一株贝莱斯芽孢杆菌菌株ht-9及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，特别是一株贝莱斯芽孢杆菌菌株ht-9及其应用。


背景技术：

2.花生是我国四大油料作物之一，产量位居全球第一，是我国净出口创汇农作物品种之一。近年来我国花生种植面积不断扩大，受气候、品种及栽培管理方式等因素影响，花生白绢病的发生逐年加重，成为制约我国花生产量和品质的重要因素。花生白绢病是世界范围内花生上普遍发生的一种重要土传真菌病害，其病原菌是sclerotium rolfsii sacc.。花生各个生育期均可受白绢病菌侵染，主要为害植株茎部、果柄及荚果。受害茎基部组织腐烂、皮层脱落，剩下纤维状组织，植株叶片变黄、边缘焦枯，最后枯萎。我国花生白绢病研究起点晚、研究力量比较薄弱，病害系统研究不够深入，还缺少有效的防控措施。目前对花生白绢病的防治方法主要以培育抗性品种和使用化学药剂为主，但防治效果都不理想。同时化学药物的大量使用不仅使病原菌逐渐产生了抗药性，且化学农药残留对人类和生态造成严重的威胁。因此，寻找一种经济、安全、有效的生物防治措施迫在眉睫。
3.双黄连是中国药典收载的中成药，成分为金银花、黄芩、连翘3味中药，具有清热解毒、轻宣透邪之功效。双黄连药渣是指生产双黄连过程中产生的药渣部分，产量较大，新冠肺炎疫情后双黄连产量及产生的药渣更多。大部分从事中药生产的企业，在中药药渣的处理上很不环保，比如直接焚烧、露天堆放、填埋等，对我们的周边生活环境造成严重的污染。由于中药植物细胞壁的主要成分纤维素严重阻碍存在于植物细胞质中的有效药物成分的析出，很多医药企业对中药有效成分提取率较低。如双黄连药渣中还含有大量的有效成分，如蛋白质、黄芩苷、绿原酸、连翘苷等，有很高的再利用价值。目前关于利用双黄连药渣防治花生白绢病害的研究还未见报道。


技术实现要素：

4.针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株贝莱斯芽孢杆菌菌株ht-9及其应用，可有效解决花生白绢病害的用药问题。
5.本发明解决的技术方案是，本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌ht-9，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.22072，保藏日期为2021年3月25日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株的16s rdna基因序列如seq id no.1所示。
6.利用上述贝莱斯芽孢杆菌ht-9生产的生防菌剂在防治花生白绢病中的应用，所述的生防菌剂为固体制剂，吸附载体为双黄连药渣，活性成分为ht-9菌体。
7.上述生防菌剂的制备方法包括以下步骤：
8.1)将活化后的ht-9菌种接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃、200r/min条件下摇培3d，得ht-9发酵液，备用；
9.2)将双黄连药渣粉碎后过30目筛，得双黄连药渣粉，121℃高压蒸汽灭菌2h后，自
然晾干后备用；所述的双黄连药渣由生产双黄连时残留的金银花药渣、黄芩药渣、连翘药渣混合组成，比例为1:1:2；
10.3)将贝莱斯芽孢杆菌ht-9发酵液与双黄连药渣粉按照固液比为1:1的比例混合，搅拌均匀，常温干燥，即为生防菌剂。
11.所述的生防菌剂经检验，其中含有的ht-9有效活菌数达到1
×
108cfu/g。
12.所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株ht-9在防治花生白绢病上的应用。
13.本发明贝莱斯芽孢杆菌菌株ht-9能有效抑制白绢病菌生长，且本发明研究发现双黄连药渣对花生白绢病菌具有明显拮抗作用，将双黄连药渣水提液和pda培养基混合倒平板，白绢病菌在该平板上几乎完全不能生长，说明药渣中含有能抑制白绢病菌生长的活性物质，本发明将贝莱斯芽孢杆菌菌株ht-9与双黄连药渣结合并取得了显著效果，这为花生白绢病的防治提供了一种新思路。
附图说明
14.图1为本发明贝莱斯芽孢杆菌ht-9对花生白绢病菌的拮抗效果图。
15.图2为本发明双黄连药渣对花生白绢病菌生长的抑制作用图。
具体实施方式
16.以下结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
17.本发明贝莱斯芽孢杆菌ht-9是从河南省汝南县花生根际土壤中筛选得到的，该菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养48h，菌落表面干燥褶皱，边缘不规则，有微突起。显微镜下菌体为杆状，单细胞，革兰氏染色为阳性，有芽孢。菌株ht-9的生理生化特征为：接触酶反应阳性，淀粉水解阳性，卵磷脂酶反应阴性，吲哚试验阴性，甲基红试验阴性，v-p反应阳性，柠檬酸盐利用试验阳性。
18.提取菌株ht-9基因组，使用细菌16s rdna通用引物27f和1492r进行扩增，扩增产物送交华大基因(郑州)有限公司进行测序。将ht-9的16s rdna序列与genbank中的序列进行blast比对，与ht-9菌株相似性最高的是bacillus velezensis，同源性达到100％。将比对获得的同源序列和测定序列运用clustal x软件进行多重序列的同源性分析，然后利用mega6.05软件构建系统进化树。由构建的系统进化树可以看出，ht-9与bacillus velezensis同属一个遗传分枝。结合细菌的形态特征和生理生化试验最终确定菌株ht-9为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)。该菌株已于2021年3月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.22072。
19.本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌ht-9对花生白绢病菌的生长均具有较强的抑制作用，利用该菌与双黄连药渣结合制备的生防菌剂可以有效防治花生白绢病，相关试验资料如下：
20.一、菌株ht-9对花生白绢病菌的拮抗作用
21.将经牛肉膏蛋白胨培养基活化的ht-9菌株划线接种于pda平板两侧，再将直径5mm的花生白绢病菌培养物点接于平板中间。以只接病原菌的pda平板为对照，每处理3个重复。置于25℃培养箱内培养，待对照接近长满整个平板时观察ht-9对病原菌的拮抗效果。结果表明菌株ht-9能显著抑制花生白绢病菌的生长，抑菌带宽度达到14mm以上(图1)。
22.二、菌株ht-9无菌发酵滤液对白绢病菌生长的影响
23.将活化的ht-9接入含100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中于30℃、200r/min条件下摇培。将摇培3d后的细菌发酵液于10000r/min、4℃条件下离心20min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，所得的滤液即为无菌发酵滤液。将发酵滤液分别稀释2倍、4倍后，按照滤液:pda为1:4的比例混合，制成带毒平板，然后将直径5mm病原真菌菌饼点接于平板中央。以不接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基代替无菌发酵滤液为对照。每个处理设置3个重复，25℃恒温培养箱中培养。待对照长满整个平板时，十字交叉法测量菌落直径，并计算细菌ht-9发酵滤液原液、2倍和4倍稀释液对花生白绢病菌的抑菌率。抑菌率计算公式如下：
24.抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]
×
100
[0025]
结果表明(表1)，ht-9无菌发酵滤液对花生白绢病菌的生长具有明显的抑制作用，其无菌发酵液原液对病菌的抑制率达到95.67％，2倍和4倍稀释滤液对病菌仍有76.72％和37.46％的抑制率。
[0026]
表1菌株ht-9无菌发酵滤液对白绢病菌的抑制作用
[0027][0028]
三、双黄连药渣对花生白绢病菌的拮抗作用
[0029]
将10g双黄连药渣(由生产双黄连时残留的金银花药渣、黄芩药渣、连翘药渣混合组成，比例为1:1:2)和100ml蒸馏水加入粉碎机中进行粉碎，获得匀浆液，即为双黄连药渣水提液。将水提液灭菌后，按照水提液：pda为1:10的比例混合，制成带毒平板，然后将活化好的5mm病原真菌菌饼点接于平板中央。以无菌水代替药渣水提液作阴性对照。每个处理设置3个重复，25℃恒温培养箱中培养。待对照长满整个平板时，计算双黄连药渣水提液对花生白绢病菌的抑菌率。抑菌率计算方法同实验例2。实验结果表明双黄连药渣水提液对白绢病菌具有较强的抑制作用，抑菌率达到87.58％(图2)。说明双黄连药渣中含有抑制白绢病菌生长的活性物质。
[0030]
四、本发明生防菌剂的制备和使用方法
[0031]
将活化好的贝莱斯芽孢杆菌ht-9接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃、200r/min条件下摇培3d，使其大量产芽孢，作为生产菌液备用。将双黄连药渣粉碎后过30目筛，得到双黄连药渣粉，121℃高压蒸汽灭菌2h，自然晾干后备用。将ht-9菌液与药渣粉按照固液比1:1的比例均匀混合，自然晾干后即为生防菌剂。本发明制备的生防菌剂有效活菌数达到1
×
108cfu/g。
[0032]
上述生防菌剂的使用方法：在花生播种前将生防菌剂均匀撒施在土壤表面，然后使用旋耕机旋耕(深度为20cm左右)，使生防菌剂与土壤均匀混合。
[0033]
五、本发明制备的生防菌剂对花生白绢病的田间防效
[0034]
田间防效试验在驻马店市汝南县绿优家庭农场进行，为花生连作田，白绢病发生严重。采用随机区组设计，花生每小区30m2。设如下5个处理，处理1：1kg以双黄连药渣为吸附载体制备的ht-9生防菌剂1；处理2：1kg以泥炭土为吸附载体制备的ht-9生防菌剂2；处理
3：1kg双黄连药渣；处理4：1kg泥炭土；处理5：空白对照。每个处理设3个重复。具体养分配方、施肥用量、施肥次数等水肥管理结合当地习惯实施。在花生种植前将不同处理菌剂均匀撒施在农田土壤表面，所有试验小区均使用旋耕机旋耕，将菌剂与土壤均匀混合。花生收获前，采取病情指数法调查各小区花生白绢病的发病情况，花生白绢病病情分级标准见表2。同时调查每小区30m2花生产量。
[0035]
发病率(％)＝(发病株数/总株数)
×
100
[0036]
病情指数＝∑(各级病株数
×
各级代表值)
×
100/(调查总株数
×
最高级代表值)
[0037]
防治效果(％)＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]
×
100
[0038]
表2花生白绢病病情分级标准
[0039][0040][0041]
田间防效实验结果(表3)表明，未接种任何菌剂的空白对照组花生植株发病严重，发病率为24.81％，病情指数为16.74。施用以双黄连药渣为吸附载体制备的生防菌剂1对花生白绢病的防效达到66.07％，明显高于单独施用泥炭土和双黄连药渣，也明显高于以泥炭土为吸附载体制备的生防菌剂2。
[0042]
表3生防菌剂对花生白绢病的田间防治效果
[0043]
处理发病率/％病情指数防治效果/％生防菌剂17.825.6866.07生防菌剂212.369.4943.31双黄连药渣16.6712.6524.43泥炭土19.6215.666.45空白对照24.8116.74/
[0044]
产量实验结果见表4。施用生防菌剂1的花生产量较空白对照增产41.15％，较施用生防菌剂2增产11.31％，说明施用本发明以双黄连药渣为吸附载体制备的生防菌剂能显著提高花生产量。
[0045]
表4生防菌剂对花生产量的影响
[0046][0047]
与现有技术相比，本发明提供的生防菌剂对花生白绢病具有明显的防治效果，其次该菌剂对人、畜安全，污染性小，同时解决了双黄连药渣的再利用问题，本发明制备方法简单、成本低、使用简单，具有很好的应用前景。