萄糖16份，酵母抽提物3份，乙酸钠3.5份，柠檬酸铵2份，磷酸氢二甲3份，硫酸镁0.23份，硫酸锰0.05份，二丁基羟基甲苯0.15份。
48.d. 待鱼内脏液体培养基完全溶解后，在113℃的温度和0.06 mpa的压强下灭菌28分钟后，取出，冷却至室温，备用。
49.e. 将乳酸菌菌种经过活化后，转接至mrs液体培养基中，增殖培养24～36小时后，按1:20的体积比，将增值后的液体培养基加入到步骤d的鱼内脏液体培养基中，厌氧培养12小时。
50.f. 按1:6的重量比，加入10%浓盐水，使氯化钠的终浓度达到1%，在30℃，保持1.2小时，得到发酵液。
51.g. 将发酵液粗滤后，将聚合度为19的麦芽糊精、乳清蛋白、海藻糖和维生素c分别按照1：11、1：13、1：35和1：600的重量比加入，混合均匀后，进行喷雾干燥处理，得到粉末，将粉末在密闭金属盒内冷却至室温。其中，喷雾干燥处理具体指：利用高速离心式喷雾干燥机处理，控制进风量为30升～40升/小时，进料量为20毫升～30毫升/分钟，进风温度为140℃～160℃，出风温度为80℃～90℃。
52.h. 将步骤g得到的粉末按6:1的重量比与无水葡萄糖粉末混合，控制混合后的粉末的水分含量在5%以下，最后真空包装。
53.实施例4作为本发明最佳实施方式，参照说明书附图1，本发明包括一种利用冷水鱼内脏废弃物生产功能性饲料添加剂的方法，包括以下步骤：a. 冷水鱼内脏进行打浆处理，其中冷水鱼具体为鲑鳟鱼。
54.冷水鱼经过宰杀分割后，快速取出内脏，并置于-18℃～-25℃温度下，进行冻藏，备用。通过冷冻进行暂存，以保障其中的活性成分不损失。冻藏的冷水鱼内脏在冷藏条件下即3℃～5℃下进行自然解冻，待完全解冻后，按1:10w/w的比例在清水中漂洗2～3次，进行清洗，清洗后进行沥干。所述清水中含有0.5
‰
异维c钠，异维c钠抗氧化剂的加入，能防止清洗过程中，活性物质被氧化失活。
55.用刀将清洗后的冷水鱼内脏预切至约为3
×3×
3厘米的肉粒，置于肉浆机中，加入0.4倍重量的蒸馏水和0.25倍重量的碎冰，在300～500转/分钟下打浆处理20～30分钟。其中肉浆机可以选用诸城市东城机械科技有限公司中的dj-100型。打浆过程中，打浆机里面的转子高速转动，摩擦生热，将入碎冰可以抵消打浆过程中产生的热量，避免浆液中的活性物质高温失活，并且碎冰和水的添加量与冷水鱼内脏的特性具有很大的相关性。
56.b. 加入0.2%w/w胰蛋白酶和0.025%w/w的二丁基羟基甲苯，在30℃～35℃下，酶解
5～6小时后，用纱布粗滤2～3次，收集粗滤滤液，再用转鼓式微滤机进行精滤，得到酶解精滤液。其中，胰蛋白酶可以选用香港盛夏生物科技有限公司中的工业级的。转鼓式微滤机可以选用山东堂正环境工程有限公司中的tzwl型。
57.c. 配置鱼内脏液体培养基，配方如下：酶解精滤液450份，蒸馏水550份，葡萄糖18份，酵母抽提物2.5份，乙酸钠3.5份，柠檬酸铵2.5份，磷酸氢二甲2.5份，硫酸镁0.25份，硫酸锰0.05份，二丁基羟基甲苯0.15份。该配方是以酶解精滤液为主要氮源优化得到的乳酸菌培养配方，增加了二丁基羟基甲苯和单硬脂肪甘油酯，其中二丁基羟基甲苯的作用抗氧化，避免酶解精滤液功能性脂质等活性物质被氧化失活，单硬脂肪甘油酯的作用乳化，使整个液体培养基体系更稳定，不易发生分层或沉淀。
58.d. 待鱼内脏液体培养基完全溶解后，在115℃的温度和0.07 mpa的压强下灭菌25～30分钟后，取出，冷却至室温，备用。
59.e. 选择乳酸菌菌种，所述乳酸菌菌种包括四种，即乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌和干酪乳杆菌。上述四种乳酸菌菌种经过活化后，转接至mrs液体培养基中，在37℃下增殖培养24～36小时，使乳酸菌细胞浓度增高，以便产生更多的活性成分。最后按1:20的体积比，将增值后的液体培养基加入到步骤d的鱼内脏液体培养基中，在37℃下厌氧培养10～14小时。
60.f. 按1:8的重量比，加入10%浓盐水，使氯化钠的终浓度达到1.5%，在25～30℃，保持1～2小时，得到发酵液。
61.g. 将发酵液通过纱布粗滤后，将聚合度为18～20的麦芽糊精、乳清蛋白、海藻糖和维生素c分别按照1：15、1：10、1：40和1：700的重量比加入，混合均匀后，进行喷雾干燥处理，即利用高速离心式喷雾干燥机处理，控制进风量为30升～40升/小时，进料量为20毫升～30毫升/分钟，进风温度为140℃～160℃，出风温度为80℃～90℃，得到淡黄色粉末后，在密闭金属盒内冷却至室温，避免其吸潮。所述高速离心式喷雾干燥机可以选用无锡市大峰喷雾干燥设备有限公司中的dfr型。
62.h. 由于刚喷雾干燥出来的乳酸菌粉末水分含量通常高达8%以上，而乳酸菌粉末有效保存的水分含量越低越好，将步骤g得到的粉末按8:1的重量比与无水葡萄糖粉末混合，降低乳酸菌粉末的水分含量，控制混合后的粉末的水分含量在5%以下，达到有效保存乳酸菌的目的，最后真空包装于铝箔袋内。
63.通过多次试验，对最终的功能性饲料添加剂进行检测，得到的关键指标如下：（1）粗蛋白含量达到30.5%，（2）dpph自由基清除能力达到16.9%，（3）真菌的抑菌能力，抑菌圈16.5毫米（以耐酸性的毕赤酵母为指示菌），（4）乳酸菌活菌数达到107～109cfu/g。
64.综上所述，本领域的普通技术人员阅读本发明文件后，根据本发明的技术方案和技术构思无需创造性脑力劳动而作出的其他各种相应的变换方案，均属于本发明所保护的范围。