1.本发明属于医药健康技术领域，尤其涉及一种组合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.葡萄膜炎是一种易反复发作的常见致盲性眼病，其发病机制除与遗传有关外，还受细菌感染等环境因素影响。葡萄膜炎病因复杂，发病机制尚未完全阐明，目前仍无有效的预防及治疗方法；20世纪70年代，英国bhattacherjee等人首先发现将内毒素注入到玻璃体腔内可以诱发眼内炎症反应(exp eye res.1975feb；20(2):186.)。此后，人们发现通过实验动物足底皮下注射内毒素同样可以引起眼组织的炎症反应。人们在对视网膜、脉络膜及巩膜组织免疫组化研究中确认葡萄膜炎病理过程是原发性炎症反应，因此内毒素诱导的葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis)模型是可以用做药效评价的实验方法。建立葡萄膜炎模型所使用的内毒素一般多采用肠源性内毒素，主要包括鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)及大肠杆菌(escherichia coil.)等由来的内毒素脂多糖(lipopolysaccharides,lps)，迄今为止的研究证明伤寒沙门氏菌的致病能力更强。为此，本发明采用伤寒沙门氏菌由来的lps构建葡萄膜炎小鼠实验模型，评价一种药食同源组合物对葡萄膜炎的影响，旨在提供一种可长期服用而且安全性有效的改善葡萄膜炎疾病的功能食品或医药品。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能够安全有效且无副作用的应用于制备预防或改善葡萄膜炎药物或食品上的组合物。
4.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种组合物，包括以下重量份的组分：平卧菊三七50-80份、鱼腥草20-30份、草果12-24份、薤白8-16份、党参5-10份。
5.本发明的技术方案提供的一种组合物是通过组分筛选与配方优化发现其在体外对炎症因子il-1β的释放具有较好的抑制作用，因此，提示该组合物能抑制眼组织il-1β炎症介质释放和nlrp3炎症小体激活，并有助于提升眼组织的抗氧化能力指数。
6.作为本发明所述组合物的优选实施方式，所述组合物包括以下重量份的组分：平卧菊三七55-68份、鱼腥草22-28份、草果18-24份、薤白10-14份、党参5-8份。
7.作为本发明所述组合物的优选实施方式，所述组合物包括以下重量份的组分：平卧菊三七60份、鱼腥草24份、草果20份、薤白10份、党参6份。
8.当优选的组合物按上述重量份组成时，其在后期效果例中il-1β释放抑制率更高，达72.4％、il-1β含量更低、nlrp3相对水平更低且抗氧化能力指数更高，达到了147.6μmol/l trolox eq.。
9.另外，本发明还提供了组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
10.(1)按重量份称取各组分混匀后粉碎，接着加入溶剂浸泡超声、提取，收集提取液；
11.(2)将步骤(1)所述提取液过滤，收集滤液并浓缩，得组合物；
12.所述溶剂为超纯水、低级醇或丙酮中的至少一种。
13.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，溶剂的质量与各组分的质量之和的比值为(20-50)：1。
14.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，浸泡超声的功率为600w，浸泡超声的时间为1-2.5小时。
15.适当的水料比能够充分浸润组分，在浸泡的过程中辅以超声，能够促使溶剂进一步渗透入细胞内部，加快溶剂渗入中药内部的速度，在这个过程中选择合适的超声功率和浸泡超声时间，一方面有利于后续提取过程有效物质的获得，提高有效物质的产率，另一方面能够避免过度超声或浸泡带来的有效成分的丢失，从而能够充分发挥抑制眼组织il-1β炎症介质释放和nlrp3炎症小体激活，并有助于提升眼组织的抗氧化能力指数的作用。
16.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，提取的方式为加热回流提取，单次提取的时间为1-2小时，提取的次数为3-6次。
17.在加热回流提取过程中，选择合适的提取时间和提取次数的目的是充分获得组分中的有效物质，提高有效物质的产率，从而能够充分发挥抑制眼组织il-1β炎症介质释放和nlrp3炎症小体激活，并有助于提升眼组织的抗氧化能力指数的作用。
18.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，提取采用的溶剂为超纯水、低级醇中的至少一种。
19.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，提取采用的溶剂为超纯水、乙醇中的至少一种。
20.考虑到后续制备得到的产品需要进一步应用到药品、食品的制备过程中，因此，溶剂的选择尽量选择低毒甚至无毒的溶剂，所以，此处优选超纯水、乙醇或两者的混合溶剂。
21.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，过滤所使用的筛的目数为200目。
22.另外，本发明还提供了一种药物，所述药物包含上述组合物。
23.作为本发明所述药物的优选实施方式，所述药物还含有一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
24.作为本发明所述药物的优选实施方式，所述载体或辅料包括赋形剂、防腐剂、抗氧化剂或润滑剂。
25.作为本发明所述药物的优选实施方式，所述赋形剂包括乳糖、白糖、甘露醇或淀粉；所述防腐剂包括氯丁醇、苄醇或二羟基乙酸；所述抗氧化剂包括亚硫酸盐或抗坏血酸；所述润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙或滑石粉。
26.作为本发明所述药物的优选实施方式，所述药物的剂型包括粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、滴眼液或眼贴。
27.另外，本发明还提供了组合物在制备预防或改善葡萄膜炎的药物或食品中的应用。
28.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述食品包括功能食品或保健食品。
29.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述食品还含有一种或多种食品上可接受的辅料。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
31.第一：本发明的技术方案提供的一种组合物是一类药食同源组合物，因此，此组合物安全无副作用；
32.第二：本发明的技术方案提供的一种组合物能抑制眼组织il-1β炎症介质释放和nlrp3炎症小体激活，并有助于提升眼组织的抗氧化能力指数，因此，可以将此组合物应用于制备预防或改善葡萄膜炎的药物或食品；
33.第三：本发明的技术方案提供的一种组合物应用于制备预防或改善葡萄膜炎的药物或食品，适用范围广，也能助力新型功能食品、保健食品、药品的开发。
具体实施方式
34.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
35.缩略词表
[0036][0037][0038]
实施例1
[0039]
本实施例的组合物的制备方法如下：
[0040]
(1)按重量份称取平卧菊三七60份、鱼腥草24份、草果20份、薤白10份、党参6份，将称取的组分混匀后机械粉碎；
[0041]
(2)往机械粉碎后的物料中超纯水，其中超纯水与粉碎后的物料的质量比为30，放在600w、50khz的超声环境下浸泡超声2小时；
[0042]
(3)浸泡超声结束后，对体系进行加热回流提取，提取的次数为4次，每次提取的时间为1小时，收集每次的提取液并合并；
[0043]
(4)将收集到的提取液合并液过200目的筛，接着浓缩滤液，得组合物1。
[0044]
实施例2
[0045]
本实施例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是加入组分的重量份，其中本实施例中的组分重量份为：平卧菊三七55份、鱼腥草28份、草果18份、薤白14份、党参8份；制备得到的产品为组合物2。
[0046]
实施例3
[0047]
本实施例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是加入组分的重量份，其中本实施例中的组分重量份为：平卧菊三七68份、鱼腥草22份、草果24份、薤白10份、党参5份；制备得到的产品为组合物3。
[0048]
实施例4
[0049]
本实施例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是加入组分的重量份，其中本实施例中的组分重量份为：平卧菊三七75份、鱼腥草30份、草果16份、薤白16份、党参9份；制备得到的产品为组合物4。
[0050]
实施例5
[0051]
本实施例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是加入组分的重量份，其中本实施例中的组分重量份为：平卧菊三七50份、鱼腥草20份、草果12份、薤白8份、党参5份；制备得到的产品为组合物5。
[0052]
对比例1
[0053]
本对比例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是加入组分的重量份，其中本对比例中的组分重量份为：鱼腥草24份、草果20份、薤白10份、党参6份，即相较于实施例1是在组分中不添加平卧菊三七；制备得到的产品为对照品1。
[0054]
对比例2
[0055]
本对比例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是加入组分的重量份，其中本对比例中的组分重量份为：平卧菊三七45份、薤白18份、党参12份，即相较于实施例1是在组分中不添加鱼腥草和草果；制备得到的产品为对照品2。
[0056]
对比例3
[0057]
本对比例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是加入组分的重量份，其中本对比例中的组分重量份为：平卧菊三七45份、草果10份、党参12份，即相较于实施例1是在组分中不添加鱼腥草和薤白；制备得到的产品为对照品3。
[0058]
对比例4
[0059]
本对比例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是加入组分的重量份，其中本对比例中的组分重量份为：平卧菊三七45份、鱼腥草32份，即相较于实施例1是在组分中不添加草果、薤白和党参；制备得到的产品为对照品4。
[0060]
对比例5
[0061]
本对比例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是加入组分的重量份，其中本对比例中的组分重量份为：平卧菊三七45份，即相较于实施例1是在组分中不添加鱼腥草、草果、薤白和党参；制备得到的产品为对照品5。
[0062]
对比例6
[0063]
本对比例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是加入组分的重量份，其中本对比例中的组分重量份为：平卧菊三七45份、鱼腥草32份、草果10份、薤白18份、党参12份；制备得到的产品为对照品6。
[0064]
对比例7
[0065]
本对比例的组合物的制备方法和实施例1的唯一区别是在步骤(2)中浸泡的同时，不超声；制备得到的产品为对照品7。
[0066]
效果例1：在体外组合物对il-1β释放的影响
[0067]
考虑到il-1β是引起葡萄膜炎的重要炎症介质，因此，本发明使用脂多糖(lps)和尼日利亚菌素(nigericin)在小鼠骨髓巨噬细胞上构建nlrp3炎症小体激活介导炎症模型，可以特异性导致il-1β的释放；在此模型上，本发明评价筛选实施例1-5提供的的组合物1-5以及对比例1-7提供的对照品1-7对il-1β释放的影响。
[0068]
具体测试过程包括以下步骤：
[0069]
(1)小鼠骨髓巨噬细胞的提取：使用3月龄的c57bl/6小鼠提取骨髓源巨噬细胞(bmdm)，用异氟烷麻醉小鼠后处死，使用75％乙醇充分消毒后，置于超净工作台内，并用无菌pbs清洗2次；取小鼠双侧后腿，除去皮肤和肌肉组织以及后足，小心截取完整的股骨，并用无菌pbs清洗数次；用注射器吸取足量的预冷无菌pbs，并向股骨的骨髓腔内吹打，将腔内的骨髓细胞冲出，pbs溶液收集至50ml的离心管中，吹打过程用力缓慢，直至骨外观呈亮白色表明骨髓细胞几乎被完全冲出。将获得的粗细胞液通过细胞过滤网过滤，室温800rpm离心10min收集细胞，除去上清液后将细胞沉淀重悬于含有m-csf的f12-dmem的巨噬细胞完全培养基中，诱导分化后使用f4/80抗体标记进行流式细胞术鉴定；
[0070]
(2)细胞铺板与组合物或对照品对待：将提取的bmdm细胞铺与24孔板中，每孔2
×
105个细胞，置于含有5％co2的37℃培养箱中孵育过夜；3天后补加1ml分化培养基，7天后给予实施例1-5提供的组合物1-5以及对比例1-7提供的对照品1-7作用3小时，所用剂量均为0.1mg/ml，然后给予lps(100ng/ml)作用3小时，紧接着给予nigericin(10μm)刺激1小时，收集细胞培养液上清测定其中的il-1β含量；
[0071]
(3)根据elisa试剂盒说明书检测il-1β水平，具体步骤如下为：在elisa专用96孔板中加入捕获抗体100μl，置于4℃冰箱孵育过夜，去除捕获抗体并用缓冲液清洗3次；用200μl封闭液室温封闭1小时，吸取封闭液并用缓冲液洗涤至少1次；每孔加入100μl的系列浓度标准品或样品室温下孵育2小时，去除样品并用缓冲液清洗3次；向所有孔中加入100μl的检测抗体室温下孵育1小时，去除检测抗体并用缓冲液洗涤3次；每孔加入100μl的hrp标记二抗室温下孵育30分钟，去除二抗并用缓冲液洗涤5次；每孔加入100μl的tmb底物溶液室温下孵育15分钟；每孔加入100μl的终止液，振荡混匀后测量450nm处的吸光度；
[0072]
(4)根据检测得到的数据，再通过标准曲线计算样品中的il-1β的含量；结果如表1所示。
[0073]
表1：细胞培养液上清中il-1β的水平
[0074]
[0075][0076]
从表1可以看出，组合物1-5在0.1mg/ml的剂量下在体外都能可以显著的抑制il-1β的释放，抑制率都达到了61.7％以上，其中，组合物1显示除了最佳的抑制效果，其抑制率达到了72.4％，从组合物1-5可以看出，组合物1-3的抑制率高于组合物4-5，说明在本发明给出的优选范围内，组合物的抑制效果更明显；而相同剂量下的对照品1-7的抑制作用均低于组合物1，侧面说明了一方面本发明提供的组合物在发挥抑制il-1β释放的作用时并不是某一个或某几个成分所起的作用，而是各组分相互协同共同作用的结果，另一方面，也说明了采用本发明提供的制备方法制备得到的产品的抑制率高，也就是说，本发明提供的组合物各组分是一个不可分割的整体且制备方法也是保证效果的必要手段。
[0077]
效果例2：组合物对葡萄膜炎小鼠眼前节炎症临床评分的影响
[0078]
雄性7周龄balb/c小鼠，洁净级饲养条件：23
±
2℃，湿度55
±
5％，换气次数12～15次/小时，照明时间12小时/天(7:00～19:00)，自由饮水，适应性饲养一周后进行实验。
[0079]
实验小鼠随机分成正常对照组、葡萄膜炎模型组、组合物1 200和400mg/kg两个剂量组、组合物3 200和400mg/kg两个剂量组，以及对照品3 200和400mg/kg两个剂量组和对照品5 200和400mg/kg两个剂量组，每组10只；组合物和对照品连续1周灌胃给药，正常对照组和lps模型组给予同体积生理盐水，每天1次。在末次给药12小时后，构建小鼠急性葡萄膜炎模型；除正常对照组外，向其余各组小鼠足底注射lps(100μg/只)，正常对照组注射等容量生理盐水。分别在造模24和48小时后，于裂隙灯显微镜下观察小鼠眼前节炎症反应，并通过以下临床标准进行评分(chinese journal of pathophysiology,2017,33(11):2099-2102)：虹膜充血(0-3分)、前房渗出(0-2分)、前房积脓(0-1分)、瞳孔缩小(0-1分)；评分结果如表2所示：
[0080]
表2：小鼠眼前节炎症反应评分
[0081]
组别24小时48小时正常对照组0.00
±
0.000.00
±
0.00模型组7.83
±
0.985.00
±
0.89组合物1(200mg/kg)4.67
±
0.823.00
±
0.89组合物1(400mg/kg)3.33
±
0.521.33
±
0.52组合物3(200mg/kg)5.39
±
0.343.19
±
0.67组合物3(400mg/kg)4.06
±
0.691.59
±
0.31
对照品3(200mg/kg)6.07
±
0.543.46
±
0.68对照品3(400mg/kg)4.41
±
0.811.97
±
0.26对照品5(200mg/kg)6.83
±
0.983.67
±
0.82对照品5(400mg/kg)4.83
±
1.172.33
±
0.52
[0082]
从表2中的数据可以看出，正常对照组小鼠眼前节无葡萄膜炎体征，模型组小鼠出现明显的葡萄膜炎症状，造模24小时后临床炎症评分高达7.83
±
0.98。然而组合物1和组合物3两个剂型都显著改善了小鼠眼前节的炎性病变，降低了炎性评分，加速了葡萄膜炎的恢复，其中组合物1(400mg/kg)在24小时对模型组炎症的评分降低幅度约为57.47％；而对照品的两个剂型对炎症评分的降低效果都不明显。
[0083]
效果例3：组合物对小鼠眼组织中il-1β水平的影响
[0084]
采用效果例2中的实验小组及实验组别，进一步elisa技术检测小鼠眼组织中il-1β的水平。
[0085]
具体步骤如下：取小鼠虹膜睫状体及视网膜组织，加入10倍体积的pbs缓冲液机械匀浆破碎，12000rpm，4℃低温离心15分钟，收取上清测定其中的il-1β含量；其中elisa实验过程如效果例1所述。
[0086]
表3：小鼠眼组织中il-1β水平
[0087]
组别il-1β含量(pg/ml)正常对照组18.4
±
2.47模型组254.6
±
20.9组合物1(200mg/kg)161.5
±
34.8组合物1(400mg/kg)84.7
±
14.8组合物3(200mg/kg)185.6
±
20.4组合物3(400mg/kg)92.7
±
13.9对照品3(200mg/kg)201.4
±
21.7对照品3(400mg/kg)119.2
±
23.8对照品5(200mg/kg)221.3
±
24.9对照品5(400mg/kg)139.4
±
31.9
[0088]
从表3中可以看出，相较于正常对照组，模型组小鼠眼组织中il-1β含量超出其10倍以上，高达254.6
±
20.9pg/ml；而组合物1和3的两个剂量组都能显著降低小鼠眼组织中il-1β的水平，尤其是组合物1的400mg/kg剂量组，其相较于模型组中的il-1β含量下降幅度约达66.73％。
[0089]
效果例4：组合物对小鼠眼组织中nlrp3蛋白表达水平的影响
[0090]
采用效果例2中的实验小组及实验组别，进一步通过western blot技术检测组合物对小鼠眼组织中nlrp3蛋白表达的影响。
[0091]
具体实验步骤如下：
[0092]
(1)蛋白样品的制备：将小鼠眼组织匀浆后，冰浴裂解1小时，12000rpm，4℃低温离心20分钟，收取上清通过bca法检测蛋白浓度，加入1/4体积的5
×
loading buffer，100℃煮沸5分钟变性即得蛋白样品；
[0093]
(2)sds-page：蛋白上样30μg，60v恒压30分钟，120v恒压分离90分钟；
[0094]
(3)转膜：将蛋白从凝胶转至甲醇活化的pvdf膜上，300ma恒流转印60分钟；
[0095]
(4)封闭：5％脱脂牛奶常温封闭pvdf膜60分钟；
[0096]
(5)抗体孵育：tbst稀释nlrp3多克隆抗体(rabbit,1:2000)，置于4℃冰箱过夜；
[0097]
(6)hrp孵育：tbst稀释羊抗兔二抗-hrp(1:3000)室温孵育2小时；
[0098]
(7)ecl化学发光：将条带放入ecl工作液中充分接触，置于天能发光工作站进行成像，image j软件对蛋白条带进行半定量分析。
[0099]
表4：小鼠眼组织中nlrp3蛋白表达水平
[0100]
组别nlrp3相对水平正常对照组1.03
±
0.12模型组1.86
±
0.36组合物1(200mg/kg)1.48
±
0.27组合物1(400mg/kg)1.27
±
0.31组合物3(200mg/kg)1.52
±
0.24组合物3(400mg/kg)1.31
±
0.16对照品3(200mg/kg)1.62
±
0.29对照品3(400mg/kg)1.39
±
0.47对照品5(200mg/kg)1.68
±
0.26对照品5(400mg/kg)1.43
±
0.16
[0101]
从表4中可以看出，相较于正常对照组，模型组小鼠眼组织中nlrp3蛋白表达水平显著升高；而组合物1和3的两个剂量组都可以显著降低nlrp3蛋白表达水平，尤其是组合物1的400mg/kg剂量组，其相较于模型组中的nlrp3相对水平值下降幅度约达31.72％。
[0102]
效果例5：组合物对小鼠眼组织抗氧化能力的影响
[0103]
采用效果例2中的实验小组及实验组别，进一步进行小鼠眼组织的抗氧化能力的测定，其中小鼠眼组织的抗氧化能力通过氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity,orac)实验测定；
[0104]
具体制备步骤如下：
[0105]
(1)眼组织样品预处理：分离小鼠虹膜睫状体及视网膜组织并加入3％高氯酸溶液制备2％的眼组织匀浆液，4℃条件下以10000r/min离心15min，取上清液作为测定orac的样品溶液；
[0106]
(2)orac实验过程：在96孔板中加入不同组别小鼠的20μl眼组织匀浆上清液，再加入140μl aaph和20μl磷酸盐缓冲液，最后添加20μl荧光素钠后迅速将96孔板置于设置温度37℃的荧光酶标仪中开始测定。每2min测定一个点，共测定2h；
[0107]
(3)计算：orac值以1μmol/l的trolox在荧光衰减曲线上对应的保护积分面积作为标准对照计算，计算结果如表5所示。
[0108]
表5：小鼠眼组织的orac抗氧化能力指数
[0109]
组别orac(μmol/l trolox eq.)正常对照组168.3
±
17.9模型组94.2
±
9.47组合物1(200mg/kg)121.5
±
10.1
组合物1(400mg/kg)147.6
±
12.6组合物3(200mg/kg)115.9
±
9.8组合物3(400mg/kg)132.7
±
6.2对照品3(200mg/kg)108.3
±
7.6对照品3(400mg/kg)124.3
±
10.5对照品5(200mg/kg)102.1
±
9.8对照品5(400mg/kg)113.9
±
11.3
[0110]
从表5的数据可以看出，与lps诱发小鼠葡萄膜炎模型组相比，组合物1和3的两个剂量组都能明显增强小鼠眼组织的抗氧化能力(p《0.05)，而对照品对小鼠眼组织的抗氧化能力增强效果不明显。
[0111]
最后应当说明的是，以上实施例以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。