1.本发明属于农业微生物技术领域，涉及昆虫病原微生物菌株及其防治应用，具体涉及一株具有杀虫、杀螨活性的昆虫病原真菌及其应用。


背景技术：

2.蔬菜生产过程中，多种害虫、害螨同时发生危害，给作物带来严重的经济损失。害螨类主要包括二斑叶螨tetranychus urticae、截形叶螨tetranychus truncatus和侧多食跗线螨polyphagotarsonemus latus等，害虫包括蚜虫、粉虱和蓟马等。这些害虫体型微小，田间肉眼难以识别，以刺吸式口器刺吸植物汁液，夺取植物营养，进而造成为害。喷施化学药剂是对抗害虫的常用防控方式，但害虫存在不同程度的对化学药剂的耐性及抗性。尤其值得关注的是，世界范围内的重要农业害螨二斑叶螨是抗药性和耐药性最强的有害生物之一，因此其化学防控面临最严重挑战。同时，害螨为害作物广泛，包括蔬菜、果树、棉花和玉米等在内的1100余种寄主植物(van leeuwen et al.,2010)，均可受到害螨为害；二斑叶螨还有一个特点，其生命周期短、繁殖力强、孤雌生殖等，这些特性导致此类害虫对大多数杀虫剂均产生了不同程度的抗性，使得其化学防控变得更为困难，还伴随着大量施用化学农药带来的杀伤天敌、破坏生态等负面影响。因此，寻求新型环境友好的可持续防治技术至关重要，其中生物防治手段因其绿色、安全无害等优势受到越来越多的重视。
3.二斑叶螨等有害生物的生物防治的研究多集中在捕食螨等天敌的挖掘应用及微生物防治等方面。在自然界中，昆虫病原真菌广泛存在，作为综合害虫管理ipm项目计划的一部分，它们是平衡自然界中昆虫种群数量的重要生防微生物。目前我国已发现的寄生在节肢动物中的昆虫病原真菌约200多种，除球孢白僵菌beauveria bassiana(balsamo)vuillemin、汤普森被毛孢hirsutella thompsonii fisher等已被开发真菌制剂用于二斑叶螨的生物防治外，与害螨相关真菌的研究大多集中于分类及生态学研究，在生物防治尤其对害螨致病性研究方面有限，因此，筛选应用具有杀虫、杀螨活性的真菌对于蚜虫、二斑叶螨这样的抗性害虫、害螨的无害化绿色防控技术的研发具有重要的理论和实践意义。
4.在前期研究中，实验室内饲养的二斑叶螨种群受到一种未知菌侵染，本研究从受到侵染的病死螨体上分离病原菌，首先进行种类鉴定，然后研究病原菌对二斑叶螨及其他害虫害螨的致病潜能，为进一步研发其生物防控技术提供科学依据。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是为开发新的真菌杀虫剂提供材料，提供一株防治害螨的高效菌株。
6.本发明的另一目的是提供所述菌株在防治叶螨及其他害虫种群方面的应用。
7.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
8.一株白色类酵母菌株(pseudozyma flocculosa)，其特征在于，于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23345。
9.进一步本发明提供所述的白色类酵母菌株在防治害虫、害螨中的应用。
10.优选地，所述的害虫是蚜虫；所述害螨是叶螨、跗线螨。
11.更具体地，所述叶螨是二斑叶螨。
12.具体实施方式中，其是通过将所述菌株的孢子悬浮液喷施在植物叶片上进行防治。
13.优选地，所述菌株的孢子悬浮液的浓度为108～109。
14.其中，所述植物是蔬菜。
15.更优选地，所述蔬菜是茄子、黄瓜。
16.本发明还提供一种防治害虫或害螨的制剂，其含有中所述的白色类酵母菌作为有效成分。更具体地，所述的白色类酵母菌以孢子悬浮液的形式存在。
17.该菌株的孢子悬浮液喷施在带有蚜虫、侧多食跗线螨等其他害虫、害螨的植物叶片上，该菌株同样可以侵染蚜虫和侧多食跗线螨，并且高浓度108～109条件下，一周时间即可使测试种群受侵染而致死，表明该菌株可广泛侵染同时期发生的蔬菜上的害虫和害螨。
18.本发明所述白色类酵母菌株一方面对测试二斑叶螨种群具有优异的侵染和致病活性，具有生物防治的潜力；本发明所述的菌株另一方面还是一种昆虫病原真菌，除了对二斑叶螨具有杀螨活性，还可有效侵染蚜虫、侧多食跗线螨等其它害虫、害螨，而体现出其具有广谱杀虫活性，具有田间开发应用的巨大潜力。此外，本发明的菌株所在属的菌还可有效防治植株上的白粉病，因此田间应用预期可实现病虫兼治的效果，应用前景巨大。同时，本发明菌株具有绿色安全、对人畜无毒、害虫、害螨不易对其产生抗性等特征，符合绿色健康农产品的生产需求，有潜力开发成为新型微生物源杀虫杀螨剂。
19.所述白色类酵母菌株pseudozyma flocculosa已于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23345。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
20.图1 pftu-x菌株在pda培养基上的培养特征
21.图2 pftu-x菌株培养24h后的孢子形态
22.图3 pftu-x菌株基于its序列采用邻接法构建的系统发育树
23.图4二斑叶螨受pftu-x菌株侵染的症状
24.图5蚜虫受pftu-x菌株侵染的症状
25.图6侧多食跗线螨受pftu-x菌株侵染的症状。
26.图7喷施菌液后表现正常的茄子植株和黄瓜植株。
具体实施方式
27.实施例1 pftu-x菌株的分离培养
28.病原菌的分离培养采用组织分离法并改良，病原菌采集自实验室内继代饲养、自然死亡的二斑叶螨种群。室内用无菌水漂洗5次，用接种针接种于马铃薯琼脂固体培养基(pda)平板，置于26℃恒温培养箱培养2～3d。将长出的菌丝挑入新的pda平板重复纯化3次。纯菌落接种于pda试管斜面，菌丝长满斜面后于4℃冰箱保存。在前期实验中，在众多的单菌
落中分离获得了具有一定效果的2个菌株，序列测定是一致的。测定结果发现菌株对二斑叶螨具有一定的侵染性和致死活性，第1个株系pftu-1在107浓度处理带螨叶片一周时间后，处理组叶螨的校正死亡率为44.45％，低于相同浓度(107)下第2个株系pftu-x对叶螨的侵染致死活性(表1)。
29.表1菌液处理后二斑叶螨的校正死亡率初步试验
[0030][0031]
经过筛选确认效果最佳的菌株命名为pftu-x。该菌株于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23345。
[0032]
实施例2 pftu-x菌株的形态学鉴定
[0033]
菌株单孢纯化后接种在装有灭菌的马铃薯葡萄糖肉汤(pdb)的三角瓶中，(28
±
1)℃摇床上振荡培养72h后，利用新鲜培养物制作水浸片在倒置显微镜(olympus ix53)下进行观察，并进行特征结构的显微拍照。观察表明，菌落白色呈圆形，有绒毛状突起，周边波状(图1)。菌株pftu-x生长迅速且无假根，孢囊孢子呈球形椭圆形或柱形，有附属丝(图2)，与以前报道中的描述相比，推测为pseudozyma flocculosa。
[0034]
实施例3 pftu-x菌株的系统发育树分析
[0035]
刮取pda平板上28℃培养7d孢子囊壳明显的菌体，按照植物基因组dna提取试剂盒(dp305-02，天根生化科技有限公司，北京)说明书提取总dna。采用真菌鉴定通用引物its1 5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
/its2 5
′‑
gctgcgttcttcatcgatgc-3
′
；its1(同上)/its4r 5
′‑
tcctccgcttattgatatgc-3
′
进行目的片段的扩增。反应体系：0.1u taq e/ml 2
×
es mix 10μl，its primer forward/reverse primer(10mm)各1μl，dna 2μl，ddh2o 6μl。pcr反应条件：94℃4min；94℃45s,55℃45s,72℃1min,共35个循环；72℃延伸10min。pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生物工程有限公司测序，获得序列提交到ncbi数据库进行blast分析比对，blastn分析结果显示，菌株pftu-x的rdna-its区序列(是序列表1)与pseudozyma flocculosa的序列相似性达99.85％，也表明该菌株为pseudozyma flocculosa。。
[0036]
基于试验菌株的rdna-its区序列构建系统发育树：利用dnaman进行多重比对，并通过mega7.0软件的邻接法(neighbor joining,nj)进行1000次bootstrap校验节点的置信度。以ganoderma lucidum作为菌株pftu-x的外类群，构建系统发育树。在发育树中与pseudozyma flocculosa也聚为一支，表明其亲缘关系为高度同源(图3)。
[0037]
因此，本发明利用组织分离法分离到一株病原菌pftu-x，对其进行形态学和分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为pseudozyma flocculosa。
[0038]
实施例4 pftu-x菌株对二斑叶螨的毒力测定
[0039]
供试二斑叶螨敏感品系ipp-ss由中国农业科学院植物保护研究所提供，引种后该
种群置于温度26
±
3℃的温室内干净无虫无农药污染的“碧丰”菜豆植株上进行饲养。
[0040]
根据柯赫氏法则验证病原菌致病性。挑取室内二斑叶螨雌成螨20头至培养皿内新鲜叶片中，取培养7d后的病原菌发酵液用无菌水按照梯度稀释法分别配制109孢子/ml、108孢子/ml、107孢子/ml、106孢子/ml菌液，处理方法为：采用手持喷壶对带螨叶片进行三次喷雾，后将其至(26.5
±
1)℃、相对湿度75％的人工气候箱中饲养。每个处理设置3次重复。接种后每日观察叶螨感染和死亡情况，对照组用无菌水处理。
[0041]
死亡率与校正死亡率根据公式计算：死亡率(％)＝死亡螨数/处理前螨数
×
100％；校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)
×
100％。结果显示，所测试的菌株在4个浓度下对测试二斑叶螨雌成螨均具有较高毒力，处理1周后，各处理叶螨死亡率超过85％，其中，在8
×
109孢子/ml浓度下该菌株对成螨毒力活性更高。处理9天后的叶螨的校正死亡率为100.00％。
[0042]
具体结果如下：
[0043]
实验室内根据柯赫氏法则验证病原菌pftu-x对二斑叶螨的致病性，结果如表1所示：病原菌pftu-x处理组在处理后第1天，即有成螨死亡，其中8
×
109孢子/ml处理组，1天后校正死亡率最高，为16.60％；病原菌处理的第1天到第2天毒力活性作用缓慢，校正死亡率处于3.57％～19.23％；在第3天到第9天，测试叶螨的死亡数增长迅速，校正死亡率从30.61％升至100.00％。最高浓度8
×
109孢子/ml处理组在测试浓度范围内对二斑叶螨成螨的毒力活性最高，各处理9天后，测试叶螨全部感染真菌而死亡(表2)。同时，试验中二斑叶螨受侵染症状与其自然感染症状一致，从第2天开始出现症状，逐渐加重，第5天时，整个螨体被菌丝包围(图4)。空白对照组的二斑叶螨在测试第2天出现有自然死亡现象，但整个实验过程中，对照组的死亡螨体未长出任何菌丝。
[0044]
实施例5菌株pftu-x对侧多食跗线螨的毒力测定
[0045]
按照实施例4中所述方法培养获得不同浓度的孢子悬浮液，测定pftu-x菌株对侧多食跗线螨成螨的毒力活性，结果表明，随时间延长，测试侧多食跗线螨逐渐被真菌所侵染(图5)，其校正死亡率逐渐升高。菌液处理后2天，处理中开始有侧多食跗线螨出现死亡，校正死亡率最高出现在109浓度处理中，为16.95％；第4天，最高测试浓度下侧多食跗线螨的校正死亡率超过85％；处理第6天，106～109孢子/ml的菌液处理中，侧多食跗线螨的校正死亡率依次为66.93％、90.17％、100％和100％(表3)。
[0046]
实施例6菌株pftu-x对蚜虫的毒力测定
[0047]
按照实施例4中所述方法培养获得不同浓度的孢子悬浮液，测定pftu-x菌株对瓜蚜的毒力活性，结果表明，随时间延长，测试瓜蚜逐渐被真菌所侵染，受侵染状见图6，且其校正死亡率逐渐升高。菌液处理后1天，各处理中开始有蚜虫出现死亡，校正死亡率最高出现在109浓度处理中，为11.50％；第4天，各浓度处理的校正死亡率明显升高，最高测试浓度下试虫的校正死亡率为81.86％；处理第5天，106～109孢子/ml的菌液处理中，试虫的校正死亡率依次为91.55％、96.98％、100％和100％(表4)。
[0048]
实施例7菌株的作物安全性实验
[0049]
将pftu-x病原菌的107和108孢子悬浮液采用手持喷壶分别对茄子、黄瓜等植株进行叶片喷雾后，持续观察7～10d，处理植株叶片未出现有变色、萎蔫、发白、生长停滞等不正常表现或药害类似症状，如图7所示，处理后的植株和正常生长植株无差异，说明其对作物
是安全的。
[0050]
[0051]