plk4抑制剂(1r,2s)-(e)-2-(3-(4-((顺式-2,6-二甲基吗啉)甲基)苯乙烯基)-1h-咪唑-6-基)-5
′‑
甲氧基螺[环丙烷-l,3
′‑
吲哚啉]-2
′‑
酮富马酸盐的晶型s4
[0001]
相关申请的交叉引用
[0002]
本技术要求2019年4月24日提交的美国临时申请序列号62/837,858的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文


背景技术：

[0003]
丝氨酸/苏氨酸激酶的polo样激酶(plk)家族包含至少四个已知成员：plk1、plk2(也称为snk)、plk3(也称为fnk或prk)和plk4(也称为sak)，抑制plk4的药物具有治疗癌症的潜力。美国专利第8,263,596；8,481,525和8,481,533(其全部教导通过引用并入本文)公开了许多有效的plk4抑制剂。这些专利中公开的一种抑制剂的结构如下化合物(i)所示：
[0004][0005]
需要这种化合物的盐形式，它是结晶的并且具有适合大规模生产的物理性质。还需要药物制剂，其中这一候选药物是稳定的并且能有效地递送给患者。
[0006]
在这个背景下，美国专利第9,884,855号公开了化合物(i)的1:1富马酸盐的几种晶型，包括作为潜在抗癌候选药物的晶型d。美国专利第9,884,855号的全部教导通过引用并入本文。“1:1”是指富马酸与化合物(i)的摩尔比。


技术实现要素：

[0007]
如美国专利第9,884,855号所述，选择晶型d进行放大是因为它可以以结晶状态生产，吸湿性低，是一种具有良好的溶解性和有利的药代动力学特性的有效的抗癌剂。然而，后来发现在大规模制造过程中生产晶型d会导致不同晶型的混合物(参见实施例3)。
[0008]
现已发现一种称为“s4”的新晶型，其具有晶型d的有益特性，(例如，具有低吸湿性和良好的溶解性，并具有优异的药代动力学特性(参见实施例6和7))。更重要的是，它克服了与晶型d相关的问题。具体而言，晶型s4可以以高产率和高纯度制备并且易于放大(参见实施例4和5)。
[0009]
因此，本发明提供一种化合物(i)的富马酸盐，其中化合物(i)与富马酸的摩尔比为1:1且该富马酸盐包含(是)晶型s4，其特征在于x-射线粉末衍射(xrpd)图谱包含位于6.6
°
、9.8
°
、16.3
°
、21.1
°
、28.7
°
和30.2
°±
0.2 2θ处的峰。
[0010]
本公开还提供了一种药物组合物，其包含化合物(i)的1:1富马酸盐的晶型s4和药
学上可接受的载体或稀释剂。
[0011]
本公开还提供了制备化合物(i)的1:1富马酸盐的晶型s4的方法。该方法包括将富马酸和化合物(i)溶解在包含2-丁酮、水和乙醇的溶解溶剂(dissolution solvent)中，以形成结晶溶液，然后从结晶溶液中沉淀出晶型s4，其中化合物(i)与富马酸在溶解溶剂中的摩尔比为约1:1至约1:1.3；化合物(i)与富马酸在化合物(i)的富马酸盐中的摩尔比为1:1。一方面，富马酸和化合物(i)的溶解在升高的温度下发生，晶型s4从结晶溶液中的沉淀是通过冷却和/或在冷却下加入甲基环己烷。
[0012]
还提供了一种治疗癌症的方法。该方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的化合物(i)的1:1富马酸盐的晶型s4。
[0013]
还提供了化合物(i)的富马酸盐的晶型s4在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
[0014]
还提供了用于治疗癌症的化合物(i)的富马酸盐的晶型s4。
附图说明
[0015]
图1描述了来自100g产物的化合物(i)的1:1富马酸盐的晶型s4的x-射线粉末衍射图谱(xrpd)。
[0016]
图2描述了来自实施例5中大规模生产的化合物(i)的1:1富马酸盐的晶型s4的x-射线粉末衍射图谱(xrpd)。
[0017]
图3显示了用晶型d和晶型s4给药后的剂量-归一化暴露。
具体实施方式
[0018]
本公开提供化合物(i)的1:1富马酸盐的新晶型s4和相应的药物组合物。本公开还提供了一种以可再现和可扩展的方式以优异的产率和纯度制备晶型s4的新方法。此外，本公开提供了一种治疗癌症的方法。
[0019]
化合物(i)的1:1富马酸盐的晶型
[0020]
在一些实施方案中，至少特定重量百分比的化合物(i)的1:1富马酸盐是单一晶型。特定重量百分比包括70％、72％、75％、77％、80％,82％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-100％、70-80％、80-90％、90-100％的重量百分比范围。例如，在一个实施方案中，至少80％(例如，至少90％或99％)重量的1:1化合物(i)富马酸盐是单一晶型。应当理解的是，这些值和范围之间的所有值和范围旨在被本公开所涵盖。
[0021]
本文所用“结晶”是指具有晶体结构的固体，其中单个分子具有高度均匀的规则锁定化学构型(locked-in chemical configuration)。化合物(i)的1:1富马酸盐结晶可以是化合物(i)的1:1富马酸盐的单一晶型的晶体，或不同单一晶型的晶体的混合物。单一晶型是指化合物(i)的1:1富马酸盐作为单晶体或多晶体(其中每个晶体具有相同的晶型)。
[0022]
当特定重量百分比的化合物(i)的1:1富马酸盐呈单一晶型时，富马酸盐的其余部分是无定形富马酸盐和/或不包括该单一晶型的1:1化合物富马酸盐的一种或多种其他晶型的组合。当化合物(i)的1:1富马酸盐结晶被定义为化合物(i)的1:1富马酸盐的一种特定晶型的特定百分比时，其余部分由除指定的一种或多种特定形式之外的无定形形式和/或
晶型组成。单一晶型的实例包括1:1化合物(i)富马酸盐的晶型s4，其特征在于如本文所讨论的一种或多种性质。
[0023]
在另一个实施例中，按重量计小于30％、25％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％化合物(i)的1:1富马酸盐是晶型d。样品中晶型s4相对于晶型d的量可以通过制备一系列具有已知重量比的晶型s4和晶型d的混合物并获得每种的xrpd谱来评估。样品中晶型s4与晶型d的相对量通过选择晶型s4和晶型d的一个或多个特征峰并将它们在样品xrpd中的相对强度与它们在混合物xrpds中的相对强度相关联来评估。美国专利第9,884,855号的表4中提供了晶型d的特征xrpd峰。
[0024]
化合物(i)的1:1富马酸盐相对于其他立体异构体的重量纯度，即所述立体异构体的重量与所有立体异构体的重量比，至少为60％、70％、80％、90％、99％或99.9％。
[0025]
化合物(i)的1:1富马酸盐晶型s4的制备
[0026]
化合物(i)固体形式的1:1富马酸盐可例如通过缓慢蒸发、缓慢冷却和抗溶剂沉淀来制备。本公开提供了一种以可重现和可扩展的方式制备晶型s4，并提高产率和纯度的新的结晶过程。
[0027]
本文所用“反溶剂”是指在其中化合物(i)的1:1富马酸盐具有低溶解度，导致富马酸盐以精细粉末或晶体形式从溶液中沉淀出来的溶剂。
[0028]
或者，化合物(i)的1:1富马酸盐可以在加入或不加入晶种的情况下从合适的溶剂中重结晶。
[0029]
在一个实施方案中，化合物(i)的1:1富马酸盐的晶型s4可以通过将富马酸和化合物(i)溶解在包含2-丁酮、水和乙醇的溶解溶剂中形成结晶溶液，然后从结晶溶液中析出s4晶型来制备，其中化合物(i)与富马酸在溶解溶剂中的摩尔比为约1:1至约1:1.3；且化合物(i)的富马酸盐中化合物(i)与富马酸的摩尔比为1:1。在该实施方案的一个方面，富马酸和化合物(i)的溶解在升高的温度下发生，并且晶型s4从结晶溶液中的沉淀是通过冷却和/或在冷却下加入甲基环己烷。
[0030]
在另一个实施方案中，化合物(i)的1:1富马酸盐的晶型s4通过以下方式制备：(i)在升高的温度下将化合物(i)溶解在2-丁酮和水的混合物中以形成化合物(i)溶液；(ii)在升高的温度下将富马酸溶解在乙醇中以形成富马酸溶液；(iii)在升高的温度下将富马酸溶液加入到化合物(i)溶液中以形成结晶溶液；(iv)任选地在升高的温度下向结晶溶液中加入晶种；和(v)降低结晶溶液的温度以沉淀s4晶型。在该实施方案的一个方面，2-丁酮与水的体积比在80:20至98:2之间(例如90:10至98:2)，且2-丁酮/水与乙醇与甲基环己烷的体积比是6-7比4-5比11-22；升高的温度在45℃和55℃之间；并且降低的温度在20℃和30℃之间。在该实施方案的另一个方面，所述方法进一步包括在降低的温度下向结晶溶液中加入甲基环己烷以沉淀s4晶型。在一个具体方面，降低的温度在20℃和30℃之间。在另一个具体方面，进一步降低结晶溶液的温度以沉淀s4晶型。在更具体的方面，进一步降低的温度在0℃和10℃之间。
[0031]
化合物(i)的1:1富马酸盐单晶型s4的表征
[0032]
在一个实施方案中，晶型s4显示出具有对应于2θ角峰位置的尖峰和平坦基线的独特的xrpd图谱，表明高度结晶材料(参见图1)。xrpd图谱是从在40v/30ma下运行的铜辐射源(cukα；)获得的。在一个具体实施方案中，晶型s4是化合物(i)的1:1富马酸
盐的单一晶型，其特征在于x-射线粉末衍射图谱包含位于6.6
°
、9.8
°
、16.3
°
、21.1
°
、28.7
°
和30.2
°
处的峰。在另一个具体实施方案中，晶型s4的特征在于x-射线粉末衍射图谱，其包含位于6.6
°
、9.8
°
、16.3
°
、21.1
°
、28.7
°
、29.4
°
和30.2
°
处的峰。在另一个具体实施方案中，晶型s4的特征在于x-射线粉末衍射图谱，其包含位于6.6
°
、9.8
°
、13.0
°
、16.3
°
、19.5
°
、21.1
°
、22.5
°
、28.7
°
、29.4
°
和30.2
°
处的峰。在又一个具体实施方案中，晶型s4的特征在于x-射线粉末衍射图谱，其包含位于6.6
°
、9.8
°
、13.0
°
、16.3
°
、19.5
°
、21.1
°
、22.5
°
、22.9
°
、23.9
°
、28.7
°
、29.4
°
和30.2
°
处的峰。在又一个具体实施方案中，晶型s4的特征在于x-射线粉末衍射图谱，其包含位于6.6
°
、9.8
°
、11.6
°
、13.0
°
、16.3
°
、17.1
°
、19.5
°
、21.1
°
、21.5
°
、22.0
°
、22.5
°
、22.9
°
、23.9
°
、24.3
°
、28.7
°
、29.4
°
和30.2
°
处的峰。
[0033]
在又一个具体实施方案中，晶型s4的特征在于基本上类似于图1的x-射线粉末衍射图。
[0034]
当两个衍射图中信号的至少90％，例如至少95％、至少98％或至少99％在2θ
±
0.2处相同时，本文所用x-射线粉末衍射图是“与[特定]图中的基本相似”。在确定“相似性”时，本领域普通技术人员将理解，即使对于相同的晶型，xrpd衍射图谱中的强度和/或信号位置也可能存在差异。因此，本领域普通技术人员将理解，xrpd衍射图谱中的信号最大值(以本文所指的2θ度(
°
2θ)计)，通常是指报告值的
±
0.2 2θ度，如以下所讨论的本领域公认的变化。
[0035]
晶体学领域众所周知，对于任何给定的晶型，角峰位置可能会因温度变化、样品位移以及是否存在内标等因素而略有不同。在本公开中，角峰位置的可变性为2θ中的
±
0.2。此外，给定晶型的相对峰强度可能因用于xrpd分析的样品准备过程中微晶尺寸和非随机微晶取向(non-random crystallite orientations)的差异而变化。本领域众所周知，这种可变性可解释上述因素，而不会妨碍对晶型的明确鉴定。
[0036]
治疗方法
[0037]
众所周知，plk4作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶polo家族的成员，参与细胞有丝分裂进程。因此，这种酶的小分子抑制剂可能是潜在的抗癌剂。
[0038]
本公开提供了通过向受试者施用有效量的晶型s4来治疗患有可通过抑制plk4改善的疾病的受试者的方法，例如治疗癌症或抑制肿瘤生长。因此，晶型s4通过诱导肿瘤细胞的凋亡或通过抑制肿瘤细胞的增殖来抑制肿瘤的生长。
[0039]
可以通过所公开的方法治疗的特定癌症包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、肉瘤、副肿瘤、骨肉瘤、生殖细胞瘤、胶质瘤和间皮瘤。在一个具体的实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、淋巴瘤、白血病、骨肉瘤、生殖细胞瘤、神经胶质瘤、纤维肉瘤、胃肠肉瘤、纤维组织细胞瘤、圆细胞肉瘤、滑膜肉瘤、宫颈癌、肛门生殖器癌、头颈癌和口咽癌。在一个具体的实施方案中，癌症是肺癌、结肠癌、脑癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤、多形性胶质母细胞瘤或卵巢癌。在另一个具体的实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤、多形性胶质母细胞瘤或卵巢癌。在另一个具体的实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌和结肠癌。在又一个具体的实施方案中，癌症是乳腺癌。在又一个具体的实施方案中，癌症是基底亚型乳腺癌或管腔b亚型乳腺癌。在一个实施方案中，基底亚型乳腺癌是er(雌
激素受体)、her2和pr(孕激素受体)阴性乳腺癌。在又一个具体实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌。根据asco/cap临床实践指南，术语“三阴性乳腺癌”是指雌激素、孕激素和her2检测阴性的乳腺癌。在一些实施方案中，三阴性乳腺癌是不可切除的或转移性的。在一个具体实施方案中，上述方法用于治疗患有胰腺癌的受试者，其中所述胰腺癌是腺癌。在另一个特定的实施方案中，胰腺癌是缺氧的。在又一个特定的实施方案中，胰腺癌是非缺氧的。
[0040]
通过本文所公开的方法还可以治疗软组织癌。“软组织癌”是本领域公认的术语，其包括源自身体任何软组织的肿瘤。这种软组织连接、支撑或包围身体的各种结构和器官，包括但不限于平滑肌、骨骼肌、肌腱、纤维组织、脂肪组织、血管和淋巴管、血管周围组织、神经、间充质细胞和滑膜组织。因此，软组织癌可以是脂肪组织、肌肉组织、神经组织、关节组织、血管、淋巴管和纤维组织的。软组织癌可以是良性或恶性的。通常，恶性软组织癌被称为肉瘤或软组织肉瘤。软组织肿瘤的种类很多，包括脂肪瘤、脂肪母细胞瘤、冬眠瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维瘤、许旺氏细胞瘤(神经鞘瘤)、神经瘤、恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、神经源性肉瘤、结节性腱鞘炎,滑膜肉瘤、血管瘤、血管球瘤,血管外皮细胞瘤,血管内皮瘤,血管肉瘤,卡波西肉瘤,淋巴管瘤,纤维瘤,弹性纤维瘤,浅表性纤维瘤病,纤维组织细胞瘤,纤维肉瘤,纤维瘤病,隆突性皮肤纤维肉瘤(dfsp),恶性纤维组织细胞瘤(mfh),粘液瘤、颗粒细胞瘤、恶性间质瘤、肺泡状软组织肉瘤、上皮样肉瘤、透明细胞肉瘤和促纤维增生性小细胞瘤。在一个具体实施方案中，软组织癌是选自纤维肉瘤、胃肠肉瘤、平滑肌肉瘤、去分化脂肪肉瘤、多形性脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、圆细胞肉瘤和滑膜肉瘤的肉瘤。术语“有效量”是指当施用于受试者时，与对照相比在受试者中产生有益或期望结果的量，包括临床结果，例如抑制、压抑或减少癌症的量(例如，根据临床症状或癌细胞的量确定)。
[0041]
本文所用“治疗患有癌症的受试者”包括部分或基本上实现以下一项或多项：阻止癌症的生长、降低癌症的程度(例如减小肿瘤的大小)、抑制癌症的生长速度，缓解或改善与癌症相关的临床症状或指标(例如组织或血清成分)或延长受试者的寿命；及降低癌症复发的可能性。
[0042]
本文所用术语“降低癌症复发的可能性”是指在缓解期后抑制或延迟原发部位或附近和/或继发部位的癌症回复。这也意味着与不治疗相比，使用本文所述的治疗不太可能使癌症复发。
[0043]
本文所用术语“缓解”是指癌症的状态，其中与癌症相关的临床症状或指标已经消失或不能被检测到，通常在受试者已经成功地用抗癌疗法治疗之后。
[0044]
通常，本公开化合物的有效量取决于各种因素而变化，例如给定的药物或化合物、药物制剂、给药途径、疾病或病症的类型、被治疗的受试者或宿主的身份等，但仍然可以由本领域技术人员常规确定。普通技术人员可以通过本领域已知的常规方法容易地确定本公开的化合物的有效量。
[0045]
在一个实施方案中，化合物(i)的1:1富马酸盐的有效量为约0.01至约1000mg/kg体重，或者约0.05至约500mg/kg体重，或者约0.1至约100mg/kg体重，或者约0.1至约15mg/kg体重，或者约1至约5mg/kg体重，以及在另一个备选方案中，约2至约3mg/kg体重。技术人员会理解，某些因素可能会影响有效治疗患有癌症的受试者所需的剂量，这些因素包括但不限于疾病或障碍的严重程度、以前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄和其他疾病
的存在。
[0046]
此外，用本公开化合物(i)的富马酸盐的有效量对受试者的“治疗”方案可以由单次给药组成，或者可选地包含一系列应用。例如，化合物(i)的1:1富马酸盐可以每周至少给药一次。然而，在另一个实施方案中，对于给定的治疗，可以将化合物从每周约一次至每天一次施用于受试者。治疗期的长短取决于多种因素，例如疾病的严重程度、患者的年龄、本公开的化合物的浓度和活性或其组合。还应当理解，用于治疗或预防的化合物的有效剂量可以在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断测定可以导致剂量的变化并且变得明显。在某些情况下，可能需要长期给药。
[0047]“受试者”是哺乳动物，优选人类，但也可以是需要兽医治疗的动物，例如伴侣动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
[0048]
如本领域技术人员所理解的，本公开的化合物可以根据所选择的给药途径以多种形式给予患者。本公开的化合物可以例如通过口服、肠胃外、口腔、舌下、鼻、直肠、贴剂、泵或透皮给药和相应配制的药物组合物给药。肠胃外给药包括静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、经上皮、鼻、肺内、鞘内、直肠和局部给药方式。肠胃外给药可以通过在选定的时间段内的连续输液。
[0049]
药物组合物和给药方法
[0050]
本文公开的化合物(i)晶型s4的1:1富马酸盐可适当地配制成药物组合物以施用于受试者。在一个实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，其包含如上所述的晶型s4和药学上可接受的载体或稀释剂，其中至少80％(优选90％，更优选99％)重量的盐是晶型s4。
[0051]
本教导的药物组合物任选地包括一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂，例如乳糖、淀粉、纤维素和葡萄糖。还可以包括其他赋形剂，如调味剂；甜味剂；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯。更完整的合适赋形剂列表可以在药用辅料手册(handbook of pharmaceutical excipients)(第5版，药物出版社(pharmaceutical press)(2005))中找到。本领域技术人员会知道如何制备适用于各种给药途径的制剂。例如，在雷明顿制药科学(remington's pharmaceutical sciences)(2003年第20版)和1999年出版的美国药典：国家处方集(usp 24nf19)中描述了用于选择和制备合适制剂的常规程序和成分。在与药物组合物的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体、稀释剂和/或赋形剂是“可接受的”。
[0052]
通常，对于口服治疗性给药，本教导的化合物可以与赋形剂结合并以可摄取片剂、含服片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、干胶片剂等形式使用。
[0053]
通常，对于肠胃外给药，本教导的化合物的溶液通常可以在与表面活性剂例如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、dmso及其混合物(含或不含醇)和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
[0054]
通常，对于注射用途，本文所述化合物的无菌水溶液或分散体和无菌粉末(用于临时制备无菌注射溶液或分散体)是合适的。
[0055]
对于经鼻给药，本教导的化合物可以配制成气雾剂、滴剂、凝胶剂和粉末剂。气雾剂制剂通常包含在生理学上可接受的水性或非水性溶剂中的活性物质溶液或精细悬浮液(fine suspension)，并且通常在密封容器中以无菌形式以单剂量或多剂量存在，密封容器
可以采用药筒(cartridge)或再填充物的形式与雾化装置一起使用。或者，密封容器可以是一体式分配装置，例如单剂量鼻吸入器或装有计量阀的气雾剂分配器，用于在使用后处置。当剂型包含气雾剂分配器时，它将包含推进剂，该推进剂可以是压缩气体如压缩空气或有机推进剂如氟氯烃。气雾剂剂型也可以采用泵式雾化器的形式。
[0056]
对于口腔或舌下给药，本教导的化合物可以与载体例如糖、阿拉伯胶、黄蓍胶或明胶和甘油一起配制为片剂、锭剂或软锭剂。
[0057]
对于直肠给药，本文所述的化合物可以配制成含有常规栓剂基质如可可脂的栓剂形式。
[0058]
本公开通过以下实施例进行说明，这些实施例不旨在以任何方式进行限制。
[0059]
具体实施方案
[0060]
实验
[0061]
缩写
[0062][0063]
[0064][0065]
分析条件
[0066]
x射线粉末衍射(xrpd)：
[0067]
在panalytical cubix-pro x-射线粉末衍射仪或bruker d8 advance xrp衍射仪上进行样品分析。
[0068]
分析条件：将样品放置在归零超微硅样品架(silicon zero-return ultra-micro sample holder)上。用铜k-αx-射线照射样品，x-射线管在40kv/30ma下运行。样品在3至45
°
范围内以连续模式扫描。
[0069]
bruker d8 advance xrp仪器参数：使用在40kv/40ma下运行的高功率铜靶。使用psd开口为2.1
°
的lynxeye检测器。样品在4-40
°
(2σ)的范围内进行扫描，其中出现了大多数有机结晶化合物的代表性峰。
[0070]
动态蒸汽吸附(dvs)
[0071]
通过将约10mg样品转移到dvs仪器中并随后使用以下参数记录相对于25℃下的大气湿度的重量变化来进行吸湿性测量:
[0072][0073]
通过hplc测定的纯度
[0074]
通过hplc确定样品的纯度，hplc操作参数如下：
[0075][0076]
实施例
[0077]
实施例1：在丙酮中小规模结晶产生晶型d，但其不能在更大规模下重现
[0078]
在丙酮中进行了几个小规模的结晶实验，其中化合物(i)和富马酸以2g的规模在50-60℃下溶解在丙酮中。在实验1和2中，将化合物(i)与酸溶液混合，然后蒸发以浓缩溶剂并在2-5小时内冷却至0℃。从未添加晶种的结晶和添加晶种的结晶成功地产生了晶型d。两个实验都产生了晶型d，其在添加晶种的结晶和未添加晶种的结晶的情况下，在溶液中稳定至少17小时。在实验3中，从过程中省略了溶剂的浓缩，并且没有固体从溶液中沉淀出来。从实验中得出结论，溶剂的浓度对于产生晶型d是必要的(表1)。
[0079]
接下来，将丙酮中的结晶过程放大到3.5g，并将总浓缩时间延长至约10小时。在该实验中，晶型d在浓缩3小时后转化为晶型s4。
[0080]
尝试在成盐之前浓缩富马酸溶液。将富马酸溶解在丙酮中后，将酸溶液浓缩至8倍体积，得到富马酸的悬浮液。然后将化合物(i)溶解在丙酮(32倍体积)中，并在55℃下与1％的晶种一起向酸悬浮液中加入，并在55℃下保持1小时。将溶液冷却至5℃并保持16-17小时，成功产生晶型d(表2)。然而，发现晶型d悬浮液在转化为晶型s4之前可以在50℃下保持少于2.5小时。
[0081]
由于在50-55℃下的丙酮中快速转化为晶型s4，因此决定测定减少在50-55℃下的保持时间的效果。因此，对于1克和5克规模的批次，在50-55℃下的保持时间减少到10分钟，然后在1.5小时内将温度冷却至0℃并在该温度下保持16-17小时。尽管以良好的质量获得晶型d，但产率分别降低至63％和65％(表3)。重复实验，其中在冷却至5℃之前，将温度降低至25℃保持24小时。该实验仍然产生质量良好的晶型d，然而，产率损失仍然在12％左右。还发现进一步冷却至5℃并不会有助于进一步降低损失(表4)。
[0082]
为了进一步提高结晶产率，在冷却阶段加入冷的反溶剂。选择甲基叔丁基醚(mtbe)作为反溶剂，并用1克和5克量的化合物(i)进行两个实验。将化合物(i)的丙酮溶液(34倍体积)与富马酸的丙酮(8倍体积)悬浮液在50℃下和1％晶种混合并保持0.5小时。随后加入mtbe并在1.5小时内冷却至0℃。用1克样品结晶得到晶型d，但5克批次得到d和s4的混合物，两个实验都没有给出令人满意的产率(分别为64％和60％)(表5)。
[0083]
然后重复结晶过程，将化合物(i)和富马酸混合的温度降低至25℃和35℃，得到晶型d和s4的混合物(表6)。
[0084]
表1.丙酮中初步结晶实验总结
[0085][0086]
表2.丙酮中蒸发结晶的放大
[0087]
[0088]
表3.减少添加晶种后的保持时间
[0089][0090]
表4.通过保持在25℃优化结晶产率
[0091][0092]
表5.在冷却过程中加入冷的mtbe
[0093][0094]
表6.在25℃和35℃下的丙酮中成盐
[0095][0096]
实施例2.结晶质量取决于起始材料
[0097]
从上述实施例1的结果看来，在50℃下的丙酮中成盐是最有希望以合理产率生成晶型d的方法。在建议的过程中，首先将化合物(i)丙酮溶液在50℃下加入到富马酸丙酮悬浮液中，从而产生过饱和的丙酮溶液。然后在该过饱和溶液中加入晶种。加入晶种后(冷却前)保持系统不超过2小时；然后将所述系统冷却至25℃，在25℃保持过夜。过滤后，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤并在50℃真空干燥。该过程可以以》60％的产率提供所需的晶型d。为了验证所述建议过程，在4克(纯度99.1％)和9克(纯度99.8％)的规模上进行了几次实验。4克批次的实验产生了理想的晶型d，但9克规模的实验产生了晶型s4。由于两个实验的规模相似，因此认为该结果可能取决于起始材料的质量(表7)。
[0098]
为了研究原料质量的影响，使用不同纯度的原料进行了若干实验(表8)。在实验4中，较低纯度的化合物(i)被用于实验。然而，在研究过程中没有发现明显的结晶。在实验5中，将一批高纯度的化合物(i)与几批纯度较低的原料混合并用作起始原料。加入晶种后未观察到结晶。在50℃下保持时间延长至3小时，但产生了晶型d和s4的混合物。在实验6中，典型纯的化合物(i)和来自化合物(i)制备的母液(来自化合物(i)合成步骤的母液)的混合物用作起始原料，生成了晶型d并且可以保持相对较长的时间。
[0099]
为了研究化合物(i)中残留溶剂的影响，进行了几次“掺入(spiking)”实验(表9)。“掺入”溶剂是合成步骤中使用的溶剂，此外，化合物(i)在一些批次中是无定形的。为了研究化合物(i)的多晶型是否会影响盐的多晶型，从无定形化合物(i)开始进行实验。在实验7中，将3％的meoh添加到系统中，并且在保持在50℃的过程中，晶型d转化为晶型s4。在实验8中，向系统中加入1％的乙酸甲酯，在50℃保持期间，晶型d转化为晶型s4。在实验9中，以无定形化合物(i)为起始原料，在50℃保持期间，晶型d转化为晶型s4。
[0100]
总之，开发了蒸发结晶程序以产生晶型d。然而，随后发现该程序的成功高度依赖于起始原料的纯度和形式。因此，具有略微不同的少量杂质或纯度水平的起始原料产生不同的多晶型物。还发现结晶的成功还取决于结晶条件和结晶规模的微小变化。然而，控制晶型d或稳定晶型s4形成的关键因素尚未确定。
[0101]
表7.建议过程在丙酮中的可重复性
[0102][0103]
ml:母液
[0104]
表8.起始原料的影响
[0105][0106]
表9.不同批次的起始原料
[0107][0108]
实施例3：用于纯晶型d的大规模制造工艺产生了d型和s4型的1:1混合物
[0109]
将1.05kg化合物(i)溶解在5-10kg丙酮中，在55-60℃下搅拌30min，制成化合物(i)溶液。在60℃下将0.32kg富马酸溶于35kg丙酮的溶液缓慢加入化合物(i)溶液中。将所得混合物浓缩，然后加入3.5g包含晶型d的晶种。将混合物在60℃下搅拌1-2h，然后将混合物浓缩并在2h内冷却至50℃。接下来，在50℃下将4kg mtbe缓慢加入混合物中，并将所得混
合物在相同温度下再搅拌1-2h。在20-25h内将混合物缓慢冷却至25℃，在冷却过程结束时检测到多晶型转变，产生了多晶型d和s4的1:1混合物。然后收集富马酸盐，用3-4kg mtbe洗涤两次，过滤并在65-70℃下干燥8-24h。得到1.02kg的多晶型d和s4的1:1混合物作为最终产物。
[0110]
实施例4. 1:1化合物(i)富马酸盐晶型s4的小规模制备
[0111]
在mek/水/etoh/mch溶剂系统中开发了一种新的小规模结晶程序，如下所示：在50℃下将0.282g富马酸溶解在5ml乙醇中以制备酸溶液，在50℃下将1.0g化合物(i)溶解在7ml 2-丁酮/水(95/5体积比)中以制备化合物(i)溶液。将20％的酸溶液加入到化合物(i)溶液中，在混合溶液中加入20mg晶种，然后滴加剩余的酸。在温度50℃下保持3h，然后在2.5h内冷却至25℃，并在25℃下再保持17h。接着，在2h内加入22体积当量的甲基环己烷，在30min内将温度冷却至5℃，并在5℃下再保持3h。将样品过滤并在50℃下真空干燥以获得最终产物，通过xrpd确认其为单一晶型s4。所述最终产物的xrpd图谱基本上与使用100g化合物(i)基于相同过程制备的最终产物在图1所示和表10所列的相同。由于其具有尖锐的峰和平坦的基线的独特的xrpd图，晶型s4被认为是具有至少90％结晶纯度的单一晶型。
[0112]
为提高产物收率，需要适当加入甲基环己烷作为反溶剂。具体地，当2-丁酮/水(95/5)与乙醇与甲基环己烷的体积比为6-7比4-5比11-22时，可以一致地获得产率高于90％的晶型s4(表11)。此外，可以微调富马酸和化合物(i)之间的摩尔比以提高产率，主要是通过降低产物溶解度。当富马酸与化合物(i)的摩尔比从1.1变为1.5时，晶型s4的产率损失从7％减少到3％(表12)。后来发现摩尔比1.3与1.5相比表现同样好，因此应用于结晶过程。
[0113]
从各种应激条件下的测试得出的结晶过程被认为非常稳健，包括：各自制备并在50℃下保持较长时间(最多24小时)的富马酸溶液或化合物(i)溶液，快速加入富马酸或甲基环己基反溶剂(不超过半小时)，快速冷却(表13)。即使在这些应激条件下，仍能始终以非常高的纯度得到晶型s4，产率虽然略有下降，但仍远好于从本公开内容(参见实施例1-2)和美国专利no.9,884,855(参见实施例6)中公开的过程得到晶型d的产率。
[0114]
表10.晶型s4的xrpd
[0115][0116]
表11.mek/水/乙醇(mch)中的初步结晶
[0117][0118]
表12.加入酸的量的影响
[0119][0120]
表13.应激测试
[0121][0122]
实施例5：晶型s4的大规模制造过程
[0123]
为了大规模制造晶型s4，将17.0kg化合物(i)溶解在90kg 2-丁酮/水(95/5体积比)中，在45-55℃搅拌1-4h以形成化合物(i)。将4.3kg富马酸溶解在74kg etoh中，在45-55℃搅拌1-4h以形式酸溶液。将一部分酸溶液在45-55℃下加入到化合物(i)溶液中，并在45-55℃下搅拌0.5-4h。将包含晶型s4的晶种加入到混合溶液中。将加入晶种的混合物在45-55℃下搅拌2-6h，然后加入剩余的酸溶液。将所得混合物在45-55℃下搅拌3-12h，然后在5-12h内冷却至20-30℃。然后，在6-8小时内缓慢加入284kg甲基环己烷，加入后，将混合物在
20-30℃下搅拌3-12h，然后在3-12h内冷却至0-10℃，并保持0-10℃搅拌另外6-8h。然后收集所需的盐，用16kg mch洗涤两次，过滤，并在500℃下干燥8-24h，得到17.96kg最终产物，经xrpd确认为单一晶型s4(参见图2)。由于其具有尖锐的峰和平坦的基线的独特的xrpd图，认为晶型s4是具有至少90％结晶纯度的单一晶型。
[0124]
实施例6.吸湿性和溶解性测试
[0125]
基于之前描述的dvs测量，晶型s4在0-80％rh之间表现出低吸湿性，在80％rh下仅增加0.41％的重量，略低于在80％rh下重量增加0.56％的晶型d。
[0126]
为了评价晶型s4相对于晶型d的溶解性能，进行了多项测试。ph 2下的固有溶解速率表明晶型s4(429.3μg/cm
2-min)和晶型d(440.4μg/cm
2-min)结果相似。此外，在环境温度下各种生物相关介质中测定平衡溶解度。晶型s4在禁食状态模拟胃液(fassgf)中表现出高平衡溶解度(2.52mg/ml)，并在禁食状态模拟肠液(fassif)中表现出低平衡溶解度(0.05mg/ml)，与对晶型d观察到的相似(分别为2.08和0.08mg/ml)。
[0127]
根据fda的指南，可以适当设计口服剂型中药物物质的体外溶出度测试，以建立体内-体外相关性(ivivc)，即剂型的体外特性与体内反应之间的相关性。根据该指南，使用两批含有晶型d和s4的富马酸盐制备片剂，以评价对药物产品性能的任何影响。两批富马酸盐和赋形剂在称重前分别过筛，将所需重量的每种组分转移到摇床混合器中并混合，然后使用单冲压片机对这两批进行压片。
[0128]
接着使用经过适当验证的溶出度测试方法评价这些片剂的性能。结果显示两批片剂具有非常相似的溶出曲线：所有批次在60min时的最终平均浓度达到94％(参见表14)。这些数据表明在体外溶出度测试方面，由晶型s4制成的药品表现出与晶型d等同的性能，因而根据fda指南的建议推断生物等效性。
[0129]
表14.各自口服剂型中的晶型s4和晶型d的体外溶出度测试
[0130][0131]
实施例7：药代动力学分析
[0132]
在化合物(i)的临床开发过程中，根据现行良好生产规范(cgmp)规定，使用两批富马酸盐制备片剂，每批富马酸盐均含有多晶型物晶型d或晶型s4，这些在以下部分被称为晶型d和晶型s4片剂。
[0133]
方法：
[0134]
给药、采血和血浆制备
[0135]
患者在加拿大卫生部和管理该药物的医院研究伦理委员会批准的临床试验中给药。八名患者以晶型s4片剂给药，六名患者的剂量水平为48mg，两名患者的剂量水平为160mg。64名患者以晶型d片剂给药，剂量范围为3-160mg。
[0136]
在给药前和给药后2、4和6h收集血液用于分析。简而言之，使用标准的静脉切开术，将大约6ml的血液收集到k3edta采血管中，然后倒置8-10次以混合。然后将样品在大约5℃下以1,000g离心10-15min，使用一次性移液管移出血液的血浆部分，转移到新管中，在-70℃下冷冻，随后在干冰上运输以进行分析。
[0137]
人类血浆分析
[0138]
使用根据所有适用的usfda、oecd和mhlw法规以及usfda行业指南：生物分析方法验证2001年5月中验证的方法测量血浆中化合物(i)的水平。简而言之，通过液/液萃取制备含有化合物(i)，以化合物(i)
13
c6作为内标和k3edta作为抗凝剂的人血浆样品。在萃取溶剂蒸发后，重构样品萃取物，并使用waters atlantis dc18通过反相hplc进行分析。在设置为电喷雾正电离的z型喷雾源/界面中使用加热的氮气雾化流动相，使用ms/ms检测离子化化合物，将实验样品与使用参考标准材料制成的标准曲线样品进行比较以确定化合物浓度，使用excel内置“pk函数”确定药代动力学参数。
[0139]
结果
[0140]
为了比较不同剂量水平的剂量，以ng*h/ml表示的暴露量(auc
0-6h
值)除以给药剂量(mg)，结果绘制在图3中。给药晶型d片剂后的平均剂量-归一化暴露为3.11
±
2.19ng*h/ml/mg，给药晶型s4后的平均剂量-归一化暴露为5.99
±
2.48ng*h/ml/mg。使用双尾t-检验计算的显著性p值为0.0009。
[0141]
结论
[0142]
给药含有晶型s4的片剂导致患者的暴露水平高于给药含有晶型d的片剂。在提供的数据中，给药晶型s4片剂后暴露与晶型d片剂相比的平均倍数增加为5.99/3.11＝1.9倍。