专利名称：生产紫杉烷型双萜的方法
技术领域：
本发明涉及生产包括紫杉醇的紫杉烷型双萜的方法，紫杉醇是用于治疗卵巢癌、乳癌、肺癌等的很好的药剂。
用于卵巢癌、乳癌、肺癌等的治疗药剂的紫杉醇是一种从短叶紫杉NUTT中分离出来后被鉴别出的紫杉烷(taxane)型双萜，紫杉是一种属于紫杉属紫杉科族的植物，紫杉醇有一个与上述药理活性有关的复杂的酯基。可以在短叶紫杉NUTT植物体的所有部分发现紫杉醇，但是据报导树皮中的紫杉醇的含量比所有其他部分都多。目前是从天然或载培的植物体中收集紫杉醇，但是属于紫杉属的该植物生长很慢，需要生长10多年才长到离地20cm高，此外，剥掉树皮后树就死，因此不容易得到大量的紫杉醇。如果可以通过使用组织培养的方法来合成紫杉烷型双萜例如紫杉醇和/或紫杉醇的前体的浆果赤霉素III的话，那会是很有利的，因为可以不用砍树很容地得到大量的紫杉醇。
作为一种利用培养植物细胞来生产紫杉醇的一般方法，美国专利公开了一种利用培养的短叶紫杉NUTT的细胞生产紫杉醇的方法(USP5,019,504)，但是，其中所介绍的紫杉醇的生产量仅是1-3mg/l，因此可足以用于工业生产。此外，通过利用一般地组织培养技术的细胞培养来生产紫杉醇是不稳定的，即使当通过选择可以高生产率的得到初生细胞时也很难保持再次培养时它的含量[E.R.M.Wickremesine等，World Congress on Cell and TissueCulture(1992)]。
另一方面，作为生产紫杉醇的现有技术，在颁布的Holton等人的USP5,015,744的说明书中公开了一种由浆果赤霉素III生产紫杉醇的半合成方法，在紫杉醇的生物合成中浆果赤霉素III是一种前体。通过利用植物组织培养，可以生产半合成方法的原料例如浆果赤霉素III，因此，也可以通过上述的半合成方法用植物组织培养来生产紫杉醇。
本发明的目的是提供一种简单的通过植物组织培养来生产紫杉烷型双萜的方法。
通过深入细致的研究，本发明人发现，通过在如下的条件下进行培养细胞的培养或生产紫杉烷型双萜的植物的培养组织的培养，可以改善培养中紫杉烷型双萜的生产率，因此完成了本发明，所说的条件是在晕斑素(Coronatines)、生产晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取物、环状多糖类、脂肪酸或茉莉酸的亚氨基或氨基衍生物的存在条件下。
因此，本发明是一种生产紫杉烷型双萜的方法，其中是在至少一种选自如下的物质的存在下把生产紫杉烷型双萜的植物的细胞和/或组织进行培养，所选的物质是晕斑素、生产该晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取物、环状多糖类、脂肪酸和由以下通式(X)所代表的化合物或由通式(XI)所代表的化合物 [式(X)中，Y是氢原子、羟基、氰基、NR28aR28b(其中R28a和R28b分别代表氢原子、氨基甲酰基、具有1-12个碳原子的酰基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、具有1个取代基的芳烷基或具有1-12个碳原子的烷基磺酰基)、OR29(其中R29是具有1-12个碳原子的酰基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基)、-CO-R30(其中R30代表氢原子、氨基、具有1-12个碳原子的烷基氨基)、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基、氨基磺酰基或具有1-12个碳原子的烷基亚硫酰基；R1a、R1b、R1c、R1d、R1e和R1f分别代表氢原子、羟基、具有1-12个碳原子的烷基、具有1-12个碳原子的烷氧基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；R20、R21、R22、R23和R24分别代表氢原子、羟基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6组成的侧链可以含有1个或多个双键；R25代表羟基、OM(其中M是碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NR26aR26b(其中R26a和R26b分别代表氢原子、具有1-12个碳原子的酰基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基或氨基酸残基)、OR27(其中R27代表具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基或糖类残基)、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；n是整数1-7；并且在上述的五员环中，在相邻的环中碳原子之间可以形成双键]， [式(XI)中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g分别代表氢原子、羟基、具有1-12个碳原子的烷基、具有1-12个碳原子的烷氧基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；R20、R21、R22、R23和R24分别代表氢原子、羟基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6构成的侧链可以含有1个或多个双键；R25代表羟基、OM(其中M代表碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NR26aR26b(其中R26a和R26b分别代表氢原子、具有1-12个碳原子的酰基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基或氨基酸残基)、OR27(其中R27代表具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基或糖类残基)、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；n是整数1-7；R31a和R31b分别代表氢原子、羟基、具有1-12个碳原子的酰基、具有1-12个碳原子的烷基、具有1-12个碳原子的烷氧基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基或氨基酸残基；并且，在上述的五员环中，在相邻的环中碳原子之间可以形成双键]，然后从形成的培养物中回收紫杉烷型双萜。
作为本发明方法的目的产物的紫杉烷型双萜不特别限于任一具有紫杉烷骨架的双萜中，说明性的例子包括紫杉醇、10-脱乙酰基紫杉醇、7-表紫杉醇、浆果赤霉素III、10-脱乙酰基浆果赤霉素III、7-表浆果赤霉素III、头胞满宁(Cephalomannine)、10-脱乙酰基头胞满宁(10-deacetylcephalomannine)、7-表头胞满宁(7-epicephalomannine)、浆果赤霉素VI、紫杉烷Ia、木糖基头胞满宁(xylosylcephalomannine)、木糖基紫杉醇(xylosyltaxol)、紫杉醇c、10-脱乙酰基紫杉酚C、紫杉素I(taxicinI)、紫杉素II、紫杉碱I、紫杉碱II、taxagifine等等。
用于本发明的生产紫杉烷型双萜的植物的例子是那些属于紫杉属的植物，例如浆果紫杉LINN、东北红豆杉SIEB.et ZUCC、东北红豆杉SIEB.et ZUCC Var.nana REHDER、短叶紫杉NUTT、加拿大红豆杉MARSH、红豆杉和Taxus media。在这些植物当中，浆果紫杉LINN和Taxus media是特别优选的。
所说的植物的组织培养是用一般地公知方法进行培养，只是该培养是在下述物质的存在下进行，这些物质是晕斑素、产生晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取物、环状多糖类、脂肪酸，或根据本发明的上述通式(X)或(XI)所表示的化合物。
已经发现，用于本发明的晕斑素像由假单胞菌产生的诱发萎黄病的物质，它们具有诱导植物坏死、促使植物产生乙烯或老化的活性。它们正像茉莉酸一样，也具有促进土豆的块茎繁茂生长的活性。
作为产生晕斑素的细菌己知的有假单胞菌和黄单胞菌。说明性的假单胞菌的例子包括丁香假单胞菌(IFO3310)、大豆叶斑病假单胞菌、烟草野火病假单胞菌(IFO3508，IFO14081)、菾菜疫病假单胞菌(IFO12655)、燕麦晕斑假单胞菌、栖菜豆假单胞菌(IFO12656，IFO14078)、桑枝疫病假单胞菌(IFO14053，IFO14054，IFO14055)、向日葵叶斑病假单胞菌(IFO14077)等等。说明性的黄单胞菌的例子包括田野黄假单胞菌(IFO中13303，IFO13551)、柑桔黄单胞菌、黄瓜黄单胞菌(IFO13552)、菜豆黄单胞菌(IFO13553，IFO13554)桃李黄单胞菌(IFO3780，IFO13557)等等。
晕斑素的例子包括由通式(I)或通式(II)所表示的化合物 [其中，R1代表羟基、OR2(其中R2代表具有1-6个碳原子的烷基或糖类残基)、OM1(其中M1代表碱金属原子、碱土金属原子或NH4)，或NR3aR3b(其中R3a和R3b分别代表氢原子、具有1-6个碳原子的酰基、具有1-6个碳原子的烷基、氨基酸残基或由通式(III)所代表的基因 (其中R4代表氢原子、羟基、具有1-6个碳原子的烷基、具有1-6个碳原子的烷氧基或由式-CO-R7代表的基团，(其中R7代表羟基、OM2(其中M2代表碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NR8aR8b(其中R8a和R8b分别代表氢原子、具有1-6个碳原子的酰基、具有1-6个碳原子的烷基或氨基酸残基)、或OR9(其中R9代表具有1-6个碳原子的烷基或糖类残基))；R5a、R5b、R6a和R6b分别代表氢原子、羟基、具有1-6个碳原子的烷基或具有1-6个碳原子的烷氧基)；R10a、R10b、R11a、R11b、R12、R13、R14a、R14b、R15a、R15b、R16a、R16b、R17和R19分别代表氢原子、羟基、具有1-6个碳原子的烷基或具有1-6个碳原子的烷氧基；R18代表氢原子、具有1-6个碳原子的烷基或糖类残基；
在式子中的五员环或六员环中的相邻环中碳原子之间可以形成双键]。
在上述的通式(I)、(II)和(III)中，由R2、R3a、R3b、R4、R5a、R5b、R6a、R6b、R8a、R8b、R9、R10a、R10b、R11a、R11b、R12、R13、R14a、R14b、R15a、R15b、R16a、R16b、R17、R18或R19所代表的具有1-6个碳原子的烷基的说明性的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、叔戊基、正己基和异己基。
在上述的通式(I)、(II)和(III)中，由R4、R5a、R5b、R6a、R6b、R10a、R10b、R11a、R11b、R12、R13、R14a、R14b、R15a、R15b、R16a、R16b、R17或R19所代表的具有1-6个碳原子的烷氧基的例子包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、叔戊氧基、正己氧基和异己氧基。
当R1或R7为OM1或OM2时，由M1或M2代表的碱金属原子或碱土金属原子的例子包括钠、钾和钙。
当R1或R7是NR3aR3b或NR8aR8b时，由R3a、R3b、R8a或R8b所代表的具有1-6个碳原子的酰基或者可以有直链或者可以有支链，它们的例子包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基和丙烯酰基。
当R1或R7是NR3aR3b或NR8aR8b时，由R3a、R3b、R8a或R8b所代表的氨基酸残基的例子包括异亮氨酰基、缬氨酰基、谷氨酰基和赖氨酰基。
当R1或R7是OR2或OR9时，由R2或R9代表的糖类残基的例子是吡喃葡糖基。
在上述通式(II)中，由R18所代表的糖类残基的例子包括吡喃葡糖残基。
优选的晕斑素的例子包括晕斑素(式IV)和晕斑酸(Coronafacicacid)(式V)。
晕斑素，它是一种由酰胺键把晕斑酸与2-乙基-1-氨基环丙烷-1-羧酸相连的化合物，在那些由通式(I)所表示的化合物中它有最高的活性。
用于本发明的晕斑素具有各种立体异构体(顺反异构体和旋光异构体)，每种异构体可以单独使用或以混合物的形式使用。
为了添加晕斑素、产生该晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取物到该培养基中，在该培养基中晕斑素的浓度通常要求为0.001-1000μM，根据本发明，特别优选的要控制该晕斑素的浓度范围为0.01-100μM。
根据本发明，通过使用含有一种或多种选自如下的物质的培养基培养上述植物的细胞和/或组织，与不添加所述物质的情况相比，可以得到具有较高紫杉烷型双萜生产率的培养细胞和/或培养组织，所述的物质是晕斑素、产生该晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取物。
已报导，通过添加晕斑素到植物细胞培养液中来活化包括在某些第二代谢作用中的生物合成体系[W.Weiler等，FEBS Letters3451(1994)]，但是，没有关于在作为介质添加剂的晕斑素的存在下进行产生紫杉烷型双萜的植物的组织培养的报导，而且出乎人们意料的是由此增加了产生的紫杉烷型双萜的量。
国际专利公开WO93/17121和USP5,019,504介绍了一种方法，该方法是把微生物或微生物培养提取物用作属于紫杉属的植物的培养细胞的引发剂来增加紫杉烷型双萜的生产率。在这些公开文件中虽然规定其作为引发剂，但是没有清楚的给出其效果的情况。此外，没有介绍有关属于假单胞菌属或黄单胞菌属的细菌，它是用于本发明的产生晕斑素的细菌。因此，出乎人们意料的是，通过在产生晕斑素的细菌或该细菌的培养液或培养提取物的存在条件下，培养属于紫杉属的植物的细胞，增加了产生的紫杉烷型双萜的量。
用一般芽胞杆菌繁殖的培养基或基本培养基来实现产生晕斑素的细菌的繁殖。
在发明中所用的产生的晕斑素的细菌的培养液的说明性的例子包括用于培养细菌之后通过无菌过滤处理的培养液。
用于本发明的产生晕斑素的细菌的培养提取物的说明性的例子包括在其中已进行细菌培养之后在120C高压热处理15分钟的培养液，或者在酸条件下用有机溶剂例如乙酸乙酯萃取的这些细菌的培养液的提取物，它可任意地进一步用Sephadex LH 20柱等精制得到部分精制的含有晕斑素或晕斑酸的馏分。
当该培养细胞是以指数生长相到稳定相时，加入晕斑素、产生晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取物是有效的，对本发明的方法来说，特别优选的是把它们在从指数增长相到稳定相的过渡时期加入。例如，当细胞是每隔21天移种时，第7-16天是合适的加入晕斑素、产生晕斑素的细菌、这样的细菌的培养液或培养提取物的时间。至于该添加，可以一次加预定量的该物质，或者可以分多份依次加入它们。
用于本发明的环状多糖类的说明性的例子包括环糊精、环果糖聚糖(Cyclofructan)和它们的衍生物。
由于环状多糖类的环状结构，所以其内部有孔洞，孔洞的开口处和外边显示亲水性，环的内部显示疏水性，因此空在孔洞中具有吸收油物质的笼合活性。通过利用这一特性，它有很多的用途，例如把几乎不溶于水的物质变成水溶的物质，稳定不稳定的物质，保留挥发性的物质例如香料及控制奇特的气味。工业上它已用于食品例如干冻茶或火腿和香肠控制奇特气味。
环糊精是一种在其中6-8个葡萄糖单元以环状物形式连接的物质，它是从淀粉通过环糊精合成酶的作用而合成的，环糊精合成酶是通过这样一种特殊微生物例如软化芽孢杆菌产生的。该环果糖聚糖是一种在其中6-8个果糖单元以环状物形式连接的物质，它是由菊粉通过环果糖聚糖合成酶的作用而合成的，该合成酶是由像环状芽孢杆菌这样的特殊微生物产生的。
作为本发明所用物质的环糊精和其衍生物的例子包括α-环糊精、β-环糊精。γ-环糊精或其支链糊精和其部分甲基化的糊精，所有这些都可以用。支链环糊精的例子包括糖基-α-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽三糖基-α-环糊精、糖基-β-环糊精、糖基-γ-环糊精、半乳糖基-α-环糊精等等，其中一个糖基作为支链连到环上。作为环果糖聚糖或其衍生物，其中通过β2-1果糖链连接6-8果糖单元的化合物、其支链环果糖聚糖和其部分甲基化的环果糖聚糖都可以使用。
根据本发明，在培养基中的上述环状多糖类的浓度优选为0.01-50mM，更优选控制环状多糖类的浓度为0.1-30mM。
根据本发明，通过使用其中加入环状多糖类的培养基进行上述植物的细胞和/或组织的组织培养。与其中不加该物质的情况相比，可以得到具有较高紫杉烷型双萜生产率的培养细胞或培养组织。
还没有在作为介质添加剂的环状多糖的存在下进行生产紫杉烷型双萜的植物的组织培养的报导，出乎人们意料的是由此促进了分泌紫杉烷型双萜进到介质中，并增加了生产的紫杉烷型双萜的量。
特别是当该环状多糖类与其他的改善生产率的物质(诱发剂)一起使用时会提高效果。这样的改善生产率的物质的例子不仅包括晕斑素、产生该晕斑素的细菌、这样的细菌的培养液或培养提取物、脂肪酸或由本发明通式(X)或通式(XI)所代表的化合物，也包括下述日本专利申请6-252528中所述的茉莉酸、其烷基酯、重金属、胺和抗乙烯剂。在日本专利申请6-146826中所述的低氧浓度的气氛下环状多糖类与该培养物结合在一起使用也是特别有效的。
用于本发明的脂肪酸的例子包括合成的或天然脂肪酸，其中在主链中的碳原子数是10-22，它们之中，在它的主链上具有偶数碳原子的脂肪酸是特别优选的。这些脂肪酸可以是饱和脂肪酸或在它的碳链上具有1个或多个双键不饱和脂肪酸。连到该碳链上的1个或多个氢原子可以被具有1-6个碳原子的烃基、羟基或氨基取代。在上述的不饱和脂肪酸中所含的双键可以或者是顺式或者是反式或者是它们的混合物。但是含有顺式双键的是优选的。
上述的脂肪酸的说明性的例子包括直链脂肪酸如癸酸、癸烯酸、月桂酸、十二碳烯酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、11-十八碳烯酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、四-十八碳烯酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、山菕酸、二十二碳六烯酸，羟基脂肪酸或蓖麻油酸，和支链脂肪酸如14-甲基棕榈酸。在这些酸当中，油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸是优选的，但特别优选的是α-亚麻酸。
在这些取代基中，具有1-6个碳原子的烃基如例子包括甲基、乙基、丙基、环丙基、丁基、异丁基、戊基或己基。
在这些取代基中，氨基的例子包括氨基、单甲基氨基和二甲基氨基。
加入到培养基中的脂肪酸可以是由下面的通式(XII)代表的脂肪酸衍生物R32-COR33(XII)[其中，R32-C0代表由上述脂肪酸衍生的一个原子团；R33代表OR34(其中R34代表具有1-6个碳原子的烷基或糖类残基)、OM(其中M代表碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、或NR35aR35b(其中R35a和R35b分别代表氢原子、具有1-6个碳原子的烷基或氨基酸残基)]。
在上述的通式(XII)中，由R34、R35a和R35b代表的具有1-6个碳原子的烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基和异己基。
当R33是OM时，由M代表的碱金属原子或碱土金属原子的例子包括钠、钾和钙。
当R33是NR35aR35b时，由R35a或R35b代表的氨基酸残基的例子包括甘氨酰基、亮氨酰基、谷氨酰基，赖氨酰基、苯丙氨酰基、异亮氨酰基、酪氨酰基和色氨酰基。
当R33是OR34时，由R34代表的糖类残基的例子是吡喃葡糖基。
从有效的改善紫杉烷型双萜的生产率的观点考虑，用于本发明的脂肪酸和/或其衍生物优选的是加到培养基中，使浓度为0.01-1000μM，特别优选的是控制浓度在0.1-500μM(当两种或多种脂肪酸和/或衍生物一起使用时，上面表示的浓度范围为总的浓度)。
根据本发明，也可以使用含有脂肪酸或其酶催化水解产物的天然油。天然油的例子包括植物油如菜子油、豆油、亚麻子油和红花油，酶催化水解产物的例子包括由脂酶分解的上述植物油的那些水解产物。在培养基中的上述天然油或其酶催化水解产物的浓度优选为1-1000mg/l。
除了从系统外添加脂肪酸外，也可以加脂解酶到培养基中，以便部分水解该脂类例如构成所述组织和/或细胞的甘油脂，以便释放脂肪酸到培养基中。脂解酶的例子包括脂酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶B，在酸区具有最佳pH的磷酯酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶B是特别优选的。根据本发明，加入到培养基中的上述酶的优选浓度为0.1-100mg/升培养基。
根据本发明，满足上述条件的脂肪酸，其衍生物、天然油和脂解酶可以单独使用，或它们可以随意结合使用及一起使用。
可以在培养开始时或在培养过程中把这些脂肪酸或其衍生物、天然油或脂解酶加到培养基中。可以在培养过程的任何时候一起加入，或可以分批加入它们。
把上述脂肪酸和天然油加到培养基中的说明性的方法包括如下的方法一种方法是把它们溶于有机溶剂如乙醇中再加入，一种方法是把它们与表面活性剂如辛基-β-D-葡糖苷一起加入，或者另一种方法是把它们直接加到培养基中，接着进行超声波等处理而形成胶束。也可以在油-水分离的条件下把它们直接加到培养基中进行培养。
用于本发明的茉莉酸的亚氨基或氨基衍生物是分别由通式(X)或(XI)表示的化合物。
在上述的通式(X)或(XI)中，由R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R1g、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R28a、R28b、R29、R26a、R26b、R27、R31a、R31b或y代表的具有1-12个碳原子的烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。具有3个或多个碳原子的烷基包括环烷基例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
在上述的通式(X)或(XI)中，由R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R1g、R31a或R31b所代表的具有1-12个碳原子的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基、壬氧基、癸氧基、十一烷氧基和十二烷氧基。具有3个或多个碳原子的烷氧基包括含有一个环烷基如环丙基、环丁基、环戊基和环己基的烷氧基。
在上述的通式(X)或(XI)中，由R28a、R28b、R26a、R26b、R29、R31a或R31b所代表的具有1-12个碳原子的酰基可以是直链或支链，或其可以是芳族原子团，其说明性的例子包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、丙烯酰基、辛酰基、壬酰基、苯甲酰基、甲苯酰基、水杨酰基和肉桂酰基。
在上述的通式(X)或(XI)中，由R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R1g、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R28a、R28b、R29、R26a、R26b、R27、R31a、R31b或Y代表的芳基或带有取代基的芳基的例子包括苯基、对甲氧基苯基、对氯苯基、对氟苯基和萘基。
在上述的通式(X)或(XI)中，由R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R1g、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R28a、R28b、R29、R26a、R26b、R27、R31a、R31b或Y所代表的芳烷基或带有一个取代基的芳烷基的例子包括苄基、对甲氧基苄基、对氯苄基和对氟苄基。
在上述的通式(X)或(XI)中，当R25是OM时，由M代表的碱金属原子或碱土金属原子的例子包括钠、钾和钙。
在上述的通式(X)中，R28a或R28b代表的具有1-12个碳原子的烷基磺酰基的例子包括甲磺酰基、乙磺酰基、正丙磺酰基和异丙磺酰基。
在上述的通式(X)中，当R29是-CO-R30时，由R30代表的具有1-12个碳原子的烷基氨基的例子包括甲氨基、乙氨基、正丙氨基和异丙氨基。
在上述的通式(X)中，由R28a或R28b代表的具有1-12个碳原子的烷基亚磺酰基的例子包括甲基亚磺酰基，乙基亚磺酰基、正丙基亚磺酰基和异丙基亚磺酰基。
在上述的通式(X)或(XI)中，当R25是NR26aR26b时，由R26a或R26b表示的氨基酸残基的例子及在通式(XI)中由R31a或R31b所代表的氨基酸残基的例子包括异亮氨酰基、酪氨酰基和色氨酰基。
在上述的通式(X)或(XI)中，当R25是OR27时，由R27代表的糖类残基的例子是吡喃葡糖基。
在由通式(X)或(XI)所表示的化合物中，在五员环中邻近的环中碳原子之间可以形成双键。
由通式(X)代表的化合物的说明性的例子包括如下所示的那些化合物(化合物A)Y-OHR1a，R1b，R1c，R1d，Re，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之间形成一个双键。R25-OCH3n1 (化合物B)Y-OCH3R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之间形成一个双键。R7-OCH3n1 (化合物C)Y-NH2R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之间形成一个双键。R7-OCH3n1 (化合物D)Y-NHCONH2R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之间形成一个双键。R7-OCH3n1 (化合物E)Y-NHCHOR1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之间形成一个双键。R7-OCH3n＝1 (化合物F)Y-NHSO2CH3R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之间形成一个双键。R7-OCH3n＝1 (化合物G)Y-CNR1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之间形成一个双键。R7-OCH3n＝1 (化合物H)Y-SO2NH2R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之间形成一个双键。R7-OCH3n＝1 由通式(X1)所代表的化合物的说明性的例子如下所示(化合物I)R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R1g，R20，R21，R22，R23，R24，R31aHR31bOHC3和C4之间形成一个双键。R25-OCH3n1 用于本发明的由通式(X)或(XI)所代表的化合物有各种立体异构体，每种异构体可以单独使用，或以它们的混合物的形式使用这些异构体。在化合物A-H的侧链当中，异戊烯基和甲氧羰基-甲基它们的顺式构型是优选的。
用如下的方法可以很容易地制备由通式(X)或(XI)所代表的化合物，该方法是例如茉莉酸与氨衍生物的加成反应(例如，见″NewExperimental Chemistry Course No.14，Synthesis andReaction of Organic Compourds[III]″edited by TheChemical Society of Japan)。
氨衍生物的说明性的例子包括羟胺、苯肼、氨基脲、O-甲基羟胺、O-乙基羟胺、甲酰肼、甲烷磺酰肼等或它们的盐。当用盐时，如果需要，可以通过在羰基衍生物(茉莉酸)的存在下加乙酸钠或乙酸钾由该盐释放出碱性试剂。
在加成反应中，碱性氮化合物亲核地连到羰基的碳上，最好控制反应溶液有合适的酸性。
以这样的方法得到的茉莉酸的亚氨基衍生物进一步与复合氢化合物例如氢化锂铝、氰基硼氢化钠和硼氢化钠或还原剂如甲硼烷反应，得到茉莉酸的氨基衍生物。
在培养基中，由通式(X)或(XI)代表的化合物的浓度优选0.001-1000μM，更优选控制该浓度在0.1-500μM的范围。
DE4122208公开了一种方法，它是通过把茉莉酸加到植物细胞培养液中来促进产生特定的第二代代谢物，但是它没有介绍生产紫杉烷型双萜。本发明人已发现，通过加入茉莉酸可以增加在生成的培养液中产生的紫杉烷型双萜的量[日本专利申请6-104211，6-104212，7-47580]，然而出乎人们意料的是，根据本发明，与茉莉酸的结果相比，茉莉酸的亚氨基或氨基衍生物具有更高的生产改善效果。
当培养的细胞是处在指数生长相或静态相时，加入由通式(X)或(XI)代表的化合物是最有效的，对于本发明的方法来说特别优选的是把该化合物在从指数生长相到静态相的过渡期加入。例如，当细胞是每21天移种时，加该化合物的合适的时间是第7-14天。该添加可以一次加或分多次加入。
当用由通式(X)或(XI)代表的化合物进行两步培养时，也可以在第一培养步骤在没有加该化合物的介质中，而在第二培养步骤加该化合物的介质中繁殖该细胞。要接种到第二培养步骤的这些细胞优选是处在指数生长相或静态相。
根据本发明，是在含有至少一种选自下述物质的培养基中培养细胞或组织，这些物质是上述的晕斑素、产生该晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取物、环状多糖类、脂肪酸和由通式(X)或(XI)代表的化合物，然后从生成的包括培养的组织、培养的细胞和培养基的培养物中回收该紫杉烷型双萜。
用于本发明的培养基的例子包括那些已知的通常用于植物组织培养的培养基，例如Murashige & Skoog的培养基(1962)、Linsmaier Skoog的培养基(1965)、Woody Plant Medium培养基(1981)、Gamborg′s B-5培养基和Mitsui′s M-9培养基。
植物激素，如果需要的话，碳源、无机组分、维生素、氨基酸等也可以加到这些培养基中。
作为植物激素，可以使用例如茁长素如吲哚基乙酸(IAA)、萘基乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和细胞分裂素类如激动素、玉米素和二氢玉米素。
作为碳源，可以使用二糖例如蔗糖、麦芽糖和乳糖，单糖如葡萄糖、果糖和半乳糖、淀粉或这样的糖源中的两种或几种按适当比例混合的混合物。
无机组分的说明性的例子包括磷、氮、钾、钙、镁、硫、铁、锰、锌、硼、铜、钼、氯、钠、碘和钴，这些组分可以以像硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙、氯化钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸钠、硫酸铁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、硫酸铜、钼酸钠、三氧化钼、碘化钾、氯化钴等这样的化合物的形式加入。
维生素的说明性的例子包括生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆素(维生素B6)、泛酸、肌醇和烟酸。
作为氨基酸，例如可以使用甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、半胱氨酸等。
一般使用的植物激素的浓度为约0.01-约10μM，碳源浓度为约1-约30g/l，无机组分浓度为约0.1μM-约100mM，维生素和氨基酸浓度分别为约0.1-约100mg/l。
根据本发明，可以使用液体培养基和含有琼脂和gelan胶的含量通常为0.1-1％的固体培养基，但是，通常优选液体培养基。
一片所述植物的根、生长点，叶、茎、种子、花粉、花药和花萼等的组织或细胞，或其用上述培养基或其他常规培养基组织培养得到的培养细胞可以用于本发明的组织培养。
本发明也可以用于由根瘤土壤杆菌或生根土壤杆菌感染该植物组织得到的赘生物细胞和/或多毛根。
根据本发明，在至少一种选自如下的物质的存在下进行这些组织或细胞的组织培养，所选用的物质为晕斑素、产生该晕斑素的细菌、这样细菌的培养液或培养提取物、环状多糖类、脂肪酸和由通式(X)或(XI)代表的化合物，与不加该化合物或没有进行处理的情况相比，可以得到具有较高紫杉烷型双萜生产率的培养组织或培养细胞。
通过用有机溶剂如甲醇和二氯甲烷萃取，可以从按照上述方法得到的培养物如培养的组织、培养的细胞和培养基中分离出紫杉烷型双萜。通过使合适的吸附剂或有机溶剂一起存在于培养基中，也可以连续回收该紫杉烷型双萜。
根据本发明的一个优选的组织培养的例子可以按如下加以说明。
把一片属于紫杉属植物的植物体例如根、生长点、叶、茎、种子等杀菌并放在用凝胶固化的Woody Plant Medium培养基上，在10-35℃保持约14-60天，以便部分组织片段变成愈伤组织。再次培养这样得到的愈伤组织，生长的速度逐渐加快，并可以得到稳定的愈伤组织。对于该稳定的愈伤组织，我们指的是在培养期间保持在愈合状态而没有显示分化成幼芽或根并且其细胞有均匀的生长速度的愈伤组织。
把这样的稳定的愈伤组织接种到适于增生的液体培养基，例如液体Woody Plant Medium培养基中并增生。在液体培养基中生长速度进一步增加。按照本发明，该稳定的愈伤组织或构成上述愈伤组织的细胞在含有至少一种选自如下物质的固体培养基或液体培养基中生长，所述的物质为晕斑素，产生该晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取物，环状多糖类、脂肪酸和由通式(X)或(XI)代表的化合物。
根据本发明，该组织培养的培养温度通常为约10-约35℃，优选约23-约28℃，因为生长速度快。至于培养周期，优选的是14-42天。
根据本发明，当用液体培养基培养时，在培养完成之后用如倾析或过滤这样的方法可以从培养基中分离出培养的细胞，使用例如用有机溶剂萃取的方法可以从培养的细胞和/或培养基中分离出所需要的紫杉烷型的双萜。
本发明的方法可以与在茉莉酸存在下进行的培养方法一起使用，以便提高本发明的效果，在日本专利申请7-47580、6-104211、6-104212和6-104213中公开了茉莉酸作为促进生产紫杉烷型化合物的物质。
茉莉酸的说明性的例子包括茉莉酸、它的盐、它的烷基酯、南瓜酸(Cucurbic acid)、它的盐、它的烷基酯，晚香玉酸(tuberonic acid)、它的盐和其烷基酯。
在这些化合物中，特别优选的化合物，从它们的改善生产率的高有效性的观点考虑例举如下茉莉酸、茉莉酸甲酯、晚香玉酸、晚香玉酸甲酯、和南瓜酸或南瓜酸甲酯。
可以用于本发明的茉莉酸包括所有的立体异构体和它们的混合物。
在培养基中茉莉酸的浓度为0.01-1000μM，特别优选的是控制茉莉酸的浓度为0.1-500μM。
当培养的细胞是在指数生长相或静态相时，加入茉莉酸是有效的，特别优选的是把茉莉酸在从指数生长相到静态相的过渡期加入。为了增加要生产的内生的茉莉酸的量，可以对处理的时间安排作同样的假定。例如，当每21天接种细胞时，第7-16天是合适的加茉莉酸或处理的时间，以便增加要生产的内生的茉莉酸的量。为了增加要生产的内生的茉莉酸的量，可以一次或分多次加该茉莉酸或处理。
另外，本发明可以与日本专利申请6-146826中公开的方法一起使用，在该申请中是从培养的最初阶段开始就通过控制培养容器中气相中氧的浓度小于大气中氧的浓度来进行培养，或者从培养的初始阶段开始就控制与该组织或细胞接触的流体培养基中溶解的氧的浓度使其小于在该温度下饱和溶解的氧浓度来进行培养。
在此，所说的培养的初始阶段，我们指的是从开始培养的时间到开始培养后第7天的时间，控制培养容器中气相中氧浓度或控制与该组织或细胞接触的流体培养基中溶解氧浓度优选从培养开始就进行。控制的时间不受特别的限制，可以在整个培养周期按所述条件进行控制，或仅在整个的培养周期的部分时间进行控制，但是，优选的是在整个的培养周期内至少进行控制3天。
在培养容器中气相中的氧浓度需要控制到4-15％，特别优选的是控制到6-12％。在流体培养基中溶解的氧浓度要求控制到在该温度下饱和溶解氧浓度的1-75％，特别优选的是将其控制到10-75％。
本发明也可以与日本专利公开7-135967和日本专利申请6-104213中公开的方法一起使用，其中这些细胞根据它们的比重的差别分成多个层，并培养至少一个层中所含有的细胞。
本发明也可以与日本专利申请6-201150中公开的方法一起使用，其中是在至少一种选自如下的物质的存在下进行培养，所述的物质为含重金属的化合物、含重金属的配位离子和重金属离子。
至于重金属，使用由银代表的铜族金属或由钴代表的铁族金属是优选的。优选以含有所述重金属的化合物的形式、含有所述重金属的配位离子的形式，或以所述金属离子的形式使用。特别优选的是硫代硫酸银离子。重金属的浓度优选是10-8M-10-2M。
本发明也可以与日本专利申请6-201151中公开的方法一起使用，其中是在胺的存在下进行培养。
优选的是使用至少一种类型的选自如下的胺，这些胺为多胺如腐胺，亚精胺、精胺、乙二胺、N，N-二乙基-1，3-丙烷二胺、二亚乙基三胺和它们的盐。胺的浓度优选是10-8M-10-1M。
本发明的方法也可以与上述已有的专利中公开的两种或多种方法结合在一起。
根据本发明，通过使用含有至少一种选自如下的物质的组织培养基，把产生紫杉烷型双萜的植物进行组织培养，可以很容易地得到大量的紫杉烷型双萜，所选用的物质为晕斑素、产生该晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取物、环状多糖类、脂肪酸或茉莉酸的亚氨基或氨基衍生物。
用下面的实施例，比较例、参考例和合成例对本发明作进一步说明，但是，不应把这些例子看作是对本发明的范围的限制。把一段已经预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液或其他溶液消毒过的浆果紫杉LINN的茎放在已经加入萘基乙酸的其浓度为10-5M的固体Woody Plant Medium培养基(含有gelan胶0.25％(重量))上，在暗处25℃进行静态培养，得到浆果紫杉LINN的愈伤组织。把1克(鲜重)该愈伤组织接种到含有20ml已加入上述组分得到相同浓度的液体Woody Plant Medium培养基的Erlenmeyer烧瓶中，并用旋转摇动器(放大25mm，120rpm)进行摇动培养，每21天再次培养该愈伤组织，以便加速其生长速度。
作为产生晕斑素的细菌，在含有3ml细菌培养基802(多胨1.0％，酵母提取物0.2％，MgSO4·7H2O0.1％，pH7.0)的试管中，在180rpm、 30℃下培养丁香假单胞菌(IFO3310)24小时，以使细菌增殖。然后，把100μl所述的含有该增殖细菌的培养液接种到含有50ml葡萄糖基本培养基(葡萄糖8.8g/l，KH2PO42.6g/l，Na2HPO4·2H2O6.9g/l，NH4Cl2.5g/l，Na2SO41g/l，FeSO40.01g/l，MnSO40.01g/l，MgCl20.05g/l，pH6.8)的Erlenmeyer烧瓶中，并在30℃再培养24小时。把这样得到的产生晕斑素的细菌的培养液浓缩到约1/20，然后用2N H2SO4调节pH到pH3，并用乙酸乙酯萃取。减压干燥得到的羧酸馏分，然后溶于2ml乙醇中，其无菌过滤得到的滤液用作产生晕斑素的细菌的培养提取液。
把这样得到的1g(鲜重)浆果紫杉LINN的培养细胞接种到含有20ml液体Woody Plant Medium培养基的Erlenmeyer烧瓶中，在25℃摇动培养14天。在开始培养后的第14天，把50μl产生晕斑素的细菌的培养提取液加到培养基中，再进一步培养7天。
培养完成之后，通过过滤和冷冻干燥收获浆果紫杉LINN的培养细胞，然后测其干重，得到每升液体培养基的培养细胞的产率。用甲醇或类似物从干的愈伤组织萃取紫杉烷型双萜，通过用高性能液相色谱与标准的紫杉醇，头胞满宁和浆果赤霉素III比较来确定它们，以测定紫杉烷型双萜的产率。结果列于表1中。重复实施例1，只是不加产生晕斑素的细菌的培养提取液。结果列于表1。重复实施例1，只是加入1ml在基本培养基中培养丁香假单胞菌生成的培养液通过无菌过滤得到的滤液来代替细菌的培养提取液并进行培养。结果列如表1。重复实施例1，只是加入1ml在基本培养基中培养丁香假单胞菌生成的培养液通过高压灭菌得到的液体来代替细菌的培养提取液并进行培养。结果列于表1。重复实施例1，只是用田野黄胞菌(IFO13551)作为产生晕斑素的细菌。结果列于表1。重复实施例1，只是在开始培养后第的14天直接把丁香假单胞菌作为产生晕斑素的细菌接种到紫杉培养基中，并再另外培养7天。培养完成后，按类似于所述实施例的方法进行。结果列于表1。重复实施例1，只是在开始培养后的第14天直接把田野黄单胞菌接种到紫杉培养基中作为产生晕斑素的细菌，并且另外培养7天。培养完成后，按类似于所述实施例的方法进行。结果列于表1。
表1
该产率是根据总产量(在细胞中的＋在培养基中的)计算的]把一段已经预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶或其他溶液消毒过的浆果紫杉LINN的茎放在已经加入萘基乙酸的其浓度为10-5M的固体Woody Plant Medium培养基(含gelan胶0.25％(重量))上，在暗处25℃下进行静态培养，得到浆果紫杉LINN的愈伤组织。把1克(鲜重)该愈伤组织接种到含有20ml已经加入上述组分得到相同浓度的液体Woody Plant Medium培养基的Erlenmeyer烧瓶中，并用旋转摇动器(放大25mm，120rpm)进行摇动培养，每21天再次培养该愈伤组织，以便加速其生长速度。
把这样得到的1克(鲜重)培养细胞接种到含有20ml已经加入上述组分得到同样浓度的液体Woody Plant Medium培养基的Erlenmeyer烧瓶中，在25℃摇动培养14天。开始培养后的第14天，把50μl晕斑素[式(IV)]作为晕斑素加入到培养基中，使最终浓度为0.001-1000μM，并另外再培养7天。
培养完成后，通过过滤和冷冻干燥收获浆果紫杉LINN的培养细胞，然后测其干重，得到每升液体培养基的培养细胞的产率。用甲醇或类似物从干的愈伤组织萃取紫杉烧型双萜，通过使用高性能液相色谱与标准的紫杉醇、头胞满宁和浆果赤霉素III进行比较来确定它们，以测定紫杉烷型双萜的产率，结果列于表2。重复实施例7，只是不加晕斑素。结果列于表2。
重复实施例7，只是将1μM N-晕斑酰基缬氨酸(N-Coronafacoylvaline)[式(IX)]作为晕斑素加入。结果列于表2。 [实施例9]重复实施例7，只是1μM晕斑素的甲酯作为晕斑素加入，结果列于表2。重复实施例7，只是10μM晕斑酸[式(V)]作为晕斑素加入，结果列于表2。重复实施例7，只是将10μM晕斑酸的甲酯作为晕斑素加入。结果列于表2重复实施例7，只是用类似于所述实施例的方法得到的紫杉培养基的培养细胞，并将晕斑素作为晕斑素加入，得到最终浓度1μM。结果列于表2。重复实施例12，只是不加晕斑素。结果列于表2。
表2 。把一段已经预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液或类似溶液消毒过的浆果紫杉LINN的茎放在已经加入萘基乙酸的其浓度为10-5M的固体Woody Plant Medium培养基(含有gelan胶0.25％(重量))上，在暗处25℃下静态培养，得到浆果紫杉LINN的愈伤组织。把0.1克(鲜重)该愈伤组织接种到内径18mm含有1ml已经加入上述组分得到相同浓度的液体Woody Plant Medium培养基的管中，并用旋转摇动器(放大25mm，120rpm)进行摇动培养，每28天再次培养该愈伤组织，以便加速其生长速度。
把这样得到的1克(鲜重)培养细胞接种到装有20ml已加入上述组份得到相同浓度的液体Woody Plant Medium培养基的Erlenmeyer烧瓶中，在25℃摇动培养14天。在开始培养后的第14天加入β-环糊精使其最终浓度为0.01mM，并另外再培养7天。
培养完成后，通过过滤和冷冻干燥收获浆果紫杉LINN的培养细胞，然后测其干重，得到每升液体培养基的其产率。用甲醇或类似物从干的愈份组织萃取紫杉烷型双萜，通过使用高性能液相色谱与标准紫杉醇、头胞满宁和浆果赤霉素III进行比较来确定它们，以测定紫杉烷型双萜的产率。结果列于表3。重复实施例13，只是不加β-环糊精。结果列于表3。重复实施例13，只是加β-环糊精使最终浓度为0.1mM。结果列于表3。重复实施例13，只是加β-环糊精使最终浓度为1mM。结果列于表3。重复实施例13，只是加β-环糊精使最终浓度为10mM。结果列于表3。重复实施例13，只是加6-0-α-D-葡萄糖基-β-环糊精代替β-环糊精；使最终浓度为50mM。结果列于表3。重复实施例13-17，只是再加入茉莉酸的甲酯，使最终浓度为100μM。结果列于表4。重复比较例4，只是再加入茉莉酸的甲酯，使最终浓度为100μM。结果列于表4。重复实施例21，只是加入α-环糊精代替β-环糊精，使最终浓度为10mM。结果列于表5。重复实施例21，只是加入γ-环糊精代替β-环糊精，使最终浓度10mM。结果列于表5。重复实施例21，只是加入环果糖聚糖(一种连接7个果糖单元的化合物)代替β-环糊精，使最终浓度为10mM。结果列于表5。
表3 [**)用6-0-α-D-葡糖基-β-环糊精。]
表4 [**)用6-0-α-D-葡糖基-β-环糊精。]
表5<<
>[*)该产率是根据总产量(在细胞中的＋在培养基中的)计算的。][实施例26]该一段已经预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液或类似溶液消毒过的浆果紫杉LINN的茎放在已经加入萘基乙酸的其浓度为10-5M的固体Woody Plant Medium培养基(含有gelan胶0.25％(重量))上，在暗处25℃下静态培养，得到浆果紫杉LINN的愈伤组织。把1克(鲜重)该愈伤组织接种到装有20ml液体Woody Plant Medinm培养基的Erlenmeyer烧瓶中，并用旋转摇动器(放大25mm，100rpm)进行摇动培养，每21天再次培养该愈伤组织，以便加快其生长速度。
把2克(鲜重)这样通过液体培养得到的该培养细胞接种到在100ml Erlenmeyer烧瓶中的20ml液体Woody Plant Medium培养基中，向该培养基加入α-亚麻酸0.01-1000μM(溶于乙醇的)，在暗处25℃下用旋转摇动器(放大25mm，100rpm)进行摇动培养。
培养14天完成后，通过过滤和冷冻干燥培养的细胞，然后测量干重，得到其产率。用甲醇或类似物从干愈份组织和培养基中萃取紫杉烷型双萜，用高性能液相色谱与标准的紫杉醇比较来确定它们，以测定紫杉醇的产率。结果列于表6。重复实施例26，只是加油酸100μM来代替α-亚麻酸。结果列于表7。重复实施例26，只是加亚油酸100μM来代替α-亚麻酸。结果列于表7。重复实施例26，只是加入花生四烯酸100μM代替α-亚麻酸。结果列于表7。重复实施例26，只是加入菜子油100mg/l代替α-亚麻酸。结果列于表7。重复实施例26，只是所用的植物种类是Taxus media(用于愈伤组织引发的部分是种子)。结果列于表8。重复实施例26，只是不加α-亚麻酸。结果列于表6。重复实施例31，只是不加α-亚麻酸。结果列于表8。
表6
表7
<p>表8 把1克(4.5mmol)茉莉酸甲酯溶于50ml甲醇中并用冰冷却，然后加0.74g(4.5mmol)硫酸羟胺和0.88g(9.0mmol)醋酸钾进行反应。将反应混合物静置一夜，蒸发除去甲醇，加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯重复萃取生成的产物。收集乙酸乙酯萃取物，用无水硫酸钠除去水，然后减压下干燥除去乙酸乙酯，得到化合物A。
用类似合成化合物A的方法合成化合物B-I，只是用下面的试剂代替硫酸羟胺。
化合物 试剂BO-甲基羟胺盐酸化物C水合肼D氨基脲盐酸化物E甲酰肼F甲基磺酰肼G氨基氰H硫酰胺[合成实施例2]把1g合成实施例1合成的化合物A溶于50ml甲醇中。然后向其中滴加0.084g(2.2mmol)硼氢化钠在5ml甲醇中的溶液，滴加完后，进一步搅拌反应混合物30分钟。浓缩该溶液直到其变成约10ml。向该溶液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯重复萃取产物。收集乙酸乙酯萃取物，用无水硫酸钠除去水，然后减压干燥除去乙酸乙酯，得到化合物I。把已经预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液或类似溶液消毒过的一部分Taxus media的胚芽放在已向其中加入萘基乙酸的其浓度为10-5M的固体Woody Plant Medium培养基(含有gelan胶0.25％(重量))上，并在暗处25℃下静态培养，得到Taxus media的愈伤组织。把1g(鲜重)该愈伤组织接种到装有20ml已向其中加入上述组分得到相同浓度的液体Woody Plant Medium培养基的Erlemeyer烧瓶中，用旋转摇动器(放大25mm，100rpm)进行摇动培养，每14天再次培养该愈伤组织，以便加速其生长速度。
把2g(鲜重)这样得到的培养细胞接种到含有20ml液体WoodyPlant Medium培养基的Erlenmeyer烧瓶中，把化合物A作为茉莉酸的衍生物加入；使最终浓度0.01-1000μM，并进一步再培养14天。
培养完成后，通过过滤和冷冻干燥收获Taxus media的培养细胞，然后测其干重得到每升液体培养基的培养细胞的产率。用甲醇或类似物从干的愈伤组织和培养基中萃取紫杉烷型双萜，用高性能液相色谱与标准紫杉醇、头胞满宁和浆果赤霉素III比较来确定它们测定紫杉烷型双萜的产率。结果列于表9。重复实施例32，只是不加茉莉酸的衍生物。结果列于表9。重复实施例32，只是加入茉莉酸甲酯100μM作为茉莉酸的衍生物。结果列于表9。重复实施例32，只是加入化合物B100μM作为茉莉酸的衍生物。结果列于表9。重复实施例32，只是加入化合物C100μM作为茉莉酸的衍生物。结果列于表9。重复实施例32，只是加入化合物D100μM作为茉莉酸的衍生物。结果列于表9。重复实施例32，只是加入化合物E100μM作为茉莉酸的衍生物。结果列于表9。重复实施例32，只是加入化合物F100μM作为茉莉酸的衍生物。结果列于表9。重复实施例32，只是加入化合物G100μM作为茉莉酸和衍生物。结果列于表9。重复实施例32，只是加入化合物H100μM作为茉莉酸的衍生物。结果列于表9。重复实施例32，只是加入化合物I100μM作为茉莉酸的衍生物。结果列于表9。
表9
权利要求
1.一种生产紫杉烷型双萜的方法，其中在至少一种选自如下的物质的存在下培养产生紫杉烷型双萜的植物的细胞和/或组织，所述的物质是晕斑素、产生该晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取液、环多糖类、脂肪酸和由通式(X)代表的化合物或通式(XI)代表的化合物 [式(X)中，Y是氢原子、羟基、氰基、NR28aR28b(其中R28a和R28b分别代表氢原子、氨基甲酰基、具有1-12个碳原子的酰基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、具有1个取代基的芳烷基或具有1-12个碳原子的烷基磺酰基)、OR29(其中R29是具有1-12个碳原子的酰基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基)、-CO-R30(其中R30代表氢原子、氨基、具有1-12个碳原子的烷基氨基)、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基、氨基磺酰基或具有1-12个碳原子的烷基亚硫酰基；R1a、R1b、R1c、R1d、R1e和R1f分别代表氢原子、羟基、具有1-12个碳原子的烷基、具有1-12个碳原子的烷氧基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；R20、R21、R22、R23和R24分别代表氢原子、羟基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6组成的侧链可以含有1个或多个双键；R25代表羟基、OM(其中M是碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NR26aR26b(其中R26a和R26b分别代表氢原子、具有1-12个碳原子的酰基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基或氨基酸残基)、OR27(其中R27代表具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基或糖类残基)、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；n是整数1-7；并且在上述的五员环中，在相邻的环中碳原子之间可以形成双键]， [式(XI)中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g分别代表氢原子、羟基、具有1-12个碳原子的烷基、具有1-12个碳原子的烷氧基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；R20、R21、R22、R23和R24分别代表氢原子、羟基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6构成的侧链可以含有1个或多个双键；R25代表羟基、OM(其中M代表碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NR26aR26b(其中R26a和R26b分别代表氢原子、具有1-12个碳原子的酰基、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基或氨基酸残基)、OR27(其中R27代表具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基或糖类残基)、具有1-12个碳原子的烷基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基或带有1个取代基的芳烷基；n是整数1-7；R31a和R31b分别代表氢原子、羟基、具有1-12个碳原子的酰基、具有1-12个碳原子的烷基、具有1-12个碳原子的烷氧基、芳基、带有1个取代基的芳基、芳烷基、带有1个取代基的芳烷基或氨基酸残基；并且，在上述的五员环中，在相邻的环中碳原子之间可以形成双键]，然后从形成的培养物中回收紫杉烷型双萜。
2.根据权利要求1的方法，其中是在至少一种选自晕斑素、产生该晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取液的物质的存在下进行培养。
3.根据权利要求2的方法，其中，晕斑素是由通式(I)或通式(II)代表的物质 [其中，R1代表羟基、OR2(其中R2代表具有1-6个碳原子的烷基或糖类残基)、OM1(其中M1代表碱金属原子、碱土金属原子或NH4)，或NR3aR3b(其中R3a和R3b分别代表氢原子、具有1-6个碳原子的酰基、具有1-6个碳原子的烷基、氨基酸残基或由通式(III)所代表的基团 (其中R4代表氢原子、羟基、具有1-6个碳原子的烷基、具有1-6个碳原子的烷氧基或由式-CO-R7代表的基团，(其中R7代表羟基、OM2(其中M2代表碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NR8aR8b(其中R8a和R8b分别代表氢原子、具有1-6个碳原子的酰基、具有1-6个碳原子的烷基或氨基酸残基)、或OR9(其中R9代表具有1-6个碳原子的烷基或糖类残基))；R5a、R5b、R6a和R6b分别代表氢原子、羟基、具有1-6个碳原子的烷基或具有1-6个碳原子的烷氧基)；R10a、R10b、R11a、R11b、R12、R13、R14a、R14b、R15a、R15b、R16a、R16b、R17和R19分别代表氢原子、羟基、具有1-6个碳原子的烷基或具有1-6个碳原子的烷氧基；R18代表氢原子、具有1-6个碳原子的烷基或糖类残基；在式子中的五员环或六员环中的相邻环中碳原子之间可以形成双键]。
4.根据权利要求2的方法，其中晕斑素是由式(IV)代表的晕斑素
5.根据权利要求2的方法，其中晕斑素是由式(V)代表的晕斑酸
6.根据权利要求2的方法，其中产生晕斑素的细菌是属于假单胞菌属的微生物。
7.根据权利要求2的方法，其中产生晕斑素的细菌是丁香假单胞菌。
8.根据权利要求2的方法，其中产生晕斑素的细菌是属于黄单胞菌属的微生物。
9.根据权利要求2的方法，其中产生晕斑素的细菌是田野黄单胞菌。
10.根据权利要求2的方法，其中产生晕斑素的细菌的培养液是通过无菌过滤该细菌的培养液得到的滤液。
11.根据权利要求2的方法，其中产生晕斑素的细菌的培养提取液是在酸性条件下用有机溶剂萃取该细菌的培养液得到提取液。
12.根据权利要求2的方法，其中产生晕斑素的细菌的培养提取液是通过热处理该细菌的培养液得到的。
13.根据权利要求2的方法，其中在培养基中晕斑素的浓度是0.001-1000μM。
14.根据权利要求1的方法，其中是在环多糖类存在下进行培养。
15.根据权利要求14的方法，其中环多糖类是α-环糊精。
16.根据权利要求14的方法，其中环多糖类是β-环糊精。
17.根据权利要求14的方法，其中环多糖类是γ-环糊精。
18.根据权利要求14的方法，其中环多糖类是环果糖聚糖。
19.根据权利要求14的方法，其中在培养基中环多糖类的浓度是0.01-50mM。
20.根据权利要求14的方法，其中也是在至少一种选自茉莉酸、其盐、其烷基酯、南瓜酸、其盐、其烷基酯、晚香玉酸，其盐及其烷基酯的化合物的存在下进行培养的。
21.根据权利要求1的方法，其中是在脂肪酸的存在下进行培养的。
22.根据权利要求21的方法，其中脂肪酸是在主链上有10-22个碳原子的直链饱和的或不饱和的脂肪酸。
23.根据权利要求21的方法，其中脂肪酸在主链上有10-22个碳原子并具有1个或多个一种或多种类型的取代基，该取代基选自具有1-6个碳原子的烃基、羟基和氨基。
24.根据权利要求21的方法，其中脂肪酸是在主链上有10-22个碳原子并在主链上有1个或多个顺式双键的不饱和脂肪酸。
25.根据权利要求21的方法，其中脂肪酸是一种或多种选自油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸的化合物。
26.根据权利要求21的方法，其中脂肪酸是一种或多种选自癸酸、癸烯酸、月桂酸、十二碳烯酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、11-十八碳烯酸、四-十八碳烯酸、花生酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳六烯酸的化合物。
27.根据权利要求21的方法，其中脂肪酸是由通式(XII)代表的脂肪酸衍生物R32-COR33(XII)[其中，R32-CO代表由权利要求22-26的任一项的脂肪酸所衍生的原子团；R33代表OR34(其中R34代表具有1-6个碳原子的烷基或糖类残基)、OM(其中M是代表碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、或NR35aR35b(其中R35a和R35b分别代表氢原子、具有1-6个碳原子的烷基或氨基酸残基]。
28.根据权利要求21的方法，其中加入到培养基中的脂肪酸的浓度是0.01-1000μM。
29.根据权利要求21的方法，其中加入到培养基中的脂肪酸的浓度是0.1-500μM。
30.根据权利要求21的方法，其中用作脂肪酸的天然植物油的用量相对于培养基的体积为1-1000mg/l。
31.根据权利要求1的方法，其中是在通式(X)或(XI)所代表的化合物的存在下进行培养。
32.根据权利要求31的方法，其中在培养基中由通式(X)或(XI)所代表的化合物的浓度是0.001-1000μM。
33.根据权利要求1的方法，其中紫杉烷型双萜是至少一种选自如下的物质紫杉醇、10-脱乙酰基紫杉醇、7-表紫杉醇、浆果赤霉素III、10-脱乙酰基浆果赤霉素III、7-表浆果赤霉素III、头胞满宁、10-脱乙酰基头胞满宁、7-表头胞满宁、浆果赤霉素VI、紫杉烷Ia、木糖基头胞满宁、木糖基紫杉醇、紫杉醇C、10-脱乙酰基紫杉醇C、紫杉素I、紫杉素II、紫杉碱I、紫杉碱II和taxagifine。
34.根据权利要求1的方法，其中产生紫杉烷型双萜的植物是属于紫杉属的植物。
35.根据权利要求1的方法，其中产生紫杉烷型双萜的植物是浆果紫杉。
36.根据权利要求1的方法，其中产生紫杉烷型双萜的植物是Taxus media。
全文摘要
本发明涉及一种生产紫杉烷型双萜的方法，其中在至少一种选自如下物质的存在下培养产生紫杉烷型双萜的植物的细胞和/或组织，所述的物质是晕斑素、产生晕斑素的细菌、该细菌的培养液或培养提取液、环多糖类、脂肪酸、茉莉酸的亚氨基或氨基衍生物，然后从生成的培养物中回收紫杉型双萜。
文档编号C07C233/63GK1132792SQ9512189
公开日1996年10月9日 申请日期1995年11月25日 优先权日1994年11月25日
发明者行宗敬人, 原康弘, 丹弘明, 富野郁夫 申请人:三井石油化学工业株式会社