一种抗小熊猫血红蛋白
α
亚基单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用
技术领域
1.本发明属于单克隆抗体制备技术领域，具体涉及一种抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用。


背景技术：

2.血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质，由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基，是红细胞中唯一一种非膜蛋白。
3.目前研究表明正常成人血红蛋白的主要成分是血红蛋白a(hba)，占全部血红蛋白的96.5-97.5％，另有血红蛋白a2(hba2)，占2.5-3.5％，胎儿血红蛋白(hbf)，占1％以下。血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成，肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子抱在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。珠蛋白约占96％，血红素占4％。
4.α和β都类似于肌红蛋白，只是肽链稍短：α亚基为141aa；β亚基为146aa。α和β亚基隔着一个空腔彼此相向。血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合，当血红蛋白不与氧结合的时候，有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当血红蛋白载氧的时候，就由氧分子顶替水的位置。其特性是：在氧含量高的地方，容易与氧结合；在氧含量低的地方，又容易与氧分离。血红蛋白的这一特性，使红细胞具有运输氧的功能，平均每克血红蛋白可结合1.34ml的氧气，是血浆溶氧量的70倍。因此血红蛋白的定位与定量对健康的研究极为重要。
5.目前关于小熊猫血红蛋白的研究还存在空白。但由于种属差异的原因，目前仍没有特异的抗小熊猫血红蛋白的抗体。因此，亟需针对小熊猫血红蛋白α亚基的氨基酸序列，开发特异的抗小熊猫血红蛋白α亚基的单克隆抗体，并应用于western blot检测，为血红蛋白的定位与定量，研究血红蛋白的生理功能及血红蛋白病奠定基础。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用，提供一种特异的抗小熊猫血红蛋白α亚基的单克隆抗体，以及产生该抗体的杂交瘤细胞株。
7.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
8.一种抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株hba(r)-1，其保藏编号为：cctcc no：c202173，于2021年10月28日在中国典型培养物保藏中心(cctcc)进行保藏。
9.一种抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体，该单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株hba(r)-1产生。
10.进一步地，单克隆抗体的亚型为igg2b。
11.上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备检测试剂中的应用。
12.上述单克隆抗体在制备检测小熊猫血红蛋白α亚基的产品中的应用。
13.进一步地，检测试剂或产品用于进行western blot检测。
14.上述单克隆抗体，或杂交瘤细胞株在小熊猫血红蛋白的定位或定量检测中的应用。
15.一种用于辅助诊断小熊猫血红蛋白相关疾病的试剂盒，包括上述单克隆抗体，或杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
16.上述抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
17.(1)设计小熊猫血红蛋白α亚基特异序列seq id no:1所示，氨基酸序列如下：kllshcllvtlachhpaeftpavhasldk，并与klh偶联，作为生产特异性抗体的免疫原hba(r)-klh；
18.(2)以步骤(1)制备的免疫原hba(r)-klh免疫小鼠；
19.(3)细胞融和得到抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆杂交瘤细胞株hba(r)-1；
20.(4)培养杂交瘤细胞株hba(r)-1，收集细胞上清液，纯化浓缩后得到该抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体。
21.本发明的有益效果：
22.本发明利用细胞融合技术，建立分泌抗小熊猫hba单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集并纯化细胞株培养上清，获得高特异性抗小熊猫hba单克隆抗体，并建立高特异性的hba单克隆抗体应用于western blot蛋白检测，为血红蛋白的定位与定量，研究血红蛋白的生理功能及血红蛋白病奠定基础。
附图说明
23.图1为实施例2中细胞血红蛋白浓度的标准曲线图；
24.图2为实施例2中western-blot检测结果。
具体实施方式
25.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
26.实施例1抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体的制备
27.1、特异多肽片段的设计与合成
28.根据ncbi数据库小熊猫hba氨基酸序列，登录号：p18969.2，序列为：mvlspadktnvkstwdklgghageyggealertfasfpttktyfphfdlspg saqvkahgkkvadaltlavghlddlpgalsalsdlhahklrvdpvnfklls hcllvtlachhpaeftpavhasldkffsavstvltskyr，并参考其它物种序列分析，设计了小熊猫hba特异序列kllshcllvtlachhpaeftpavhasldk(seq id no.1)，通过人工合成并与klh偶联，作为生产特异性抗体的免疫原hba(r)-klh。对于多肽片段的合成，此工艺比较成熟，通过本技术公开的序列，生工生物工程(上海)股份有限公司即可生产出多
肽片段hba(r)-1以及免疫hba(r)-klh。
29.2、抗原小鼠免疫
30.用佐剂：抗原＝1:1的混合液接种，(抗原量不够可与氯化钠混合后再与佐剂乳化)。首免用弗氏完全佐剂，后面免疫用弗氏不完全佐剂。免疫之前准备好灭菌的注射器、三通管、一次性注射器。先用灭菌好的注射器将抗原和nacl吸进注射器中(共400μl，四只的量)，再用灭菌好的注射器将佐剂吸入注射器中(共400μl，四只的量)；最后将灭菌好的注射器连在三通管中进行乳化(乳化大概10多分钟，至油包水状态即可)，最后再将融合好的混合液转入一次性注射器中进行注射。
31.第1天：腹腔注射，200μl一只。(抗原量为100μg/只)
32.第14天：腹腔注射，200μl一只。(之后抗原都为50μg/只)
33.第21天：腹腔注射，200μl一只。
34.第27天：腹腔注射，200μl一只。
35.…………………
36.(第三次免疫后3到4天可小鼠尾部采血，12000rmp，8min，取血清测定其效价，以hba-1，包被浓度为2μg/ml作为抗原，elisa方法检测血清效价，效价达标后即可准备融合，效价不够高者需继续免疫直至达标。)
37.3、细胞融合：
38.(1)骨髓瘤细胞(sp2)的复苏：先从液氮中取出冻存好的细胞，快速放于37℃水浴锅中融化，使细胞松散；再将细胞放入15ml的离心管中，再取大概5ml的pbs，混匀，1000rpm，5min，离心，弃上清，重复两次清洗sp2细胞，将细胞养在培养瓶中，做好标记，最后将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养。
39.(2)sp2细胞的传代：当培养瓶中的细胞长满瓶底80％左右，就可进行细胞传代。用枪头将细胞吹打下来，将培养液吸出至15ml离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，加pbs 5ml，吹打混匀，再次离心弃上清，重复pbs洗涤步骤2次。洗涤完后加2ml 10％完全培养液重悬细胞，取适量细胞至培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。
40.(3)滋养层巨噬细胞的制备(融合前一天可准备)：
41.小鼠脱颈椎致死，注意断颈椎时尽量减少对腹腔的压迫，避免损伤腹腔内血管，以防饲养细胞内含有大量血细胞。将小鼠浸泡于75％酒精中5分钟，然后手提住小鼠尾巴，上下于酒精中涮洗数次。置于无菌平皿中。用无菌剪刀从后腹剪开皮肤，用手将两侧皮肤撕开，暴露腹部，注意不要损伤腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。用注射器吸取6-8ml的含双抗的不完全培养基注射入腹腔(双抗:不完全培养液＝1:100)，注意注射时用镊子提起腹膜，避免针头刺到肠管等腹腔脏器。用棉球轻轻按摩腹部一分钟，吸出注入的培养液，转入离心管中。1000r/min离心5min，弃去上清。再用pbs洗涤四次。将细胞重悬于10％的完全培养液中。
42.将上述细胞悬液加入96孔板，每孔加100μl，最后将96孔板放入co2的培养箱培养。(巨噬细胞不易过多，可视情况丢弃一部分收集到的细胞。)
43.(4)免疫脾细胞制备：
44.1)取小鼠脾脏
45.取达到免疫要求的小鼠。首先要注意无菌操作，以防细胞污染，处死小鼠后，将其在75％的酒精中浸泡五分钟左右，放在无菌的平皿中，摆放在利于自己操作的位置(超净台
中)，进行解剖。先用剪刀将小鼠尾部剪一个小口，再用手剖开皮毛层，用酒精棉球轻拭剖开部位，再用镊子挑起包裹内脏的那层半透明的薄膜，将其剪开，暴露出脾脏，轻轻取出脾脏，并尽量去除上面的脂肪组织，将取出的脾脏至于pbs中洗涤。
46.2)脾细胞悬液制备
47.先用pbs洗涤脾脏，涮洗3次左右，将脾脏置于平皿中，用剪刀将脾脏尽可能的剪碎，加pbs洗涤过滤，不要组织细胞，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min，离心5分钟，弃上清；再用5ml pbs洗涤，1000r/min，离心5分钟；重复三次，洗涤完后加2ml不完全培养液(dmem)重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
48.3)sp2细胞悬液的制备
49.用胶头吸管将吸取细胞液吸气吹打培养瓶底部的薄膜(细胞均为悬浮或轻微帖壁生长)，再将细胞液用加样抢转移至15ml离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，再加pbs 5ml，混匀，1000r/min，离心5分钟，重复洗涤两次，洗涤完后加2ml不完全培养液(dmem)重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
50.(5)peg作用下进行细胞融合
51.将sp2与脾细胞按1：4(1:10至1:4之间)的比例混合在一起，离心，600rpm，3min；弃上清。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。1min内缓慢加入37℃预热好的0.6ml 50％peg溶液，边加边轻微摇动和叩击。加完后静置1min。37℃预热好的不完全培养液10ml以终止peg作用，边滴边叩击并旋转离心管，匀速加入，加完后静置2min。离心，800rpm，5min，弃上清；再用pbs或不完全培养液洗涤2次，以去除peg。
52.洗涤完后弃上清，用10ml hat选择培养液重悬细胞。上述细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内(用的是之前制备的巨噬细胞板，先将孔中的液体吸出不要，再用不完全培养液洗涤一次，吸出液体)，每孔加100μl；将培养板置co2培养箱中培养。4个小时之后再向孔中加入含hat的完全培养液(19.6ml10％完全培养液+0.4ml hat)，每孔加100μl；将培养板置co2培养箱中培养。
53.(6)选择培养
54.(1)融合培养的第四天半液法换hat培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μl，弃掉，再加入新的每孔100μlhat培养液(hat培养液配制为：10％的完全培养液：hat＝1:50)，每块板子需要在10ml完全培养液中加入200μl 50
×
hat。
55.(2)融合培养的第七天半液法换ht培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100μl，弃掉，再加入新的每孔100μlht培养液(ht培养液的配制为：10％的完全培养液：ht＝1:50)，每块板子需要在10ml完全培养液中加入200μl 50
×
ht。
56.(7)阳性克隆筛选
57.在培养7天左右可见孔内明显的克隆细胞，待克隆细胞长得足够多时(大概在第12天左右)，可吸取培养液检测其有无分泌抗体。
58.1)先将之前包被好的相应的elisa(包被hba-1，包被浓度为2μg/ml)板子从冰箱拿出让其恢复室温，再向板中加入要检测的培养液100μl每一孔，两孔做阴阳性对照，阴性对照用10％的培养液，阳性对照用稀释10000倍的血清(融合前小鼠眼眶采血的血清)。
59.2)孵育：用封板膜封板后置37℃孵育箱中孵育1小时。
60.3)洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
61.4)加双抗：双抗稀释10000倍，50μl每孔。
62.5)孵育：用封板膜封板后置37℃孵育30分钟。
63.6)洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
64.7)显色：每孔加显色剂tmb100μl，轻轻振荡混匀，孵育箱显色大概10min。
65.8)比色测定：每孔加终止液50μl(终止液＝21.5ml的浓硫酸定容至200ml)，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450nm，测定各孔值。选取阳性结果高者(至少为阴性对照的4倍)，作为阳性克隆孔。
66.(8)有限稀释法筛选抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆杂交瘤细胞株
67.1)阳性孔细胞的计数：将筛选得到的阳性克隆孔孔可做有限稀释。先将孔中的细胞转移到15ml的离心管中(边吹打边旋转，使细胞悬浮)，再补加10％的完全培养液至2ml；再用计数板计数，计数之后取只含1000个细胞的细胞液进行下一步实验(由于1个孔只需要一个细胞，96孔板一板就需要大约100个细胞，10板就是1000个细胞)。
68.2)将细胞液加入200ml完全培养液中，混匀，96孔板加样，200μl/孔，共十块96孔板。
69.3)最后将培养板置co2培养箱中培养。
70.4)培养4-5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，观察细胞的生长情况，记录单个细胞生长聚集的孔。
71.5)培养第5天给有记录单个细胞生长聚集的孔进行换液，加10％完全培养液100μl/孔。
72.6)第8-9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测，将由单个细胞生长聚集的孔并且生长情况比较好的孔进行培养液的检测(elsia检测)，阳性强的孔即为抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明最终筛选得到一株抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株hba(r)-1。
73.(9)亚型鉴定
74.使用pierce rapid elisa mouse mab isotyping kit 37503试剂盒进行亚型鉴定。
75.准备工作：将试剂盒中tbs溶于500ml双蒸水中，用于稀释样品，870ml双蒸水与30ml 30x wash buffer混匀，用于洗板，根据所做样品的量确定需要多少条板子，其余放回4℃冰箱保存，准备450μl的样品稀释液，吸取20μl的细胞培养液加入980μl的tbs中混匀。
76.实验步骤：将板子平衡到室温，加入待测样品到每孔，50μl/孔，每个样需加8孔即一条，加入50μl/孔的goat anti-mouse igg+iga+igm hrp，轻柔的晃动板子混匀盖上封板膜，室温孵育一个小时，洗板4次，扣干水分，加入75μl/孔的tmb显色液显色，将会看到孔内液体变成蓝色，显色5-15min之后加入75μl/孔的终止液终止反应，液体由蓝色变为黄色。经鉴定筛选所得到的抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株hba(r)-1所分泌的抗体亚型为igg2b型。
77.(10)单克隆抗体的扩大培养及纯化，浓缩。
78.1)批量培养：将进行了亚型鉴定，结果为单抗的细胞孔转移到24孔板中(边旋转边吹打，使细胞悬浮，进行完全转移)培养，并加600μl的10％完全培养液培养。
79.2)观察细胞的生长情况，长得比较多之后进行效价测定，效价高的细胞进行转移，转移到小的培养瓶中培养(先将24孔板中的细胞吹打使细胞悬浮，在用加样枪将细胞转移到培养瓶中，补加10％的完全培养液7ml)。
80.3)观察细胞生长情况，长得比较好之后再转移至大的培养瓶中培养。一个小的培养瓶分别转移两个大的培养瓶中进行培养(细胞传代)。
81.4)可多传几个培养瓶培养，冻存一部分细胞，再拿培养液进行抗体过柱纯化。所用柱子为所用填料为pierce protein g agarose，并用10000kda超滤管浓缩纯化过的抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体，-20度保存备用。
82.(11)单克隆抗体细胞株冻存
83.将鉴定的抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆杂交瘤细胞株hba(r)-1培养稳定后，将培养瓶中的细胞吹打使细胞悬浮在培养液中(细胞一般悬浮在培养液中或贴壁生长)，在将细胞转移至15ml的离心管中。离心，1000转/5分钟。用pbs洗涤两次：先将离心管中的上清液吸出，弃掉，加pbs，混匀，离心1000转/5分钟，最后重复一次。最后再用加样枪吸出上清液，再向细胞中加入适量冻存液(冻存液＝5ml血清+4ml dmem+1ml dmso，颠倒混匀，过滤备用)，混匀。最后加入冻存管中，每管1ml细胞液。放入冻存盒，先放-80℃过夜，再将细胞株hba-1放入液氮中长期保存备用。
84.实施例2抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体用于western blot检测
85.1、目的细胞总蛋白的提取
86.应用蛋白提取试剂盒：细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天)，货号：p0028，提取小熊猫骨髓间充质干细胞总蛋白，并通过bca法对总蛋白浓度进行测定。
87.2、制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶5％，分离胶12％。
88.3、制样：蛋白上样量为80μg。
89.4、电泳：浓缩胶80v，30min；分离胶120v，90min。
90.5、转膜：250ma，40min。
91.6、封闭：5％脱脂乳，37℃缓慢震荡2h。
92.7、孵育一抗：杂交瘤细胞株hba(r)-1抗体均1:1000稀释，4℃缓慢振荡过夜，次日37℃复温1h。
93.8、孵育二抗：1:8000稀释，37℃孵育1h。
94.9、ecl曝光。
95.western blot检测结果如下：
96.1、细胞蛋白浓度
97.(1)标准曲线
[0098][0099][0100]
标准曲线图如图1所示。
[0101]
(2)蛋白浓度
[0102][0103]
(3)western-blot检测结果如图2所示。
[0104]
本发明开发的抗小熊猫血红蛋白α亚基单克隆抗体，能准确识别目标蛋白hba，为hba蛋白的定位和细胞表达信息，研究血红蛋白的生理功能及血红蛋白病创造条件。