1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于操纵在植物表皮毛细胞中特异性表达的启动子。


背景技术：

2.大多数植物的地上组织表皮上都具有表皮毛细胞结构。这些表皮毛细胞往往能够增强植物的抗逆能力(li, l.. et al. the plant cell, 2004, 16, 126-143.)。这与植物表皮毛细胞中合成和分泌的代谢产物有着重要关联。在一些多细胞表皮毛植物（如烟草、番茄和大麻)的叶子上的分泌型表皮毛上合成和累计的代谢物可占其叶干重的多达10-15％(wagner et al. ann.bot. 2004, 93:3-11）。在番茄多细胞表皮毛中合成的代谢生物包括能够抗虫的酰基糖、能够趋避昆虫的烯萜类物质等(mcdowell et al. plant physiology, 2011, 155, 524-539; schilmiller et al. pnas, 2012, 109, 16377-16382； schilmiller et al. plant physiology, 2010, 153, 1212-1223; bergau et al., bmc plant biology, 2015, 15)。而在烟草(nicotiana tabacum)中，多细胞表皮毛合成和分泌的代谢物是烟草叶片香气的主要来源（johnson a w. tobacco science, 1985, 29: 67
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72.）；在青蒿（artemisia annua）中的多细胞表皮毛则是合成和分泌的青蒿素重要组织(graham et al. science, 2010, 327, 328-331)；同样的，大麻（cannabis sativa l .）头状分泌型多细胞表皮毛也是是合成和分泌的大麻素重要组织（brenneisen r. chemistry and analysis of phytocannabinoids and other cannabis constituents. marijuana and the cannabinoids: springer; 2007. p. 17
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49.）。
3.植物多细胞表皮毛中合成和分泌的这些代谢产物往往具有一定毒性或者对植物自身的生长和发育会有不良的影响，因此，组成型启动子（如常用的烟草花叶病毒启动子35s等）不适合用于驱动这些化合物的表达。植物表皮毛是植物表皮毛上独立的细胞群体，存储和分泌代谢生物对植物其它组织的生长发育没有影响(sirikanta ramas et al. plant cell physiol, 2005, 46:1578-1582)。为此，发掘能够在植物多细胞表皮毛细胞中特异表达的启动子具有重要的应用价值。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，针对上述问题，提供五个用于操纵在植物表皮毛细胞中特异性表达的启动子。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：用于操纵在植物表皮毛细胞中特异性表达的启动子，所述启动子文库包括seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5所示核苷酸序列的启动子。
6.一种表达载体，所述表达载体包括权利要求1所述seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5所示核苷酸序列启动子中的任意一个或多个。
7.上述用于操纵在植物表皮毛细胞中特异性表达的启动子的应用，所述的启动子与
目的基因连接，促进目的基因在植物多细胞表皮毛细胞中的特异性表达。
8.进一步的，上述应用中所述启动子与gus报告基因连接，启动子驱动gus报告基因在植物多细胞表皮毛细胞中的特异性表达。
9.进一步的，上述表达载体在植物多细胞表皮毛细胞中表达植物代谢产物的运用。
10.进一步的，上述表达载体在植物多细胞表皮毛细胞中表达抗虫或者抗病相关化合物的运用。
11.进一步的，上述表达载体在植物多细胞表皮毛细胞中表达植物香气相关化合物的运用。
12.进一步的，上述表达载体在用于多细胞表皮毛植物品质改良中的运用。
13.进一步的，上述表达载体中所述表达载体包括遗传转化所形成的转基因植物，以及由此产生的外源基因表达产物；所述转基因植物包括番茄以及与番茄有着类似表皮毛细胞结构的植物。
14.本发明的有益之处在于：本发明提供了五种在植物多细胞表皮毛细胞中特异表达的启动子及其用途。启动子核苷酸序列如seq id no.1、no.2、no.3、no.4、no.5所示。运用这些启动子序列设计和构建能够在表皮毛中特异表达的表达载体。这些启动子序列应用于植物多细胞表皮毛细胞中表达植物代谢产物、或者表达抗病虫害相关化合物、或者表达表达植物香气相关化合物，以及改良多细胞表皮毛植物品质。这些启动子驱动的gus报告基因表达载体，并在多细胞表皮毛植物番茄中进行遗传转化，在表皮毛细胞中表达gus报告基因。本发明提供的5个启动子序列，都具有能够在植物多细胞表皮毛细胞中特异表达所需要的元件，对于在多细胞表皮毛细胞中表达植物代谢产物、抗病虫害相关化合物、植物香气相关化合物或者改良多细胞表皮毛植物品质中具有重要的价值。
15.附图说明：图1 mtnr1、mtnr2、mtnr3、lfs和tcp22基因的启动子表达载体转基因植株的gus结果。（a）mtnr1、mtnr2、mtnr3、lfs和tcp22基因的启动子序列驱动gus表达的载体示意图；（b）mtnr1、mtnr2、mtnr3、lfs和tcp22基因的启动子序列驱动gus表达的载体转基因植株gus染色结果；gus蛋白能与显色底物x-gluc 反应，显现蓝色；蓝色位置就是gus蛋白表达位置，标尺为250μm。
具体实施方式
16.介绍本发明还公开了5个能够特异在植物多细胞表皮毛细胞种特异表达的启动子序列。
17.本发明提供了seq id no.1、no.2、no.3、no.4、no.5所列的启动子核苷酸序列驱动的多细胞表皮毛特异表达载体构建方法，以及这些特异表达载体在植物多细胞表皮毛细胞中表达的应用。
18.说明仅以说明的方式而不是以限制性的方式提供以下实施案例。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相同或相似结果。这些实施案例决不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
19.本发明要求的遗传工程转化植物或植物细胞包括番茄和与番茄具有类似表皮毛结构的植物。本文提供实施案例中仅展示在番茄中的遗传转化结果，这只是为了展示我们的发明方法的可行性，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
20.植物的遗传转化：目前已公开的植物遗传转化方法由很多。本文提供实施案例中仅使用农杆菌介导的遗传转化方法，这只是为了展示我们的发明方法的可行性，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
21.本发明提供的这些启动子序列都具有能够在植物多细胞表皮毛细胞中特异表达的所需要的元件，其特点在于它能够特异地在植物多细胞表皮毛中表达。在这些启动子序列的应用中，只需将需要表达的目的基因插入到这些启动子后面构建成融合表达载体，再将这些载体转入番茄以及和番茄有着类似表皮毛结构的植物中，就可以达到表达目的基因的目的。在本发明的实施案例中，使用这些启动子序列驱动gus报告基因的表达，只是为了证明这些启动子序列具有在番茄以及和番茄有着类似表皮毛结构的植物的多细胞表皮毛细胞中特异表达的能力。而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
22.实施例1：多细胞表皮毛特异表达载体构建载体构建思路：使用pcr扩增技术，从番茄总dna中扩增seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5所列的mtnr1、mtnr2、mtnr3、lfs和tcp22基因的启动子序列，并将这些序列插入gus表达载体中，驱动gus基因表达。
23.实验步骤：（1）使用引物设计软件分别设计seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5所列的mtnr1、mtnr2、mtnr3、lfs和tcp22基因的启动子扩增引物。同时在引物的5’端加入酶切位点或者同源臂序列，为后续使用酶切连接或者infusion方法进行载体构建做准备。本案例中使用了infusion连接方法，这些启动子序列的扩增引物如下表：（2）使用高保真酶扩增启动子序列。以番茄总dna为模板，使用高保真酶对这些启动子序列进行pcr扩增，pcr反应体系如下：
反应程序如下：94℃预变性3min ；94℃ 20s，退火温度55℃~65℃（根据每个引物的tm值而定） 30s，72℃ 3min，35 个循环； 72℃延伸10min；16 ℃保温（3）电泳检测pcr产物，并将启动子dna片段切胶，再用dna回收试剂盒对dna片段进行回收。
24.（4）使用saci和xbai内切酶对gus质粒（pgc-gus）进行酶切，将载体中原本的启动子序列切除。酶切体系如下：37℃水浴3小时后，跑凝胶电泳，进行切胶回收质粒骨架片段，再用dna回收试剂盒对dna片段进行回收，备用。
25.（5）使用infusion方法将启动子dna片段连入gus载体中。反应体系如下：37℃孵育30 min后，用热激法将连接产物转入dh5α感受态细胞中，并用含有100mg/l壮观霉素的lb培养基进行筛选，经过pcr鉴定后，将阳性克隆在含有相应抗性的lb液体培养基中大摇16小时，提质粒送测序公司进行测序分析，构建启动子融合gus表达质
粒。启动子核苷酸序列与gus基因在表达载体中的位置示意图如附图1a所示。
26.实施例2：在番茄的多细胞表皮毛细胞中特异表达gus基因（1）遗传转化：参考前人已报道的浓杆菌介导的遗传转化方法（hyeon-jin sun, sayaka uchii, shin watanabe, hiroshi ezura. plant and cell physiology, march 2006, volume 47, issue 3, pages 426
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431.）进行遗传转化。操作步骤大概如下：首先，将启动子融合gus表达质粒分别通过热激法转入c58感受态细胞中，通过含有壮观霉素（100mg/l）和利福平（50mg/l）的固体lb筛选培养基进行筛选，在28℃培养箱中培养48小时后。将经过pcr鉴定的阳性克隆，分别使用含有壮观霉素（100mg/l）和利福平（50mg/l）的lb液体培养基进行扩繁。待菌浓度od值达到0.6时，分别将菌体离心后收集后用kc液体培养基(含1.5 mg/l zeatin 的ms培养基)重悬，继而分别进行农杆菌侵染番茄子叶（时间5分钟）。侵染结束后，分别将子叶转移到kc固体培养基中，黑暗室温条件下共培养48小时，再分别将子叶转移至筛选培养基（含1.5 mg/l zeatin和300mg/l的特美丁，植物筛选抗生素根据使用载体的植物抗性决定，如果使用载体的植物抗性基因为潮霉素基因，则加入10 mg/l的潮霉素，如果是卡那霉素抗性，则再加入100 mg/l的卡那霉素）进行筛选，温度26℃，光照16小时，黑暗8小时。生长2-3周后，转入含1 mg/l zeatin的筛选培养基（其它成分不变）继续筛选；待转基因植株幼芽长出来后，分别将幼芽用手术刀切下来，并分别转移到生根培养基中进行生根培养（1/2ms，300mg/l的特美丁以及植物抗性10 mg/l的潮霉素或者100 mg/l的卡那霉素）。最终分别筛选获得这5个启动子序列驱动的gus表达载体转基因植株。
27.（2）gus染色：使用gus染色反应液（50 mm pbs (na
＋
，ph7.2)，2 mm k3[fe(cn)6]， 2 mm k4[fe(cn)6]，0.2% triton x-100，2 mm x-gluc）对获得的转基因材料叶片进行gus染色分析。从附图1b可以看出，seq id id no.1、no.2、no.3、no.4、no.5所列的mtnr1、mtnr2、mtnr3、lfs和tcp22基因的启动子驱动的gus表达转基因植株的gus染色都只出现在植物表皮上的表皮毛细胞中。结果说明这5个启动子序列都能够在植物多细胞表皮毛上特异表达。
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以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。