本发明大体上涉及超声造影剂(USCA)的领域。具体而言，本发明涉及一种包含两亲性材料和冻干保护性组分的混合物的冻干组合物，其可被重构以制备具有标准化尺寸的充气微泡的悬浮液，可用于诊断或治疗应用中。本发明进一步涉及制备这种冻干组合物的方法。发明背景标准化尺寸微泡(CMV)是新一代的气体微泡，相比于市售的多分散微泡超声造影剂(USCA)，它具有狭窄的标准化且可控的尺寸分布(平均尺寸介于3与8μm之间)。这些标准化尺寸微泡被设计成增强成像灵敏度并且改进药物和基因递送至特定器官的效率。标准化微泡可使用各种技术来产生：倾析，机械过滤，离心，气泡分选和流动聚焦。具体而言，流动聚焦技术允许以可高度重现的方式、以合理的生产率(每分钟约六千万个气泡)制造标准化微泡(通常具有介于1.05与1.08之间的几何标准差(GSD)值，具有对于后续使用可接受的悬浮微泡的浓度(例如介于3×108个CMV/mL与4×108个CMV/mL之间)。申请人名下的参考文献1[WO2018/041906A1-BRACCOSUISSESA]和参考文献2[PCT申请号PCT/EP2019/055325]描述了制备CMV、诸如充气微泡的方法，具体而言是通过使用微流控技术。尽管标准化微泡的水性悬浮液在室温下持续数周高度稳定，但对于一般期望更长货架期的药剂开发，这种稳定性可能造成一些限制。因此需要开发长期存储程序。冷冻干燥、也称为冻干是一种复杂且有挑战性的方法，广泛用于制药工业，具有以干燥形式保存药剂数月的优点。事实上，冻干产品展示出更高的存储稳定性并且可容易地运送。冻干还用于充气微泡的领域中，用于制备冻干剂型，其随后在气体的存在下用水性溶剂重构，以形成充气微泡的悬浮液。参考文献3[US2017/080113A1-GEHealthcare]描述了制备具有调节尺寸的微泡的悬浮液，并且随后用其蔗糖溶液冻干。参考文献4[WO97/29782A1-NICOMEDIMAGINGA/S]教导了在室温(RT)下稳定的USCA前体可通过在冻干性稳定剂、优选蔗糖的存在下冻干C3F8微泡来制备。到目前为止，据申请人所知，由标准化微泡的悬浮液制备冻干组合物的这种技术尚未被应用。如申请人所观察到的，制备标准化微泡的冻干组合物中最有挑战性的问题之一涉及需要避免对标准化微泡的初始悬浮液的诸如浓度、单分散性或几何标准差(GSD)和/或最终平均直径的特性进行显著修改。申请人现已发现，这类初始特性可通过使用冻干保护性组分的适合混合物而在冻干过程后保持在可接受的程度。技术实现要素：在第一个方面中，本发明涉及包含两亲性材料和冻干保护性组分的冻干组合物，其在生物相容性气体的存在下用药学上可接受的溶液重构后提供标准化充气微泡的悬浮液，其中所述冻干保护性组分为至少两种冻干保护性组分的混合物，并且其中所述重构的标准化充气微泡的悬浮液具有低于1.2的几何标准差(GSD)。在本发明的优选实施方案中，冻干保护性组分的混合物包含聚合物、优选亲水的聚合物、更优选聚二醇，和多元醇或糖。在仍更优选的实施方案中，所述混合物包含聚乙二醇(PEG)和山梨醇或PEG和蔗糖。在优选的实施方案中，所述重构的标准化微泡的悬浮液由至少1.2或更低、优选至少1.15、低至例如1.1的GSD来表征。在本发明的实施方案中，所述重构的标准化微泡的悬浮液由至少2.0×108个CMV/mL、优选2.25×108个CMV/mL、更优选2.5×108个CMV/mL、至多5.5×108个CMV/mL的浓度来表征。根据另外的方面，本发明涉及一种制备用于制备重构的标准化充气微泡的悬浮液的冻干组合物的方法，所述方法包括以下步骤：a.制备包含冻干保护性组分的混合物的标准化充气微泡的悬浮液；b.冻干标准化微泡悬浮液。本发明的另一个方面涉及一种用于制备标准化充气微泡的悬浮液的冻干组合物，所述冻干组合物能够通过包括以下步骤的方法来获得:a.通过流动聚焦法制备充气标准化微泡的第一悬浮液，所述悬浮液还包含冻干保护性组分的混合物，并且b.冻干所述悬浮液。本发明的另一个方面涉及一种制备包含充气微泡悬浮液的可注射造影剂的方法，其中所述方法包括在生物相容性气体的存在下用药学上可接受的溶液重构如上文定义的冻干组合物。附图图1是典型的颗粒尺寸分布图示。图2是微流控流动聚焦装置的核心部分的示意性图示。图3是可用于本发明技术的方法的装置的示例性示意图。发明详述措辞“充气微泡”一般指代被极薄的包膜(薄膜)限制在气/液界面处的气泡，包膜涉及设置在气体-液体界面处的通常为磷脂的稳定性两亲材料。所述标准化充气微泡适合作为造影剂用于超声成像技术、被称为造影增强的超声(CEUS)成像，或用于治疗应用中，例如与超声介导的药物递送组合。这些被稳定的气泡(分散于合适的生理溶液中)在本领域中一般用各种术语来指代，通常取决于制备它们所用的稳定化材料；这些术语包括例如“微球”、“微气泡”、“微胶囊”或“微珠”，在此整体被称为“充气微泡”(或简称“微泡”)。术语“标准化”(在指代充气微泡时)具体地指代具有高度标准化微泡(CMV)的微泡悬浮液，所述标准化微泡具有介于3与8μm之间的不同尺寸，由具有至少1.2或更低、优选至少1.1、低至例如1.05的几何标准差(GSD)的尺寸分布来表征。在本说明书和权利要求书中，术语“标准化”可与“尺寸可控的”、“单分散性”或“单一粒度的”微泡交换使用。在本发明中，优选使用微流控流动聚焦技术产生标准化充气微泡，其中在流动聚焦装置中气体线被聚焦于两个液体流之间，并且形成了磷脂稳定的标准化微泡并在出口通道中收集。通过这种方法，以可高度重现的方式、以合理的生产率(每分钟约六千万个气泡)制造出标准化微泡(图2和图3)。取决于制造过程和装置的参数，可获得的标准化微泡具有在任何期望平均直径周围的相对狭窄的尺寸分布，例如3至8μm、优选约4μm。所述标准化微泡的尺寸分布通常由至少1.2或更低、优选至少1.1、低至例如1.05的几何标准差(GSD)值来表征。标准化微泡浓度(特别是在用微流控流动聚焦生产时)通常包含在3×108与4×108个CMV/mL之间，优选接近4×108个CMV/mL，不低于3×108个CMV/mL。“几何标准差”(GSD)一般提供用于表征在颗粒(具体情况下是充气微泡)的群体中尺寸分布的迹象的合适值。因此，与在平均值周围狭窄分布的颗粒尺寸(即，尺寸相对类似)相比，具有宽尺寸范围的颗粒群体的GSD值更大。图1示出充气微泡的群体的尺寸分布图(体积计)的实例，其可利用市售测量装置(例如CoulterCounterMultisizer3，配备有Multisizer3软件)，通过测定其通道的每一者的气体体积来获得，每个通道对应于预定直径的微泡(例如递增0.1微米)。通过测定悬浮液中标准化充气微泡的数量、它们各自的直径和选定尺寸范围(例如对于4.5μmCMV平均直径，介于3μm与6μm之间)内的体积分布，可通过使用以下等式1计算CMV分布的GSD：等式1其中：ni＝第i个通道测量的微泡中截留的气体体积(相对于总体)的百分数xi＝第i个通道中微泡的体积，其中等式1.1.xi＝di3.π/6(di＝在第i个通道中央的微泡的直径)其中：等式1.2.在各种市售测量装置之中，配备有Multisizer3软件的CoulterCounterMultisizer3能够如上文定义的计算并提供这种GSD值。例如，对于4μm的平均直径，1.2的GSD值指示约50％的CMV被标准化在2.5与5μm之间；1.05-1.08(<1.1)的GSD指示约90-95％的CMV具有包含在2.5与5μm之间的尺寸。本文所用的措辞“微泡浓度”指的是使用CoulterCounter设备测定的一体积单位中CMV的数量，即CMV数/mL。如申请人所观察到的，虽然通过微流控流动聚焦获得的所述标准化微泡可在室温下存储数周而不显著影响其主要特性，但在所述存储时段后所述微泡的特性(例如浓度和尺寸分布)可能不被保持并可能逐渐劣化。因此，对于药剂而言这类充气微泡悬浮液的货架期相对较短，并且需要开发长期存储程序，能够使诸如浓度、GSD和最终直径的CMV初始特性保持更长的时间、例如数月或数年。冻干法是一种获得标准化微泡干燥形式的合适的方式，具有随时间增加的稳定性并保持了初始特性。现已意外地发现，通过使用冻干保护性组分的适合组合，相比于使用相同冻干保护性组分作为单一添加剂的冻干过程，可在冻干过程后大致上保持诸如浓度、GSD和最终直径的CMV初始特性。在第一个方面中，本发明提供一种包含两亲性材料和冻干保护性组分的混合物的冻干组合物，其在生物相容性气体的存在下用合适的水性溶液重构后提供标准化充气微泡的悬浮液，其中所述微泡具有至少1.2或更低、优选至少1.15，低至例如1.1的GSD值。在本说明书和权利要求书中，术语“冻干”和“冷冻干燥”可交换使用。冻干组合物如本文所用，措辞“冻干组合物”指示通过冻干法获得的用于长期存储充气微泡制剂的任何干燥剂型。所述冻干组合物可包含一种或多种活性成分和至少两种冻干保护性组分的混合物。本文所用的措辞“活性成分”指示微泡稳定性材料，例如两亲性材料，其被包含在具有冻干保护性组分的冻干组合物中。冻干保护性组分的混合物如本文所用，措辞“冻干保护性组分的混合物”指的是适合于冷冻干燥的至少两种组分的组合，其在冻干过程前被包括在微泡悬浮液中。术语“冻干保护性组分”表示在冻干过程的任何阶段中被添加以保护活性成分的任何化合物。合适的冻干保护性组分的实例是聚乙二醇(PEG)、多元醇、糖类、表面活性剂、缓冲剂、氨基酸、鳌合物和无机盐。根据本发明的实施方案，所述冻干保护性组分的混合物为适合于冷冻干燥的至少两种不同化合物的组合，所述冻干保护性组分选自聚合物、多元醇和糖类。优选所述混合物包含聚合物与多元醇或糖的组合。在本发明的优选实施方案中，冻干保护性组分的混合物的组分之一为聚合物，优选亲水的聚合物，更优选聚二醇。在仍更优选的实施方案中，所述聚二醇为聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇(PEG)具有其标准化学含义。PEG的化学式是HOCH2(CH2OCH2)mCH2OH，其中m表示氧化乙烯基的平均数。典型的聚乙二醇可以从190-210g/mol(PEG200，m＝4.2)至7000-9000g/mol(PEG8000，m＝181.4)的各种各样的平均分子量得到。根据本说明书，措辞“分子量”指示PEG聚合物链的平均长度，具有对所指分子量±10％的可变性。根据本发明的实施方案，冻干保护性组分的混合物优选包含具有包含在2000与10000g/mol之间、优选在4000与8000g/mol之间的分子量的PEG。根据一个实施方案，冻干保护性组分是具有8000g/mol(±10％)的分子量的PEG。根据另一个实施方案，冻干保护性组分是具有接近4000g/mol(±10％)的分子量的PEG。在本发明的实施方案中，作为具有包含在100mg/mL与300mg/mL之间、优选在120mg/mL与250mg/mL之间、更优选接近200mg/mL的浓度的溶液，将冻干保护性组分的混合物加入CMV的悬浮液。正如申请人所观察到的，浓度为150mg/mL或更高(例如200mg/mL)的聚合物(特别是聚二醇，例如PEG)悬浮液，由于其相对高的粘度，在工业过程中可能难以处理。因此，优选继续使用浓度低于150mg/mL的聚合物悬浮液。为了改进冻干过程后重构的CMV悬浮液的初始特性的保存性，申请人发现优选使用浓度低于150mg/mL(例如100mg/mL)的PEG与第二冻干保护性组分组合的合适混合物。在本发明的优选实施方案中，冻干组合物包括冻干保护性组分的混合物，该混合物是聚合物、优选聚二醇与多元醇的组合。在本说明书和权利要求书中，术语“多元醇”具有其常规化学含义；指示具有多于两个羟基官能团的任何有机化合物，由通式HOCH2(CHOH)nCH2OH来表征，其中n为1至6、优选2至4的整数。多元醇的链长不同，即四碳、五碳或六碳链。它们具有连接至每个碳的一个羟基。多元醇可以通过这些羟基的相对方向(立体化学)进一步加以区分。合适的多元醇包括赤藓醇、木糖醇、山梨醇、乳糖醇和甘露醇。在本发明中，所述多元醇优选选自具有四至六个碳原子的碳链长度的多元醇的组。在仍更优选的实施方案中，所述多元醇是山梨醇或木糖醇。术语“山梨醇”在化学领域具有其常规含义。山梨醇，或(2R,3R,4R,5S)-己烷-1,2,3,4,5,6-己醇，是一种多元醇，由具有6个碳原子的线性碳链组成，每个碳原子被一个羟基功能团取代。它的分子量为182.172g/mol。山梨醇天然存在，也可从葡萄糖中合成生产。它与甘露醇是同分异构体。术语“木糖醇”在化学领域具有其常规含义。木糖醇，或(2S,4R)-戊烷-1,2,3,4,5-戊醇，是一种五碳的糖醇，其中分子中的五个碳原子都结合了羟基。其分子量为152.146克/摩尔。在另一个实施方案中，冻干组合物包括聚合物与糖类的混合物。术语“糖类”具有其在化学领域中的标准含义。糖类也被称为碳水化合物，是由碳、氢和氧仅三种元素组成的分子化合物。最简单的糖类被称为单糖，并且它们是诸如二糖、三糖和多糖的更大的糖的构造单元。优选地，所述糖类选自二糖、三糖和多糖，更优选二糖或三糖。单糖具有一般的分子式(CH2O)n，其中n可以是3、5或6。单糖可以通过羰基与OH基团的反应形成环状结构。这些环状分子可以反过来与另外的醇反应。单糖的合适实例包括葡萄糖、果糖和半乳糖。双糖(C12H22O11)是由通过糖苷键连接的两个单糖单元组成的糖类。糖苷键是一种共价键，由一个环状单糖的异构碳与第二单糖的羟基反应形成。二糖在其单糖成分和连接它们的特定类型的糖苷键方面彼此不同。二糖的实例包括：麦芽糖、乳糖和蔗糖。在二糖中特别优选的是蔗糖。三糖是由三个单糖组成的糖类，有两个糖苷键连接单糖。与二糖类似，每个糖苷键可以在组分单糖上的任何羟基之间形成。即使所有三种组分糖都是相同的(如葡萄糖)，不同的键组合(区域化学)和立体化学(α-或β-)也会导致三糖是具有不同化学和物理性质的非对映异构体。三糖的实例有麦芽三糖、松三糖、麦芽三酮糖(maltotriulose)和棉子糖。在三糖中特别优选的是棉子糖。多糖是由通过糖苷键结合在一起的单糖单元的长链组成的聚合糖分子。它们的结构范围从线性到高度支化。多糖的实例有：淀粉、纤维素、葡聚糖和甲壳素。在多糖中特别优选的是葡聚糖。在本发明的优选实施方案中，所述糖类是双糖，更优选是蔗糖。在本发明中，术语“蔗糖”是其标准含义。蔗糖是一种二糖，由通过从葡萄糖的半缩醛到果糖的半缩醛的乙缩醛氧桥连接的葡萄糖和果糖单元而成。蔗糖的经验式为C12H22O11，分子量为342.30g/mol。当使用冻干保护性组分的混合物时，初始的CMV特性特别得以保持，其特征在于所述冻干保护性组分的混合物的总浓度包含在100mg/mL和300mg/mL之间，优选120mg/mL和250mg/mL之间，更优选PEG和多元醇或PEG和糖类的总浓度为200mg/mL。在优选的实施方案中，冻干保护性组分的混合物包含PEG和多元醇或PEG和糖类，其比例在2:1至2:3之间，优选3:2至4:5之间，更优选1:1。上述冻干保护性组分的混合物在用于标准化微泡悬浮液的冻干过程中显示出有利的结果，以制备冻干组合物，然后可以重构以获得在浓度和尺寸分布方面具有可接受特性的标准化微泡的悬浮液。两亲性材料适合于形成充气微泡的稳定性层的材料(即，微泡稳定性材料)是本领域已知的那些。这些优选包括两亲性材料。本文所用的术语“两亲性材料”包括具有带有能够与水性介质相互作用的亲水极性头部(例如极性或离子型基团)和能够与例如有机溶剂相互作用的疏水有机尾部(例如烃链)的分子的化合物。因此，这些化合物一般充当“表面活性剂”，即能够使一般不混溶材料的混合物稳定的化合物，所述混合物诸如两种不混溶液体的混合物(例如水和油)、液体与气体的混合物(例如在水中的微气泡)或液体与不溶性颗粒的混合物(例如在水中的金属纳米颗粒)。合适的两亲性材料包含例如：磷脂；溶血磷脂；脂肪酸，诸如棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸或油酸；带有诸如壳多糖、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)的聚合物的脂质，最后者也称为“聚乙二醇化脂质”；带有磺酸化单糖、二糖、寡糖或多糖的脂质；胆固醇，胆固醇硫酸盐或胆固醇半琥珀酸盐；生育酚半琥珀酸盐；具有醚或酯连接的脂肪酸的脂质；聚合脂质；二乙酰基磷酸酯；二鲸蜡基磷酸酯；神经酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯(诸如聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯)，聚氧乙烯脂肪醇，聚氧乙烯脂肪醇醚，聚氧乙烯化的山梨醇酐脂肪酸酯，甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯，乙氧基化大豆固醇，乙氧基化蓖麻油或氧化乙烯(EO)和氧化丙烯(PO)嵌段共聚物；糖酸的固醇酯，包括胆固醇葡糖苷酸、羊毛固醇葡糖苷酸、7-脱氢胆固醇葡糖苷酸、麦角固醇葡糖苷酸、胆固醇葡糖酸酯、羊毛固醇葡糖酸酯或麦角固醇葡糖酸酯；糖酸和醇的酯，包括月桂基葡糖苷酸、硬脂酰葡糖苷酸、肉豆蔻酰葡糖苷酸、月桂基葡糖酸酯、肉豆蔻酰葡糖酸酯或硬脂酰葡糖酸酯；糖与脂族酸的酯，包括蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯，葡糖醛酸、葡糖酸或多缩糖醛酸；皂苷，包括菝契皂苷元、异菝葜皂苷元、常春藤皂苷元、齐墩果酸或洋地黄毒苷元；甘油或与脂肪酸的甘油单酯，包括单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯或单月桂酸甘油酯；长链醇，包括正癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇或正十八烷醇；6-(5-胆甾烯-3β-基氧基)-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；二半乳糖基甘油二酯；6-(5-胆甾烯-3β-基氧基)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；6-(5-胆甾烯-3β-基氧基)己基-6-氨基-6-脱氧基-1-硫代-β-D-吡喃甘露糖苷；12-(((7'-二乙氨基香豆素-3-基)羰基)甲氨基)十八烷酸；N-[12-(((7'-二乙氨基香豆素-3-基)羰基)甲氨基)十八烷酰]-2-氨基棕榈酸；N-琥珀酰二油酰磷脂酰乙醇胺；1,2-二油酰-sn-甘油；1,2-二棕榈酰-sn-3-琥珀酰甘油；1,3-二棕榈酰-2-琥珀酰甘油；1-十六烷基-2-棕榈酰甘油磷酸乙醇胺或棕榈酰高半胱氨酸；包含至少一个(C10-C20)、优选(C14-C18)烷基链的烷基胺或烷基铵盐，诸如像N-硬脂胺、N,N'-二硬脂胺、N-十六烷基胺、N,N'-双十六烷基胺、N-硬脂基氯化铵、N,N'-二硬脂基氯化铵、N-十六烷基氯化铵、N,N'-双十六烷基氯化铵、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；包含一个或优选两个通过(C3-C6)亚烷基桥连接至N原子的(C10-C20)、优选(C14-C18)酰基链的叔或季铵盐，诸如像1,2-二硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、1,2-二棕榈酰-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、1,2-油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂酰-3-二甲基铵-丙烷(DSDAP)；和它们的混合物或组合。根据本发明，两亲性材料优选为磷脂。术语“磷脂”意图涵盖任何两亲性磷脂化合物，其分子能够在最终微泡悬浮液中的气-水界面处形成稳定性材料膜(通常呈单分子层的形式)。因此，这些材料在本领域中也称为“成膜磷脂”。合适的磷脂的实例包括甘油与一个或优选两个(相同或不同的)脂肪酸残基以及与磷酸的酯，其中磷酸残基又与亲水基团结合，诸如像胆碱(磷脂酰胆碱-PC)、丝氨酸(磷脂酰丝氨酸-PS)、甘油(磷脂酰甘油-PG)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺-PE)、肌醇(磷脂酰肌醇)。仅具有一个脂肪酸残基的磷脂的酯在本领域中通常称为磷脂的“溶血”形式或“溶血磷脂”。磷脂中存在的脂肪酸残基通常为长链脂族酸，通常含有12至24个、优选14至22个碳原子；脂族链可含有一个或多个不饱和度或优选为完全饱和的。包括在磷脂中的合适的脂肪酸的实例是例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。优选地，采用诸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸的饱和脂肪酸。磷脂的另外实例为磷脂酸，即甘油磷酸与脂肪酸的二酯；鞘脂，诸如鞘磷脂，即其中甘油二酯与脂肪酸的残基被神经酰胺链取代的那些磷脂酰胆碱类似物；心磷脂，即1,3-二磷脂酰甘油与脂肪酸的酯；糖脂，诸如神经节苷脂GM1(或GM2)或脑苷脂；葡萄糖脂；硫酸脑苷脂和鞘糖脂。如本文所用，术语“磷脂”包括可单独采用或作为混合物采用的天然存在的、半合成的或合成制备的产物。天然存在的磷脂的实例为天然卵磷脂(磷脂酰胆碱(PC)衍生物)，诸如通常的大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。半合成磷脂的实例为天然存在的卵磷脂的部分或完全氢化的衍生物。优选的磷脂为磷脂酰胆碱、乙基磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或鞘磷脂的脂肪酸二酯。优选磷脂的实例是例如：二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC)，双十五烷酰基磷脂酰胆碱(DPDPC)，1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)，1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)，1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)，1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)，1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)，1-油酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(OPPC)，二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)及其碱金属盐，二花生酰磷脂酰甘油(DAPG)及其碱金属盐，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)及其碱金属盐，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)及其碱金属盐，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)及其碱金属盐，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)及其碱金属盐，二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)及其碱金属盐，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)及其碱金属盐，二硬脂酰磷脂酸(DSPA)，二花生酰磷脂酸(DAPA)及其碱金属盐，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二花生酰磷脂酰乙醇胺(DAPE)，二亚油酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)，二花生酰磷脂酰丝氨酸(DAPS)，二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)，二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)，二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)，二棕榈酰鞘磷脂(DPSP)，和二硬脂酰鞘磷脂(DSSP)，二月桂酰磷脂酰肌醇(DLPI)，二花生酰磷脂酰肌醇(DAPI)，二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇(DMPI)，二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)，二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)，二油酰磷脂酰肌醇(DOPI)。合适的磷脂还包括通过将诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)的亲水聚合物连接到其上而改性的磷脂。优选的聚合物改性磷脂包括“聚乙二醇化磷脂”，即与PEG聚合物结合的磷脂。聚乙二醇化磷脂的实例是聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(简称“PE-PEG”)，即其中亲水性乙醇胺结构部分与可变分子量(例如300至20000道尔顿，优选500至5000道尔顿)的PEG分子连接的磷脂酰乙醇胺，诸如DPPE-PEG(或DSPE-PEG、DMPE-PEG、DAPE-PEG或DOPE-PEG)。例如，DPPE-PEG2000指的是连接有平均分子量为约2000的PEG聚合物的DPPE。特别优选的磷脂为DAPC、DSPC、DPPC、DMPA、DPPA、DSPA、DMPG、DPPG、DSPG、DMPS、DPPS、DSPS和乙基-DSPC。最优选的为DPPG、DPPS和DSPC。还可使用磷脂的混合物，诸如像DPPE和/或DSPE(包括聚乙二醇化衍生物)、DPPC、DSPC和/或DAPC与DSPS、DPPS、DSPA、DPPA、DSPG、DPPG、乙基-DSPC和/或乙基-DPPC的混合物。例如，磷脂的混合物可包括磷脂酰胆碱衍生物、磷脂酸衍生物和聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺，例如DSPC/DPPA/DPPE-PEG、DPPC/DPPA/DPPE-PEG、DSPC/DPPA/DSPE-PEG、DPPC/DPPA/DSPE-PEG、DAPC/DPPA/DPPE-PEG、DAPC/DPPA/DSPE-PEG、DSPC/DSPA/DPPE-PEG、DPPC/DSPA/DSPE-PEG、DSPC/DSPG/DPPE-PEG、DPPC/DSPG/DSPE-PEG。根据本发明，磷脂可方便地与上文列举的两亲性化合物中的任何者混合使用。因此，例如，诸如胆固醇、麦角固醇、植物固醇、谷固醇、羊毛固醇、生育酚、没食子酸丙酯或抗坏血酸棕榈酸酯的脂质，诸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸的脂肪酸和它们的衍生物，或丁基化羟基甲苯和/或其他非磷脂化合物可被任选地加入上述磷脂中的一种或多种，例如以优选零至50重量％、更优选至多25％的比例添加。例如，可有利地使用包含磷脂和脂肪酸的两亲性材料的混合物，包括DSPC/DPPG/棕榈酸、DSPC/DPPE-PEG/棕榈酸、DPPC/DPPE-PEG/棕榈酸、DSPC/DSPE-PEG/棕榈酸、DPPC/DSPE-PEG/棕榈酸、DSPC/DPPE-PEG/硬脂酸、DPPC/DPPE-PEG/硬脂酸、DSPC/DSPE-PEG/硬脂酸或DPPC/DSPE-PEG/硬脂酸。根据本发明制备的微泡可任选地包含靶向配体。术语“靶向配体”在其含义内包括具有或能够促进本发明的组合物的微泡针对活体内的任何生物或病理位点的靶向活性(例如包括选择性结合)的任何化合物、结构部分或残基。靶向配体可连接的靶点包括组织，诸如像心肌组织(包括心肌细胞)、膜组织(包括内皮和上皮)、层、结缔组织(包括间质组织)或肿瘤；血块；以及受体，诸如像肽激素、神经递质、抗原、补体片段和免疫球蛋白的细胞表面受体，和类固醇激素的细胞质受体。靶向配体可为合成的、半合成的或天然存在的。可用作靶向配体的材料或物质包括例如但不限于：蛋白质，包括抗体、抗体片段、受体分子、受体结合分子、糖蛋白和凝集素；肽，包括寡肽和多肽；肽模拟物；糖类，包括单糖和多糖；维生素；类固醇、类固醇类似物、激素、辅因子、生物活性剂，以及遗传物质，包括核苷、核苷酸和多核苷酸。靶向配体可为两亲性化合物本身(其与微泡的其他组分混合)，或与用于形成微泡的两亲性分子(例如磷脂)结合的化合物。气体合适的气体包含生物相容性氟化气体，优选全氟化气体。氟化气体包括含有至少一个氟原子的物质，诸如像氟化烃(含有一个或多个碳原子和氟的有机化合物)；六氟化硫；氟化、优选全氟化的酮，诸如全氟丙酮；和氟化、优选全氟化的醚，诸如全氟二乙醚。优选的化合物是全氟化气体，诸如SF6或全氟化碳(全氟烃)、即其中所有氢原子被氟原子取代的烃，其已知形成特别稳定的充气微泡悬浮液。术语“全氟化碳”包括饱和的、不饱和的和环状的全氟化碳。生理上可接受的生物相容性全氟化碳的实例是：全氟烷烃，诸如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如全氟正丁烷，任选地与诸如全氟异丁烷的其他异构体混合)、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟烯烃，诸如全氟丙烯、全氟丁烯(例如全氟丁-2-烯)或全氟丁二烯；全氟炔烃(例如全氟丁-2-炔)；和全氟环烷烃(例如全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟三甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二甲基环戊烷、全氟环己烷、全氟甲基环己烷和全氟环庚烷)。优选的饱和全氟化碳包括例如CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、C5F12和C6F14。特别优选的气体是在室温下呈气态形式的那些，包括SF6、C3F8和C4F10。因此，本发明的一个方面涉及一种制备用于长期存储标准化充气微泡的冻干组合物的方法，所述方法包括以下步骤：a.制备包含冻干保护性组分的混合物的标准化充气微泡的悬浮液；b.冻干标准化微泡悬浮液。优选地，步骤a)的制备方法是微流控流动聚焦技术，如参考文献1[WO2018/041906A1-BRACCOSUISSESA]和参考文献2[PCT申请号PCT/EP2019/055325]中示出的。图2示出可用于本发明的方法的流动聚焦装置(“微流控芯片”)的核心部分200的示意图。芯片包括用于进料气体流201'的第一进料通道201，和用于供应包含两亲性材料的液体流的两个另外的正交进料通道202a和202b。气流和两个液体流被引导朝向接触区203，并随后经过标准化孔口204，图1中示为虚线。标准化孔口连接至具有优选与孔口相同的截面的标准化通道204'，204'又连接至出口通道206的初始部分205。在替代实施方案中(未示出)，标准化孔口204可为直接连接至出口通道206的初始部分205的喷嘴，即在中间不具有标准化通道。微泡203'在标准化孔口中形成，并且通过标准化通道204被引导至出口通道206的初始部分205。出口通道的水力直径一般大于标准化孔口的水力直径，并且通常由标准化孔口的初始直径增大至出口通道206的最终直径，大致上对应于收集管(未示出)的水力直径，收集管将流动聚焦装置连接至容器、例如用于收集微泡悬浮液的密封小瓶。在装置的出口通道的初始部分205中，且优选也在接触区203中和标准化孔口204中，微泡的温度受控，如参考文献1[WO2018/041906A1-BRACCOSUISSESA]和参考文献2[PCT申请号PCT/EP2019/055325]中所描述的。液体流用于制备根据本发明的方法的标准化充气微泡的水性液体流包含以例如5.0至20mg/mL、优选7.5至15mg/mL的浓度分散于水性载体中的两亲性材料(如上文定义的)。优选为生理上可接受的合适的水性载体包含水(优选无菌水)，诸如盐水的水性溶液(可有利地被平衡使得用于注射的最终产品非低渗)，或者一种或多种渗透压调节物质的溶液。渗透压调节物质包含：盐或糖；糖醇；二醇或其他非离子多元醇材料(例如葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇和类似物)；壳聚糖衍生物，诸如羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖；或胶凝化合物，诸如羧甲基纤维素、羟乙基淀粉或葡聚糖。在替代实施方案中，可添加另外的油相以将治疗性疏水物质掺合入微泡。为此，装置中可提供另外两个导管以供应所需油相，如例如由参考文献1[WO2018/041906A1-BRACCOSUISSESA]和参考文献2[PCT申请号PCT/EP2019/055325]描述的。因此，形成的充气微泡将具有设置在气体与两亲性材料的稳定性层之间的界面处的油的薄膜，该薄膜可装载有所需治疗剂。合适的油可包括在室温下为液体的任何生物相容性油，包括例如：具有饱和或不饱和(C2-C18)烷基链的甘油的单酯、二酯或三酯(包括同或异烷基酯)，诸如一丁酸甘油酯、单亚油酸甘油酯、1,2-二己酰甘油、1,2二辛酰甘油、1,2-二油酰-sn-甘油、三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯和它们的混合物；或天然油，诸如豆油、橄榄油、红花籽油、葵花籽油、花生油和它们的混合物。混合气体流新鲜形成的微泡包含选自先前指示的那些的气体。优选气体是高度溶于水中的气体(“HS气体”)与水中溶解度低的气体(“LS气体”)的混合物，如参考文献2[PCT申请号PCT/EP2019/055325]中预期的。在稳定阶段中，主要量的高度可溶气体快速溶解于水中，而难溶气体保持截留在两亲性化合物的密集层中，该层中通常分散有一些残余量的HS溶解度气体。HS气体的实例包括氮气、空气和二氧化碳，二氧化碳因其较高的水中溶解度而特别优选。合适的LS气体是氟化气体，优选全氟化气体。本说明书中先前描述了那些氟化气体。在本发明的优选实施方案中，可利用类似于示意性地示于图3中的气体混合装置来制备包含体积比为80/20至90/10、例如85/15的CO2/C4F10的充气微泡。图3示出用于生产标准化微泡的微流控流动聚焦装置的实例。将气体流302(包含例如C4F10和CO2的混合物)和液体流301(包含两亲性材料，例如磷脂、脂肪酸或它们的混合物)供应至微流控芯片303以经过孔口304生产微泡。微泡悬浮液被收集于小瓶305中，优选在环境压力下用气体(例如C4F10)预填充小瓶。优选使用排气装置(例如针头306)以平衡由液体填充小瓶产生的超压。在微泡悬浮液的收集结束时，优选移除排气装置，并且优选密封容器以避免与外部气氛进一步气体交换。根据本发明的优选实施方案，在收集阶段后，使用合适的洗涤技术处理通过微流控流动聚焦法获得的标准化微泡，以便去除未组装的两亲性材料和可能残余的化合物。在本说明书中，术语“洗涤”指示对新鲜制备的微泡悬浮液进行的最终确定去除未组装的两亲性材料和残余化合物(或大致上减少其量)的任何操作。根据本说明书，合适的洗涤技术包括离心、过滤、气泡分选和倾析。在本说明书中，措辞“未组装的两亲性材料”指示在制备过程结束时存在于标准化微泡悬浮液中、但未形成充气微泡的稳定性层的两亲性分子。在本说明书中，“残余化合物”指示在微泡制备期间加入两亲性材料溶液的任何可能的添加剂物质，诸如前文所述的渗透压调节剂。在本发明的优选实施方案中，在洗涤操作后，将冻干保护性组分的混合物加入标准化微泡悬浮液。或者，可在通过微流控技术制备微泡期间，将冻干保护性组分的混合物加入包含两亲性化合物的上述液体流。在使用冻干保护性组分的混合物时初始CMV特性被特别地保持，特征在于所述冻干保护性组分的混合物具有包含在100mg/ml与300mg/mL之间、优选在120mg/ml与250mg/mL之间的总浓度，更优选PEG和多元醇或PEG和糖的总浓度为200mg/mL。在本发明的优选实施方案中，在冻干过程前，CMV悬浮液包含浓度(w/v％)在10与25％之间、优选14与24％之间且仍更优选18-22％之间的冻干保护性组分的混合物。冻干保护性组分的混合物代表较大量的最终冻干制剂，其中它通常为至少90％、优选在94％与99.7％之间、更优选99.5％、至多99.9％(w/w)。所述冻干保护性组分的混合物是在本说明书中上文所描述的那些。与初始悬浮液(冻干前)相比，当用于标准化微泡悬浮液的冻干过程中时，所述混合物已示出有利的结果，制备出的冻干组合物可随后被重构，以获得具有在浓度和尺寸分布方面可接受特性的标准化微泡的悬浮液。例如，使用冻干保护性组分的混合物产生了在冻干过程后大致上保持GSD值的最佳策略。根据一个实施方案，相比于使用单一添加剂产生了由较高GSD值表征的标准化微泡，在使用冻干保护性组分的混合物时可获得包含在1.16与1.18之间的GSD值。在优选的实施方案中，当与使用单一冻干保护性组分相比时，使用冻干保护性组分的混合物能够显著改进冻干后标准化微泡的产率，增加38％。在本说明书和权利要求书中，术语“冻干”具有其在制药
技术领域：
中的标准含义。冻干过程由在低压或真空下和在低温下干燥预冷冻的液体产品组成。主要目的是从产品中去除液体以便提供适合于长期存储的冻干产品。如申请人所观察到的，可选择冻干参数以进一步优化重构的微泡悬浮液的特性(例如产率、尺寸、GSD)。在本发明的优选实施方案中，用于长期存储标准化充气微泡的所述方法的冷冻温度介于-30℃与-70℃之间，优选在-30℃与-60℃之间，仍更优选-40℃。在仍优选的实施方案，冻干的压力优选为0.5mbar或更低，优选0.2或更低，例如接近-0.1mbar。本发明的另一个方面涉及用于制备标准化充气微泡的悬浮液的冻干组合物，所述冻干组合物能够通过包括以下步骤的方法来获得:a.通过流动聚焦法制备充气标准化微泡的第一悬浮液，包括以下步骤：其中所述悬浮液还包含冻干保护性组分的混合物；和b.冻干所述悬浮液。本发明的另一个方面涉及一种制备包含充气微泡悬浮液的可注射造影剂的方法，其中所述方法包括在生物相容性气体的存在下，用药学上可接受的溶液重构包含两亲性材料和冻干保护性组分的混合物的如上文所述获得的冻干组合物。然后，可在生物相容性气体的存在下用合适的药学上可接受的(水性)溶液重构冻干组合物，由此提供标准化充气微泡的悬浮液，其中所述微泡具有至少1.2或更低、优选至少1.15、低至例如1.1的GSD。在本发明中，药学上可接受的(水性)溶液是水，通常是无菌的、无热原水(以尽可能防止最终重构产品中的污染)；水性溶液，诸如盐水(其可有利地被平衡使得用于注射的最终产品非低渗)；或者一种或多种诸如盐或糖、糖醇、二醇或其他非离子多元醇材料的渗透压调节物质的水性溶液。冻干组合物通常用类似于经历冻干过程的悬浮液的体积的一定体积的水性溶液重构。因此，重构悬浮液中冻干保护性组分的浓度大致上与初始悬浮液中的相同。为此，优选避免过量的聚合物(通常是聚二醇，如PEG)，如高于15mg/mL(如200mg/mL)，以避免待施用的悬浮液的过高粘度。意外地，发现重构的标准化微泡悬浮液已大致上保持了在冻干过程前表征的标准化微泡的初始特性，导致适合于后续的制药用途。所述重构的标准化微泡的悬浮液由具有至少1.2或更低、优选至少1.15、低至例如1.1的GSD的标准化微泡来表征。在本发明的实施方案中，所述重构的标准化微泡悬浮液由至少2.0×108个CMV/mL、优选2.25×108个CMV/mL、更优选2.5×108个CMV/mL、至多5.50×108个CMV/mL的浓度来表征。如上文所指，措辞“微泡浓度”指的是使用CoulterCounter设备测定的一体积单位中微泡的数量，即MB数/mL。通常，在用合适的水性溶液重构本发明的冻干组合物后测量的标准化微泡的浓度(％)，与冻干过程前测量的微泡浓度相比较，允许测定所述重构后的微泡产率。在本发明中，在重构本发明的冻干组合物后标准化微泡产率为至少50％，优选至少55％，更优选至少60％，甚至更优选至少65％，至多例如85％、优选90％、更优选95％、甚至更优选100％。措辞“标准化微泡产率”指的是冻干前测量的微泡浓度与冻干和再分散后测量的微泡浓度之间的比率(参见等式2)：等式2：冻干后CMV产率(％)＝(冻干后CMV浓度/mL)/冻干前CMV浓度/mL)措辞“GSD比率”指的是冻干前对CMV测量的GSD值与冻干后的GSD值之比(参见等式3)。等式3：GSD比率＝(冻干前的GSD)/(冻干后的GSD)冻干过程后的CMV体系的单分散性可以通过GSD比率值来监测。例如，当冻干后的GSD值与冻干前的GSD值相似，导致GSD比率接近1时，评估出良好的单分散性。一般来说，较高的GSD比率(即接近1)表明冻干后CMV分布的初始单分散性得到了保持。用途根据本发明的方法制备的微泡可用于多种诊断和/或治疗技术，特别包括超声和磁共振。诊断方法包括其中充气微泡的使用允许增强动物(包括人)体的一部分的可视化的任何方法，包括用于临床前和临床研究目的的成像。可在超声应用中采用多种成像技术，例如包括基波和谐波B模式成像、脉冲或反相成像以及基波和谐波多普勒成像；需要时，可使用三维成像技术。根据本发明的微泡通常可以每千克患者约0.01至约1.0μL气体的浓度施用，取决于例如它们各自的组成、待成像的组织或器官和/或选择的成像技术。该一般的浓度范围无疑可视特定的成像应用而变化，例如当信号可在非常低的剂量下观察到时、诸如在彩色多普勒或能量反向脉冲中。在实施方案中，所述诊断方法包括：(i)向患者施用通过重构根据本发明的方法获得的冻干产品而获得的充气微泡的悬浮液；并且(ii)检测来自所述患者的关注区域的超声信号。根据实施方案，所述充气微泡的悬浮液包含两亲性材料和冻干保护性组分的混合物。冻干产品的重构优选通过在生理上可接受的气体(例如SF6)的存在下，在温和搅拌下将其分散至生理上可接受的水性载体(例如盐水)中来进行。其他可能的诊断成像应用包括闪烁扫描、光成像和X射线成像，包括X射线相衬成像。本发明的另一方面涉及由根据本发明的冻干产品重构的微泡悬浮液在治疗处理方法中的用途。治疗技术包括对患者的任何治疗方法(如上文定义的)，其包括组合使用超声和充气微泡(本身(例如在超声介导溶栓、高强度聚焦超声消融、血脑屏障透化、免疫调节、神经调节、放射增敏中)，或与治疗剂组合(即，超声介导递送，例如用于将药物或生物活性化合物递送至选定位点或组织，例如在肿瘤治疗、基因治疗、传染病治疗、代谢病治疗、慢性病治疗、退行性疾病治疗、炎性疾病治疗、免疫或自身免疫疾病治疗中或作为疫苗的用途中))，由此充气微泡的存在自身可提供治疗效果或能够增强所施加的超声波的治疗效果，例如通过自身或通过各种物理方法(包括例如超声介导递送)的特定激活，在体外和/或体内发挥或负责发挥生物效应。根据本发明的微泡通常可以每千克患者约0.01至约5.0μL气体的浓度施用以用于治疗目的，取决于例如它们各自的组成、治疗对象的类型、待治疗的组织或器官和/或所应用的治疗方法。在实施方案中，所述超声治疗处理方法包括：(i)向患者施用通过重构根据本发明的方法获得的冻干产品而获得的充气微泡的悬浮液；(ii)识别将受到治疗处理的所述患者的关注区域，所述关注区域包含所述充气微泡的悬浮液；并且(iii)施加超声波束以治疗性处理所述关注区域；由此通过在所述关注区域中存在所述充气微泡的悬浮液来增强所述超声治疗处理。以下实施例将有助于进一步示出本发明。实施例实施例1制备充气微泡使用安装在市售芯片固持器(Micronitmicrofluidics，具有4515插件的FluidicConnectPRO芯片固持器)中的市售微流控流动聚焦装置(CU4553.007N30设计，MicronitMicrofluidics，NL)合成了充气微泡。微泡形成通道宽19μm。芯片和其固持器被置于光学透明的控温水浴中，该控温水浴安装在配备有20倍放大物镜(Olympus，LMPLAN20×)和CCD照相机(Lumenera，LM156M)的倒置显微镜上。恒温浴的温度被设定在50℃。液体流中的两亲性材料是DSPC:DPPE-PEG5000，相应摩尔比为9:1。将具有上述摩尔比的材料以20mg/mL的浓度添加至2:1(体积比)氯仿/甲醇混合物，在60℃下搅拌直至两亲性材料完全溶解。然后在减压下蒸发溶剂，并且在减压下使所得薄膜过夜干燥。然后在60℃搅拌30分钟，使干燥的材料(以15mg/mL的浓度)再分散于盐水(0.9％NaCl)中。然后通过使用尖端超声破碎仪(BransonSonifier250)超声处理分散体以使材料均匀分散。然后使用聚碳酸酯滤器(孔径0.45μm)过滤制剂，冷却至室温并除气。利用类似于示意性地示于图3中的气体混合装置制备了包含体积比为85/15的CO2/C4F10的充气微泡。简言之，分别用CO2和C4F10填充两个气体容器。用相应的质量流量控制器调控每种气体的气体流：(i)EL流：F200CV-002-RAD-11-K，用于CO2，和(ii)低△P流：F-200DV-RAD-11-Z，用于C4F10(两个气体控制器来自荷兰Ruurlo的Bronkhorst)。质量流量控制器受Matlab(Mathworks)中执行的定制软件程序控制，软件程序安装在个人计算机上，以便设定和保持所需混合比率。压力传感器(PSE530-M5-L；日本东京的SMC公司)测量通向微流控芯片的出口通道中气体混合物中的实际压力；2巴的气体压力用于形成微泡。液体同向流速通过使用单独的质量流量控制器(MiniCoriFlow：M13V14I-MAD-11-K-S；荷兰Ruurlo的Bronkhorst)来控制。使用约150μL/min的液体同向流速来运行射流区中的流动聚焦装置，并且产生具有约4μm直径(众数)的微泡。实施例2制备冻干组合物首先，将3mL的通过实施例1中所述的微流控流动聚焦法获得的标准化微泡悬浮液转移至Pyrex管(Pyrex一次性管，12×75mm)，未进一步在管中添加C4F10。然后，以64g对标准化微泡悬浮液离心(Sigma3-16离心机)6分钟，并且借助配备有针头的注射器抽取下层漂浮物(infranatant)。如以下实施例中详述的，用3mL包含冻干保护性组分的溶液再分散剩余的200μL经洗涤的微泡。再分散剩余的经洗涤的微泡后，冻干保护性组分的有效浓度为188mg/mL。然后，将悬浮于冻干保护性组分的溶液中的标准化微泡等分于DIN8R玻璃小瓶(1.5mL悬浮液/小瓶)，并且转入冷冻干燥器。使小瓶在-30℃与-60℃之间的温度下冷却(如后续实施例中详述的)并且在真空下冻干约1小时。在程序结束时，冻干组合物被获得为白色、均匀的干燥固体。然后用纯C4F10填充顶部空间。实施例3冻干保护性组分对标准化微泡特性的影响表1列出了所研究的冻干保护性组分。表1所选冻干保护性组分，由化学品类别分类分子类别分子量(g/mol)PEG4000聚合物4000PEG8000聚合物8000木糖醇多元醇152.2山梨醇多元醇182.2甘露醇多元醇182.2葡萄糖单糖180.2麦芽糖二糖342.3蔗糖二糖342.3葡聚糖6000多糖6000在-60℃的温度下，在制备实施例2中示出的冻干组合物中，以不同的浓度，使用上述材料作为单一组分或其混合物。表2列出了单一组分(S1-S13)及其混合物(M1-M9)的各种实例。表2冻干保护性组分溶液的组成和浓度表征在冻干过程后，在生物相容性气体的存在下，用1.5mL水性溶液重构每种冻干组合物，以便获得标准化且稳定的微泡悬浮液。在冻干之前和之后，冻干保护性组分的混合物的浓度为188mg/mL。在重构后，将重构的标准化微泡悬浮液在试验台上放置5min，之后使用装配有30μm孔径管的CoulterCounterMultisizer3表征，以测量微泡的尺寸、几何标准差(GSD)、浓度和冻干过程后的产率。结果重构的标准化微泡悬浮液的主要表征结果报告于表3和表4中。在冻干过程之前和之后测量微泡的GSD值和浓度，以评估冻干保护性组分在保持标准化微泡的初始特性上的效力。考虑到GSD值和冻干后的微泡产率，结果清楚地表明，在标准化微泡悬浮液中加入冻干保护性组分的混合物相比于加入单一组分更有效地保持了微泡特性。表3重构包含单一冻干保护性组分的冻干组合物后所得标准化微泡悬浮液的GSD、CMV产率和浓度(FD＝冻干)从表4中显示的结果可以看出，使用冻干保护性组分的混合物提高了冻干效率。特别是，在聚乙二醇(PEG4000和PEG8000)和多元醇(即木糖醇、山梨醇和甘露醇)的混合物中冻干标准化微泡，能够提高冻干后的微泡产率。例如，与使用S1A相比，使用混合物M1使冻干后的微泡产率增加了17％。更有利的是，与制剂S2A相比，使用M2使CMV产率增加了38％。此外，在混合物M2中冻干CMV可以获得1.17的更好GSD值，低于使用制剂S2A和S3A的单一冻干保护性组分获得的GSD值，分别为1.21和1.33。在聚乙二醇(PEG4000和PEG8000)和糖类(即麦芽糖、蔗糖、棉子糖、葡聚糖6000)的混合物中冻干标准化微泡后，也观察到同样的趋势。例如，发现在混合物M5中冻干后的CMV产率为51％，与制剂S2A相比，增加了25％。此外，还发现使用混合物M5的GSD值为1.17，明显低于单一冻干保护性组分S2A和S6，分别为1.21和1.28。表4重构包含冻干保护性组分的混合物的冻干组合物后获得的标准化微泡悬浮液的GSD、CMV产率和浓度(FD＝冻干)。实施例4表征在不同冷冻温度下冻干后标准化微泡的特性通过评估在冻干程序开始时新鲜制备的标准化微泡被冷却的不同冷冻温度，进一步研究了冻干组合物的制备。制备过程如先前实施例2中描述的进行，不同之处在于小瓶在不同的冷冻温度下冷却，如表5中报告的。在冻干过程结束时，在生物相容性气体的存在下，用1.5mL水性溶液重构每种冻干组合物，以便获得标准化且稳定的微泡悬浮液。因此，用类似于经历冻干过程的悬浮液的体积的一定体积的水性溶液重构冻干组合物。因此，重构悬浮液中冻干保护性组分的浓度与初始悬浮液中的浓度大致上相同。在重构后，将重构的标准化微泡悬浮液在试验台上放置5min，之后使用装配有30μm孔径管的CoulterCounterMultisizer3表征，以测量微泡的尺寸、几何标准差(GSD)、浓度和冻干过程后的产率。表5报告了对于在不同温度下冷冻且包含不同冻干保护性组分的冻干组合物重构后获得的各种微泡悬浮液，冻干后测量的GSD值和微泡产率。结果结果证实，与使用单一组分相比，使用冻干组分的混合物能够改进在任何研究的冷冻温度下的冻干性能。例如，如表5所示，在混合物M2中冻干的CMV由在任何研究的冷冻温度下最低的GSD值来表征，证实了之前在实施例3中获得的结果。表5在不同冷冻温度下冻干(FD)后测量的CMV的GSD值、CMV产率和浓度实施例5冻干保护性组分的浓度对标准化微泡特性的影响还研究了冻干保护性组分混合物的浓度以便评估在保持GSD值和冻干后的微泡产率方面的冻干效率。对于该研究，比较了冻干保护性组分的混合物与对应的单独冻干保护性组分。尤其是，评估了以下冻干保护性组分：i)PEG4000和山梨醇(含有等量)与单独的PEG4000比较。ii)PEG4000和木糖醇(含有等量)与单独的PEG4000比较。iii)PEG8000和山梨醇(含有等量)与单独的PEG8000比较。iv)PEG8000和木糖醇(含有等量)与单独的PEG8000比较。对每种研究的制剂制备了在50mg/mL与250mg/mL之间的浓度范围的不同溶液。然后，将悬浮于不同的冻干保护性组分溶液中的标准化微泡等分于DIN8R玻璃小瓶(1.5mL悬浮液/小瓶)，并且转入冷冻干燥器。小瓶在-60℃或-40℃(PEG8000混合物)和-60℃(PEG4000混合物)在环境压力下冷却1小时，然后在-20℃和0.1mbar下进行初级干燥。在程序结束时，冻干组合物被获得为白色、均匀的干燥固体。然后用纯C4F10填充顶部空间。结果考虑了冻干后的CMV产率(公式2)和GSD比率(公式3)，研究冻干保护性组分的浓度对标准化微泡特性的影响。i)PEG4000和山梨醇(含有等量)与单独的PEG4000比较。表6报告了在增加浓度时PEG4000和山梨醇的FD保护性混合物与单独的PEG4000的冻干后的CMV产率以及GSD比率的比较。考虑到CMV产率，结果显示，对于混合物和单一组分，使用浓度在50mg/ml和200mg/ml之间的冻干保护性组分，冻干效率得到越来越大的改进。此外，结果显示，在研究的冷冻温度下(≤200mg/ml)，PEG4000和山梨醇的混合物和单独的PEG4000获得了大致上类似的CMV产率。相反，就GSD比率而言，观察到单一组分和混合物之间的差异。特别是在-60℃冷冻时，相比于单独的PEG4000，PEG4000和山梨醇混合物的GSD比率获得系统性增加的值。表6单独的PEG4000(S1A)和PEG4000+山梨醇混合物(M1)之间的比较ii)PEG4000和木糖醇(含有等量)与单独的PEG4000比较。表7报告了在增加浓度时PEG4000和木糖醇的FD保护性混合物与单独的PEG4000的冻干后的CMV产率以及GSD比率的比较。表7单独的PEG4000(S1A)和PEG4000+木糖醇混合物(M9)之间的比较与前面(情况i)类似，与GSD比率有关的结果显示，PEG4000和木糖醇混合物在-60℃冷冻时，其冻干效率有所提高，产生了比单独的PEG4000更好的GSD比率值。不同的是，发现只有在低浓度(50-100mg/ml)时，该混合物的CMV产率更高。iii)PEG8000和山梨醇(含有等量)与单独PEG8000的比较表8报告了通过比较含有PEG8000和山梨醇的混合物的制剂和含有单独PEG8000的制剂，对于每个研究浓度的冻干后的CMV产率和GSD比率的比较。表8单独的PEG8000(S2A)和PEG8000+山梨醇混合物(M2)之间的比较考虑到CMV产率，结果显示，在两种冷冻温度下，对于混合物和单一组分，使用浓度在50mg/mL和250mg/mL之间的冻干保护性组分，冻干效率得到越来越大的改进。然而，在-60℃的冷冻温度下，发现只有低浓度(50-100mg/mL)的混合物的CMV产率增加，而在较高的浓度下(尤其是≥200mg/mL)，混合物和单一组分的数值大致上类似。不同的是，在-40℃的冷冻温度下，与单独的PEG8000相比，PEG8000和山梨醇的混合物显示了CMV产率和GSD比率的改进值。如表8所示，使用PEG8000和山梨醇的混合物替代单独PEG8000的优势也被GSD比率值所证实。特别是，当CMV在PEG8000和山梨醇的溶液中在所有测试浓度和两个冷冻温度下冻干时，评估了更高的GSD值，表明与含有等量PEG8000的CMV悬浮液相比，单分散性得到改进。v)PEG8000和木糖醇(含有等量)与单独PEG8000比较表9报告了通过比较含有PEG8000和木糖醇混合物的制剂和含有单独PEG8000的制剂，对于每个研究浓度的冻干后的CMV产率和GSD比率的比较。表9单独的PEG8000(S2A)和PEG8000+木糖醇混合物(M3)之间的比较正如从不断增加的CMV产率值所证明，对于混合物和单一组分，使用浓度在50mg/ml和250mg/ml之间的冻干保护性组分，都获得了冻干效率的提高。结果显示，在-60℃的冷冻温度下，对于低浓度<100mg/mL的混合物，CMV产率值尤其得到提高。发现在混合物中在所有浓度和两个冷冻温度下，GSD比率都得到了改进。与情况iii)类似，在-40℃的冷冻温度下，与单独的PEG8000相比，PEG8000和木糖醇的混合物显示了CMV产率和GSD比率的改进值，证实了其冻干效率的提高。从整体结果分析来看，与单一的FD保护性组分相比，使用FD保护性组分的混合物赋予了冻干效率的更多改进。特别是，将S1A与M1(PEG4000+山梨醇)和M9(PEG4000+木糖醇)进行比较，发现在-60℃冷冻时，混合物的GDS比率值得到了改进。从S2A(PEG8000)与混合物M2(PEG8000+山梨醇)和M3(PEG8000+木糖醇)的比较中可以看出，当在-40℃冷冻时，评估了混合物的冻干效率的越来越大的改进，其中观察到所有的研究参数(CMV产率、GSD、GSD比率)都有增加。然而，在-60℃的冷冻温度下，虽然发现混合物的CMV产率与单一FD保护性组分相比类似或略高，但只有混合物M2和M3的GSD比率和GSD值得到改进，特别是在高浓度的冷冻保护剂(≥200mg/mL)下。引用的参考文献1.WO2018/041906A1-BRACCOSUISSESA2.PCT申请号PCT/EP2019/0553253.US2017/080113A1-GEHealthcare4.WO97/29782A1-NICOMEDIMAGINGA/S当前第1页12