1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种拮抗尖孢镰刀菌的高效抗逆贝莱斯芽孢杆菌。


背景技术：

2.随着栽培条件的变化以及农药防治的不科学使用，我国烟草病虫草害种类日益增多，危害也日趋加重，每年造成直接或间接经济损失巨大，病害的发生危害明显重于虫害，严重影响烟叶的产量和质量。其中烟草镰刀菌根腐病近年来发病范围和危害程度不断上升，不容小觑。
3.镰刀菌（fusarium spp.）是在全世界范围内广泛分布的土传植物病原真菌，可侵染多种植物。其中以尖孢镰刀菌（f. oxysporum）为主要病原菌的大豆根腐病在世界各地均有相关报道。主要发病症状表现在植株茎基部交接处、环绕茎基部有明显的深褐色病斑，被侵染植株苗期易从病斑处折倒而萎蔫致死，5 叶期以后至开花结果期发病则表现为茎基部缢缩、呈深褐色，植株仍然直立而萎蔫致死。
4.目前对于烟草根茎类病害的生物防治，主要是运用生防因子如拮抗微生物、抗生素和植物诱导子等，其中对于生防细菌的研究最多的是芽孢杆菌（bacillusspp.），它极易分离培养，且能够产生耐热、耐旱、抗紫外线等的内生孢子和多种抗菌素与酶类，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力（obagwu等，2003；elizabeth等，1999）。同时对人畜无毒无害，不污染环境，不会使病原菌产生抗药性，并且批量生产工艺简单，成本低，储存期长，是一种理想的生防细菌（黄海婵等，2005）。目前，对于烟草镰刀菌根腐病菌生物防治的研究鲜见报道。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供一种拮抗尖孢镰刀菌的高效抗逆贝莱斯芽孢杆菌。
6.本发明采用的技术方案为：一种拮抗尖孢镰刀菌的高效抗逆贝莱斯芽孢杆菌，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）；保藏名称为贝莱斯芽孢杆菌ba-0321；保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏地址是中国，武汉大学；保藏日期：2020年08月21日；保藏编号：cctcc no：m 2020440。
7.本研究为了获得对烟草根腐病拮抗效果好且抗逆的生防细菌菌株，为该病害的生物防治和生防菌剂的开发提供基础。大量采集河南不同生态区的土壤样本进行微生物分离，以烟草根腐病主要病原菌尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）为指示菌，利用平板对峙培养法，筛选出具有较强抑制作用且抑菌谱广的细菌菌株，通过形态学特征和16s rdna序列同源比对法对其进行种类鉴定，初步分析其抑菌机理和抗逆特性。筛选出对烟草尖孢镰刀菌具有65%以上拮抗效果的细菌菌株19株，其中菌株ba-0321的抑菌率最高，且对其他8种
植物病原真菌均具有良好的抑菌效果。依据菌株形态学特征及16s rdna基因序列比对分析，将菌株ba-0321鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）。该菌株主要通过抑制孢子萌发和菌丝生长对尖孢镰刀菌发挥作用，并具有较强的抗紫外、耐高温和低营养特性，高效抗逆的贝莱斯芽孢杆菌ba-0321可作为防治烟草根腐病的生物防治材料，具有较好的生防应用价值和开发前景。
8.保藏说明：芽孢杆菌科（bacillaceae）芽孢杆菌属（bacillus）贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）；编号：ba-0321；中文名称：贝莱斯芽孢杆菌；拉丁文名：bacillus velezensis；保藏编号：cctcc no：m 2020440；保藏机构：中国典型培养物保藏中心；保藏机构简称：cctcc；地址：中国，武汉大学；保藏日期：2020年08月21日。
9.本发明的有益效果是：本发明公开一种对烟草尖孢镰刀菌具有明显拮抗效果的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）ba-0321，保藏号cctcc no：m 2020440，并对其抑菌机理和抗逆特性进行了初步分析；该菌株生长繁殖快，适应能力强，具有较强的抗紫外、耐高温和低营养的生物学特性，对烟草主要根茎类病害抑菌谱广，同时可主要通过抑制孢子萌发和菌丝生长对烟草尖孢镰刀菌产生较强的抑菌效果，为后续研究和田间生物防治的应用奠定基础。
附图说明
10.图1为菌株ba-0321对尖孢镰刀菌的平板抑制效果。
11.图2 为菌株ba-0321的形态及显微观察；其中，a:菌落； b:菌体；c:芽孢。
12.图3 为基于16sr dna 基因序列构建的系统发育树。
13.图4为尖孢镰刀菌孢子萌发及菌丝生长的显微观察。
14.图5 为不同紫外照射时长下菌株ba-0321的生长及抑菌情况。
15.图6 为不同营养条件下菌株ba-0321的生长情况。
具体实施方式
16.1 材料与方法1.1供试材料供试病原真菌菌株尖孢镰刀菌、立枯丝核菌由本实验室（烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室）分离保存；烟草根黑腐病菌、茄病镰刀菌、溃疡病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、菊花壳二孢、拟茎点霉菌由河南科技大学康业斌教授惠赠，本实验室保存。土样采集于河南省主要烟区团棵期至旺长期的烟田及周边植物的根际土壤。
17.拮抗细菌的分离、培养用lb培养基，尖孢镰刀菌的培养用pda培养基。拮抗细菌总dna提取、16s rdna片段扩增所用试剂均购自天根生化科技有限公司。
18.lb培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏5g、nacl 5g、琼脂15g，定容至1000ml的蒸馏水中，ph 7.4，121℃高温灭菌20min。用于分离、纯化、培养及保存。
19.lb液体培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏5g、nacl 5g，定容至1000ml的蒸馏水中，ph 7.4，121℃高温灭菌20min。用于拮抗细菌的发酵培养和细菌总dna的提取。
20.pda培养基：马铃薯葡萄糖琼脂39g定容至1000ml蒸馏水中，自然ph，121℃高温灭菌20min。（或常规培养基配方：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸25分
钟，至马铃薯小块能被玻璃棒轻松戳破，8层纱布过滤，再加20g葡萄糖和15-20g琼脂，搅拌均匀至完全溶解，定容后分装至三角瓶中封口，于121℃灭菌20分钟，冷却后贮存备用）。用于病原菌的培养和平板抑菌试验。
21.1.2土壤细菌的分离与筛选将采回的根际土壤样品平铺置于室内阴凉处风干，并挑除残根、石块等杂物，过筛后用四分法收集土壤样品。采用梯度稀释涂布平板法，称取10g土样置于90 ml无菌水中，在28℃摇床上振荡30 min。然后分别制备10-3
、10-4
、10-5
的稀释液，各取0.1ml涂布在固体lb平板上，28℃培养48 h。挑取培养特征明显不同的单菌落，于lb平板进行划线纯化，将纯化好的菌株保存于4 ℃冰箱备用。
22.采用平板对峙培养法筛选对尖孢镰刀菌具有抑制作用的细菌菌株。将镰刀菌在pda培养基上25℃培养7d，用灭菌的打孔器打取5mm大小的菌饼，接入新的pda平板培养基中央，用灭菌牙签将待测拮抗细菌点接于距离中心2.5cm的对称四点处，于25 ℃培养6-8 d，观察并记录抑菌圈的有无以及抑菌圈的半径。每个处理重复3次，筛选出有抑菌圈的菌株，并计算其抑菌率。抑菌率＝（对照平板菌落直径－处理平板菌落直径）／对照平板菌落直径
×
100％。复筛方法同初筛，再次筛选抑菌圈大且效果稳定的菌株。
23.经过初筛和复筛，共得到19株对尖孢镰刀菌具有65%以上拮抗效果的细菌菌株，其中菌株编号为ba-0321的抑菌效果最强，抑菌率达75%（图1）。同时菌株ba-0321对其他8种植物病原真菌（表1）均具有良好的抑菌效果，抑菌率在50%以上（表1）。
24.1.3 拮抗细菌ba-0321的种类鉴定1.3.1 形态学鉴定使用接种环将菌株ba-0321划线培养于lb固体培养基，置于28℃恒温培养箱中，12h 后进行革兰氏染色，40h后进行芽孢染色，72h后观察记录菌落的形态、颜色、质地等形态特征。再根据东秀珠的《常见细菌系统鉴定手册》对该菌株的生理生化特性等指标进行测试。
25.如图2所示，菌株ba-0321在lb培养基上，菌落呈乳白色，不透明，初为圆形，边缘整齐，继而边缘开始褶皱不整齐，向四周呈云雾状扩散。菌体呈杆状，有芽孢，卵圆形。
26.生理生化鉴定结果如表2所示，菌株ba-0321兼性厌氧，革兰氏染色、过氧化氢酶、v-p测定、淀粉水解、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原和明胶液化试验结果呈阳性，氧化酶、m.r反应、脲酶和吲哚试验结果呈阴性，可以利用d-葡萄糖和蔗糖，不能利用乳糖和麦芽糖。结合细胞形态特征和生理生化特性试验结果，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，初步鉴定该菌为芽孢杆菌属（bacillus）。
27.注：“＋”表示反应结果为阳性，“－”表示反应结果为阴性，
“±”
表示反应结果为兼性厌氧。
28.1.3.2分子鉴定用细菌基因组dna提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取拮抗菌株的基因组dna，并以细菌16s rdna基因的通用引物（f: 5'-agagtttgatcctggctcag-3'，r: 5'-taccttgttacgactt-3'）对菌株的16s rdna基因进行pcr扩增。引物由生工生物有限公司合成。pcr反应体系（25μl）为：2
×
pcr taq mastermix 12.5μl，上、下游引物（10μmol/l）各1μl，dna模板1μl（约50 ng），双蒸水补足到25μl。pcr反应条件为：95℃ 5 min，95℃ 45s，52℃ 40s，72℃ 90s，30个循环，72℃延伸10min。用1%琼脂糖凝胶对pcr扩增产物进行电泳检测，扩增产物序列测定由生工生物工程股份有限公司完成。将所得序列在genbank数据库中进行blast，然后选择相似性较高的模式菌株序列，利用mega 6.0软件进行多序列同源性比对，用邻位相连法（nj法）构建系统发育树。
29.将菌株ba-0321的16s rdna 基因测序结果(1494 bp)进行序列分析及同源性比对。结果表明（图3），菌株ba-0321的16s rdna基因序列与其比对的芽孢杆菌属同源相似度在99%，进一步确定该菌株归属为芽孢杆菌属；同时其与贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis）的16s rdna基因序列同源性为99.80%，且位于同一进化分支。
30.1.4 贝莱斯芽孢杆菌ba-0321对尖孢镰刀菌孢子萌发及菌丝生长的影响测定将新鲜的尖孢镰刀菌菌丝块在pda平板上培养6~7 d后，用1%葡萄糖将pda平板上的孢子洗脱，然后用擦镜纸过滤后，将孢子稀释到每个血球计数板方格中含有1个孢子的浓度备用。将菌株ba-0321的发酵液滤液按照10%、5%、1%的比例混入1%的琼脂-水混合平板(先配琼脂融化后再按相应比例加入发酵液)，倒平板，置超净工作台吹干。往平板标记处滴加10μl106/ml孢子浓度的尖孢镰刀菌孢子悬浮液，用封口膜封好，置 25℃培养，20h、40h后分别观察孢子萌发和菌丝生长情况。设置不加发酵液的琼脂-水混合平板为空白对照，每处理
重复3次，整个试验重复2次。
31.菌株ba-0321的发酵液与尖孢镰刀菌孢子液混合培养20h后，镰刀菌孢子萌发受到抑制，萌发出的芽管短小（图4a,b）。共培养40h后，镰刀菌菌丝膨大，内容物溢出呈透明状（图4c,d）。由此表明，菌株ba-0321发酵液对镰刀菌孢子萌发和菌丝生长具有较强的抑制作用。
32.1.5 紫外辐射对贝莱斯芽孢杆菌ba-0321生长及抑菌效果的影响测定将菌株ba-0321用lb液体培养基在30℃，180 r/min，装液量20 ml/100 ml条件下震荡培养48h，用无菌水调节活菌数至108cfu/ml。取100μl均匀涂布在lb平板上（敞口），置于紫外灯管垂直下方20cm处，用4w强度的紫外分别照射0min、1min、3min、6min、9min、12min、15min，置于28 ℃恒温光照培养箱中，培养24h，统计单菌落数。每个处理重复3次。
33.将制备好的ba-0321菌株发酵液稀释液用移液枪吸取5μl接种于距离lb培养基中心2.5cm的对称4点上（敞口），置于紫外灯管垂直下方20cm处，用4 w强度的紫外分别照射0min、1min、3min、6min、9min、12min、15min，在培养皿的中央接种直径为5mm的病原菌菌饼，以只接种病原菌菌饼为对照，每组重复3次，置于28℃的恒温光照培养箱中，培养6-8d，测量菌落半径，并计算抑制率。
34.经紫外照射，菌株ba-0321的生长受到不同程度的影响。随着照射时间的延长，菌落数逐渐降低。如图5所示，其中，照射1min、3min、6min、9min的菌落数与对照菌落数差异不显著，照射12min后菌落数明显下降，与对照菌落数达到显著差异，但仍在同一个数量级上，同时，抑菌率基本没有变化。由此说明，菌株ba-0321具有较强的抗紫外照射能力。
35.1.6不同温度对贝莱斯芽孢杆菌ba-0321生长的影响测定将菌株ba-0321用lb液体培养基在30 ℃，180 r/min，装液量20ml/100 ml条件下震荡培养48h，用无菌水调节活菌数至10
8 cfu/ml。取1 ml孢子液装入5 ml灭菌离心管中，分别置于40℃、60℃、90℃条件下培养60 min，利用平板计数法统计每个处理的菌落数。以28℃恒温培养为对照组，每组处理重复3次。
36.测定不同高温处理过的菌株ba-0321的生长情况，结果表明，随着温度的升高，菌株ba-0321的活菌量会有一定程度的下降。在40℃和60℃的高温处理下的活菌数同对照组28℃的活菌数相差不大，且在5%的水平上不存在显著性差异；在90℃的高温下活菌数在5%水平上存在显著差异水平，但也仅仅是对照组活菌数的1/5，仍可达3.067
×
10
7 cfu/ml（表3）。由此说明，菌株ba-0321具有较强的耐受高温的能力。
37.注：表中数据为mean
±
sem，不同小写字母表示5%显著差异水平，不同大写字母表示1%显著差异水平。
38.1.7 不同营养条件对贝莱斯芽孢杆菌ba-0321生长的影响测定分别配置营养成分为原来的3/4、1/2、1/3、1/4、1/5的lb培养基，将制备好的ba-0321菌株发酵液稀释至合适的浓度，取100μl均匀涂布在不同营养的lb平板上，以正常营养的lb平板生长的处理为对照，每处理重复3次，置于28 ℃恒温培养箱中，培养24h，统计菌落数。
39.分别测定菌株ba-0321在不同营养条件下的生长状况，结果表明，随着培养基中营养成分的降低，菌株ba-0321的活菌量有所下降，但也只降低了一个数量级（图6）。由此说明，菌株ba-0321具有较强的低营养耐受能力。
40.1.8 数据处理采用mega软件的neighbor-joining法构建系统发育树，采用dps 7.05 软件进行差异显著性检验，采用duncan新复极差法进行多重比较。
41.贝莱斯芽孢杆菌来源于植物根际、土壤、植物内部、河流等各种生态环境，从植物根际分离的大部分贝莱斯芽孢杆菌可以在植物根部定殖，生长迅速，易分离培养，能分泌产生多种生物活性物质，包括酶、抗菌蛋白、脂肽类抗生素、聚酮类抗生素、植物激素等，对抑制病原菌起着重要作用。近几年，许多学者将分离得到的贝莱斯芽孢杆菌用于植物生长、抗病虫和诱导系统抗病性等方面的研究，发现贝莱斯芽孢杆菌菌株可在生物防治和植物增产促生上起着重要作用。目前，利用贝莱斯芽孢杆菌进行烟草镰刀菌的生物防治尚未有相关文献报道。
42.综上所述，本发明公开一种对烟草尖孢镰刀菌具有明显拮抗效果的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）ba-0321，保藏号cctcc no：m 2020440，并对其抑菌机理和抗逆特性进行了初步分析。该菌株生长繁殖快，适应能力强，具有较强的抗紫外、耐高温和低营养的生物学特性，对烟草主要根茎类病害抑菌谱广，同时可主要通过抑制孢子萌发和菌丝生长对烟草尖孢镰刀菌产生较强的抑菌效果，为后续研究和田间生物防治的应用奠定基础。
43.上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化
或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。