一种3d打印神经导管及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，特别涉及采用3d生物打印技术，制备一种新型的3d打印神经导管。


背景技术：

2.外周神经损伤是一种临床上常见疾病，常发生于车祸、刀伤及肿瘤切除等，约占外伤病人的10％，是病人致残的重要原因。在美国，每年至少要花费1500万美元用于外周神经损伤病人的治疗。而在中国，外周损伤患者发病人数约为240万/年。目前，主要通过端对端神经缝合和自体神经移植对外周神经缺损进行治疗。然而，当神经缺损大于5mm时，缝合产生的纵向张力，会影响外周神经功能恢复。人工神经导管和自体神经移植是治疗外周神经长距离缺损的主要策略。其中，自体神经移植由于疗效较好，是临床上治疗外周神经缺损的“金标准”。然而该方法也面临二次手术、供体区功能将缺失及神经瘤等缺陷。人工神经导管为长距离神经缺损治疗提供了新思路。神经导管可为神经轴突的伸长提供定向物理通道，并能有效地阻碍疤痕组织的入侵。但目前上市的人工神经导管促进外周神经修复疗效较差，与自体神经移植存在一定差距。
3.神经导管功能化修饰是提高其疗效的重要手段。功能化神经导管不仅为神经轴突定向伸长提供物理通道，还能有效调控神经再生相关细胞的活性，为外周神经再生提供一个良好的微环境。目前，常将生长因子与神经导管结合，以促进外周神经的再生。然而，单一生长因子作用有限，并且很难控制其缓释。因此，研发一种具有多种生长因子，并可有效控制其缓释的生物材料，对外周神经再生具有重要作用。
4.血小板是血液中重要成分之一，在止血、抗感染等多种生理过程发挥着重要作用。受到环境刺激后，血小板会分泌多种生长因子、趋化因子和细胞因子，参与调解组织的再生；前期研究结果揭示，血小板分泌的vegf、pdgf及tgf-β等再生因子可有效促进外周神经再生及功能恢复。因此，将血小板局部递送到损伤神经部位有助于外周神经的再生。但是，传统利用血小板治疗外周神经缺损，是通过凝血酶或钙离子使血小板激活并被包裹在胶原纤维中，然后与神经导管结合进行治疗。但这种方式会使血小板中的可溶性蛋白快速释放出去，并被环境中的酶快速降解，影响疗效。


技术实现要素：

5.为克服上述技术问题，本发明提出将未激活血小板与3d打印材料和光引发剂，利用3d生物打印技术，制备含未激活血小板的神经导管，用于促进外周神经再生及功能恢复。该神经导管可使血小板长期存活，通过延长血小板在体内的存活时间，实现多种再生因子的个性化缓释，此外，还能控制血小板在3d打印神经导管中的分布，为外周神经再生与功能恢复提供一个良好的微环境。
6.本发明提供了一种3d打印神经导管，其由以下方法制备得到：
7.a、将未激活血小板置于溶剂中，得含血小板的溶液；
8.b、将3d打印材料和光引发剂溶解于步骤a所得含血小板的溶液中；
9.c、利用3d生物打印技术，在光处理下，对步骤b所得材料进行打印，然后浸泡在溶剂中以去除光引发剂和未交联的高分子，得3d打印神经导管。
10.其中，上述3d打印神经导管，步骤a中，所述未激活血小板由以下方法制得：提取全血或含血小板的成分血，在200～400g的离心力下离心两次，以去除红细胞及白细胞，得含血小板的上清液；将含血小板的上清液在800～2000g的离心力下离心，使血小板沉淀在离心管底部，以收集未激活血小板。
11.其中，上述3d打印神经导管，步骤a中，所述含血小板的溶液中血小板的浓度不小于1
×
10^3个/ml。
12.优选的，上述3d打印神经导管，步骤a中，所述含血小板的溶液中血小板的浓度为1
×
10^6个/ml～1
×
10^10个/ml。
13.更优选的，3d打印神经导管，步骤a中，所述含血小板的溶液中血小板的浓度为1
×
10^7个/ml～1
×
10^9个/ml。
14.其中，3d打印神经导管，所述溶剂为pbs溶液、生理盐水或pas溶液。
15.其中，3d打印神经导管，步骤b中，所述3d打印材料为光固化生物材料或其混合物。
16.优选的，上述3d打印神经导管，所述3d打印材料为甲基丙烯酸化明胶、聚乙二醇(二醇)二丙烯酸酯、甲基丙烯酸化海藻酸钠或甲基丙烯酸化蚕丝蛋白中的至少一种。
17.其中，上述3d打印神经导管，所述3d打印材料的用量以3d打印材料质量与步骤a溶剂体积比值为2％～30％控制。
18.优选的，上述3d打印神经导管，所述3d打印材料的用量以3d打印材料质量与步骤a溶剂体积比值为10％～30％控制。
19.其中，上述3d打印神经导管，步骤b中，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂、irgacure 819或irgacure 2959中的至少一种。
20.其中，上述3d打印神经导管，所述光引发剂的用量以光引发剂质量与步骤a溶剂体积比值为0.01％～10％控制。
21.本发明提供的3d打印神经导管能够在神经组织再生及功能恢复中进行应用。
22.本发明的有益效果：
23.本发明提供了一种新型的神经导管，其利用3d生物打印技术，在光处理下将血小板快速地分散(包裹)在水凝胶中，减少了血小板和水凝胶结合过程中被激活的机会，制备得到含未激活血小板的3d打印神经导管；此外，通过3d打印技术可个性化控制血小板在神经导管中的分布，为外周神经再生与功能恢复提供更适宜的微环境，以进一步提高其疗效；与含激活后血小板的水凝胶相比，本发明含未激活血小板的神经导管能有效抑制再生因子的突释，使再生因子从水凝胶材料中缓慢释放出来。
24.动物药效学实验证明，本发明制备的神经导管能有效促进外周神经再生与功能恢复。
附图说明
25.图1为不同处理条件下带gfp荧光血小板的荧光图像；其中，a为提取的带gfp荧光血小板的荧光图像；b为凝血酶处理后的血小板的荧光图像；c为血小板在3d打印水凝胶
(15％gelma+5％pegda)表面孵育2小时后的荧光图像；d-f依次为实施例1中3d打印所得含荧光、未激活血小板的水凝胶，孵育0天、4天和8天后的荧光图像；图1中的亮点为未激活血小板。
26.图2为tgf-β1从含激活后血小板的水凝胶及含未激活的血小板的水凝胶中的释放曲线图。
27.图3为本发明3d打印神经导管的白光图。
28.图4为实施例4中动物实验结果图；其中，a为不同实验组的神经传导速率统计图；b为不同实验组的潜伏期统计图；c为腓肠肌比重统计图；d为腓肠肌肌纤维平均直径统计图；其中，3dpc为含未激活血小板的3d打印神经导管组、3dc为3d打印神经导管组、autograft为自体神经移植组、sham为无手术组。
具体实施方式
29.3d打印神经导管，其由以下方法制备得到：
30.a、将未激活血小板置于溶剂中，得含血小板的溶液；
31.b、将3d打印材料和光引发剂溶解于步骤a所得含血小板的溶液中；
32.c、利用3d生物打印技术，在光处理下，对步骤b所得材料进行打印，然后浸泡在溶剂中以去除光引发剂和未交联的高分子，得3d打印神经导管。
33.本发明将利用基于数字光处理(digital light processing，dlp)的生物3d打印技术，制备一种新型的含活体血小板的3d打印神经导管。未激活血小板可采用本领域内常规方法提取获得，例如采用以下方法：提取全血或含血小板的成分血，在200～400g的离心力下离心两次(一般离心10～20分钟)，以去除红细胞及白细胞，得含血小板的上清液；将含血小板的上清液在800～2000g的离心力下离心(一般离心10～20分钟)，使血小板沉淀在离心管底部，以收集未激活血小板。
34.本发明步骤a中，所述含血小板的溶液中血小板的浓度不小于1
×
10^3个/ml；为提高治疗效果，血小板的浓度优选为1
×
10^6个/ml～1
×
10^10个/ml，更优选为1
×
10^7个/ml～1
×
10^9个/ml。
35.本发明步骤a和c中，溶剂可采用pbs溶液(1
×
pbs溶液配方：kh2po4(144mg/l)、nacl(9000mg/l)、na2hpo4·
7h2o(795mg/l))、生理盐水或pas溶液(pas溶液配方：nacl(0.405g/100ml)、kcl(0.0037g/100ml)、macl
·
6h2o(0.03g/100ml)、ch3coona
·
3h2o(0.442g/100ml)、na3c6h5o7·
2h2o(0.318g/100ml)、kh2po4·
1h2o(0.093g/100ml)、na2hpo4·
12h2o(0.769g/100ml)；步骤a和c中的溶剂可一样，也可不同。
36.本发明步骤b中，3d打印材料为光固化生物材料或其混合物；具体的，3d打印材料为gelma(甲基丙烯酸化明胶)、pegda(聚乙二醇(二醇)二丙烯酸酯)、ma-aglinate(甲基丙烯酸化海藻酸钠)或ma-sf(甲基丙烯酸化蚕丝蛋白)等光固化生物材料或其混合物；3d打印材料的用量以3d打印材料质量与溶剂体积比值为2％～30％控制；优选为10％～30％。。
37.本发明步骤b中，所述光引发剂为lap(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)、irgacure 819或irgacure 2959中的至少一种；光引发剂的用量以光引发剂质量与步骤a溶剂体积比值为0.01％～10％控制。
38.目前，本领域内常用的光固化生物3d打印材料和光引发剂主要是以上几种，但只
要是满足生物光固化生物3d打印原理的生物材料和光引发剂，都能适用于本发明。
39.步骤b中，得到含有血小板、3d打印材料和光引发剂的溶液，然后在步骤c中，利用光处理激发光引发剂，使3d打印材料、溶剂生产水凝胶，同时将使用3d打印技术使血小板快速地均匀分散在水凝胶中，减少血小板在和水凝胶结合过程中被激活，并使血小板长期存活在3d打印水凝胶中。本发明优选采用基于数字光处理原理设计的打印机(digital light processing，dlp)进行打印，其同时具备光处理和3d打印功能，并且相较于传统打印机，其打印速度更快，可进一步减少血小板在和水凝胶结合过程中被激活。
40.本发明提供了上述3d打印神经导管。本发明提供的3d打印神经导管能够在以血小板为治疗手段的领域内进行应用，特别是在神经组织再生及功能恢复中进行应用。
41.此外，根据本发明3d打印神经导管在不同部位的应用，可将其打印成合适的规格。
42.此外，基于生物3d打印系统可实现对神经导管成分和结构在三维空间的精确控制的特性，本发明可构建血小板分布个性化的神经导管，以提高其疗效。通过三维软件设计及打印控制系统的配合，可实现血小板的个性化分布。研究显示，具有神经生长因子浓度梯度分布的神经导管(远端高浓度，近端低浓度)可有效促进神经轴突及施旺细胞的定向迁移，从而促进外周神经再生及功能恢复。利用光固化的喷头式生物3d打印机制备该梯度神经导管的详细步骤可为如下：1)利用三维软件设计神经导管的结构；2)利用软件编程设计3d打印机的运动；3)通过含不同血小板浓度的喷头替换打印及光固化成型以形成含血小板浓度梯度分布的神经导管。
43.下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此将本发明保护范围限制在所述的实施例范围之中。
44.实施例1
45.a、从带gfp荧光的小鼠体内提取全血，通过离心机(200g、20分钟、2次)去除红细胞及白细胞，通过离心机(2000g、20分钟)使血小板沉淀在离心管底部，以收集血小板；将收集的血小板重悬在1ml生理盐水中(血小板的含量约为10
×
10^6个/ml)；
46.b、将光聚合生物3d打印材料(150mg gelma和50mg pegda)和光引发剂(5mg lap)溶解在上述的含血小板的生理盐水中；
47.c、将上述的材料，利用基于数字光处理原理设计的打印机进行打印，将打印出来的材料浸泡在生理盐水中以去除光引发剂和未交联的高分子，得含荧光、未激活血小板的水凝胶。
48.在生理盐水中，观察不同处理条件下带gfp荧光血小板的荧光图像，结果如下：
49.(1)、将步骤a提取所得血小板静置在1ml生理盐水的培养皿中，结果见图1a；
50.(2)、将步骤a提取所得血小板进行凝血酶处理，结果见图1b(即实施例3步骤a所得物荧光图像)；
51.(3)、将血小板在3d打印水凝胶(15％gelma+5％pegda)表面孵育2小时(操作为：将150mg gelma和50mg pegda和5mglap溶解于1ml生理盐水中，经3d打印，浸泡，得3d打印水凝胶，将步骤a所得的血小板滴加在3d打印水凝胶表面)，结果见图1c；
52.(4)、将步骤c所得3d打印所得含荧光、未激活血小板的水凝胶，浸泡在生理盐水中，孵育0天、4天和8天，结果依次见图1d～f。
53.根据图1结果所示，图1a为提取后的血小板的荧光图，可以证明血小板带有绿色荧
光；将图1b血小板采用凝血酶处理和图1c附着在水凝胶表面后，血小板会被快速激活，同时荧光消失；而图1d将血小板利用3d生物打印技术包裹在水凝胶中，如图所示，在第0、4、8天能观察到带有荧光的血小板，并且荧光血小板的数量没有明显减少。该结果证明了将血小板包裹在3d打印水凝胶中的可有效促使血小板长时间处于未激活状态。
54.实施例2
55.a、从sd大鼠体内提取全血，通过离心机(200g、20分钟、2次)去除红细胞及白细胞，通过离心机(2000g、20分钟)使血小板沉淀在离心管底部，以收集血小板；将收集的血小板重悬在1ml生理盐水中(血小板的含量为100
×
10^6个/毫升)；
56.b、将光聚合生物3d打印材料(150mg gelma和50mg pegda)和光引发剂(5mg lap)溶解在上述的含血小板的生理盐水中；
57.c、将上述的材料，利用基于数字光处理原理设计的打印机进行打印，并浸泡在生理盐水中以去除光引发剂和未交联的高分子，得含激活血小板的水凝胶材料。
58.tgf-β1释放试验：
59.4)将实施例2制备所得含未激活血小板的水凝胶材料和实施例3制备所得含激活血小板的水凝胶材料分别浸泡在生理盐水中，在不同的时间点吸取浸泡液，并放在-20℃冰箱中；将收集的浸泡液用elisa试剂盒进行测试，结果如图3所示。
60.实验结果显示，tgf-β1可以从水凝胶材料中缓释出来；在含激活后血小板的水凝胶材料中，tgf-β1会快速地从水凝胶材料中释放出来，并且存在明显的突释现象；而在含未激活血小板的水凝胶材料中，tgf-β1的释放速率会变慢，无明显突释。上述结果说明将未激活的血小板打印在水凝胶材料中，可减缓血小板的激活，从而使血小板中的再生因子缓慢释放出来。
61.实施例3
62.a、从sd大鼠体内提取全血，通过离心机(200g、20分钟、2次)去除红细胞及白细胞，通过离心机(2000g、20分钟)使血小板沉淀在离心管底部，以收集血小板；将收集的血小板重悬在1ml生理盐水中(血小板的含量为100
×
10^6个/毫升)；
63.b、将光聚合生物3d打印材料(150mg gelma和50mg pegda)和光引发剂(5mg lap)溶解在上述的含血小板的生理盐水中；
64.c、将上述的材料，利用基于数字光处理原理设计的打印机进行打印，并浸泡在生理盐水中以去除光引发剂和未交联的高分子，得含未激活血小板的神经导管(其白光图见图2)，其规格为长13mm，外径3mm，内径1.5mm。
65.实施例4
66.动物实验：选取成年的sd大鼠(体重200-250g)评估3d打印含未激活血小板的神经导管的促进周围神经再生及功能恢复的性能。
67.将sd大鼠随机分为4组接受功能评估；3dpc为含未激活血小板的3d打印神经导管组、3dc为3d打印神经导管组、autograft为自体神经移植组、sham为无手术组。
68.对大鼠进行腹腔注射水合氯醛(0.5ml/100g)进行麻醉，将大鼠右后身毛去除，在坐骨神经处切开1毫米与股骨平行的伤口，将股二头肌分开，露出坐骨神经。3dpc组为将坐骨神经截取10mm后利用含未激活血小板的3d打印神经导管进行桥接；3dc组为将坐骨神经截取10mm后利用3d打印神经导管进行桥接；autograft组为将坐骨神经截取10mm后利用再
用截取的坐骨神经进行桥接；sham组为将坐骨神经暴露后，直接将伤口缝合。
69.12周后，利用组织学及神经电生理对再生神经的功能恢复进行分析。图4a为不同实验组的神经传导速率统计图：如图4a所示，含未激活血小板神经导管能有效提高神经传导速率，并且与自体神经移植组没有统计学差异；图4b为不同实验组的潜伏期统计图：其结果与神经传导速率相同；图4c～d为腓肠肌的萎缩情况分析：结果显示，含未激活血小板的加入能有效抑制腓肠肌组织的萎缩，并且含未激活血小板神经导管组的腓肠肌萎缩程度与自体神经移植组没有统计学差异。上述结果显示，3d打印含未激活血小板的神经导管能有效促进坐骨神经的再生及功能恢复，其结果明显优于3d打印神经导管组，并且与自体神经移植没有统计学差异。