1.本发明涉及一种氯化锂的应用，尤其涉及一种用于调节牛乳腺上皮细胞的氯化锂的应用方法。


背景技术：

2.随着人们生活水平的不断提高以及健康观念的日渐重视，国民对乳品质要求越来越高，需求量也越来越大，富含营养成分的高品质牛奶以及奶制品衍生物受到了人们的青睐。在我国过去的十几年中，通过饲料营养调控改善牛奶成分和提高奶牛产奶性能的研究越来越受到重视，尤其是改善牛奶的蛋白质和脂肪酸组成成为研究的亮点。
3.共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，以下简称cla）是亚油酸的同分异构体，在反刍动物中发现的一个对人体有益的功能性不饱和脂肪酸。它具有抗癌、抗动脉硬化症、抗糖尿病、提高免疫力、改善骨组织代谢、抑制脂肪沉积等多种生物学功能。在自然界cla主要以cis-9，trans-11 cla的形式存在于反刍动物的乳制品和肉制品中。通过研究发现反刍动物中cla的合成主要在瘤胃和乳腺组织中进行。处于泌乳期的反刍动物通过摄入含有亚油酸（linoleic acid）或亚麻酸（linolenic acid）的饲料，亚油酸在瘤胃微生物的作用下通过氢键的转移生成cis-9，trans-11 cla，而生成的cis-9，trans-11 cla在瘤胃微生物的作用下进一步氢化成反式异油酸（tva，trans-11 c18:1，trans vaccenic acid），最终会氢化为硬脂酸（stearic acid，c18:0）。而亚麻酸在瘤胃中不会生成cis-9，trans-11 cla，但是会通过瘤胃微生物的氢化作用生成tva。这些未被氢化的cla和tva通过血液吸收转运到乳腺组织中，tva则在硬脂酰辅酶a脱饱和酶（scd，stearoyl-coa desaturase，被认为是δ9去饱和脂肪酸酶）的去饱和作用下而重新内源性合成cis-9，trans-11 cla。从整体上看，在瘤胃中cla的合成最多占30%，而超过70%以上甚至达到90%以上的cla是在乳腺组织中通过tva的去饱和作用而内源性合成而来。已知超过70%以上的cla是在乳腺组织中通过tva的去饱和作用内源性合成而来，但是tva转化成cla的效率还是很低，不能满足其有效功能的发挥。由于反刍动物体脂和乳脂中主要是cis-9， trans-11cla，并且乳制品是摄入cla的最好产品，所以如何提高反刍动物中cis-9，trans-11 cla合成的含量成为近几十年的重要研究热点。如能调控cla合成相关基因的表达，将会提高在乳腺中cla的合成效率，可以生产出更多富含cla的牛奶或羊奶，改善现有乳制品中因cla含量低而不能发挥其生理功能的缺陷，为国民提供富含cla功能性的乳产品。外源性添加营养素是否影响反刍动物内源性cla合成的研究还十分匮乏。
4.锂，是一种银白色碱金属元素，含量在地球上排第27位，普遍存在于地壳与各种矿泉水中，在植物中也有一定的含量。在自然界中，锂常以锂盐的形式存在，作为临床上的一种心境稳定剂，应用于精神疾病的治疗时间已超过 60年。除此之外，它还具有抗癌、抗病毒、抗炎、抗氧化、调节免疫、促进成骨等作用。锂缺乏会导致山羊生长受阻，繁殖性能下降等，而锂元素在奶牛营养上的研究比较少，在奶牛饲料中是否需要额外添加锂还未有明确说法。
5.在奶牛的饲养过程中，氯化锂可以通过饲料添加剂方式额外补充，本技术发明通过额外添加不同浓度的氯化锂到奶牛乳腺上皮细胞中，寻求其最佳适宜添加浓度和对乳合成的影响效果。


技术实现要素：

6.本发明实施例的目的在于提供一种用于调节牛乳腺上皮细胞的氯化锂的应用方法，旨在解决如何提高反刍动物中乳蛋白和cis-9，trans-11 cla合成的含量的问题。
7.本发明实施例是这样实现的，一种用于调节牛乳腺上皮细胞的氯化锂的应用方法，主要包括以下步骤：步骤一：氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂合成影响的应用：将奶牛乳腺上皮细胞接种在含生长培养基的培养皿中，于37℃细胞培养箱中培养；将奶牛乳腺上皮细胞进行分化诱导四天，同时加入不同浓度氯化锂，四天后提取收集rna及蛋白；通过qpcr、western blot方法检测氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白、信号通路pi3k/akt1/mtor、jak2/stat5以及乳脂合成相关酶的调控作用；通过qpcr、western blot方法初步探讨氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的调控机理；步骤二：所述氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞共轭亚油酸合成影响的应用：将奶牛乳腺上皮细胞接种在含生长培养基的培养皿中，于37℃细胞培养箱中培养；将奶牛乳腺上皮细胞分化诱导四天后处理筛选出最佳浓度的氯化锂并添加50μm tva，提取收集rna及蛋白；通过qpcr、western blot方法检测氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞cla合成关键标记基因的作用，利用气相色谱法检测细胞中cla的含量，确定氯化锂对乳腺上皮细胞cla合成的影响；通过qpcr、western blot方法初步探讨氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞cla合成调控的机理。
8.进一步的技术方案，所述生长培养基为添加了10%fbs、5μg/ml 胰岛素、1μg/ml 氢化可的松以及1% 青霉素-链霉素（100iu/ml 青霉素+100ug/ml 链霉素）的dmem培养基。
9.进一步的技术方案，分化诱导使用的分化培养基为添加了10%fbs、5μg/ml 胰岛素、1μg/ml 氢化可的松、5μg/ml 催乳素以及1% 青霉素-链霉素的dmem培养基。
10.进一步的技术方案，所述分化培养基放置于六孔板中，且所述分化培养基的用量为2ml。
11.进一步的技术方案，步骤一中的氯化锂的浓度有5 mm 、10 mm和20mm三种规格。
12.进一步的技术方案，步骤一中检测不同浓度氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白乳脂合成相关基因和蛋白调控作用包括以下步骤：i. 生长期乳腺上皮细胞接种至六孔板，每孔采用生长培养液静置培养直至细胞长至70%-80%；ii. 取六孔板，进行如下分组处理，处理组：吸弃培养液，用pbs清洗后加入含氯化锂的分化培养液，氯化锂的浓度为5 mm 、10 mm和20mm三种规格，置于37℃细胞培养箱中培养4天，并每天更换培养液，对照组：吸弃培养液， 用pbs清洗后加入分化培养液，置于37℃细胞培养箱中培养4天，并每天更换培养液，iii. 将各组培养4天后收集奶牛乳腺上皮细胞，提取rna和蛋白，利用qpcr检测与乳蛋白乳脂合成相关基因的表达，western blot检测乳蛋白乳脂合成相关蛋白的表达。4天
进一步的技术方案，步骤一中奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路jak2/stat5、pi3k/akt1/mtor、srebp1的qpcr及western blot检测包括以下步骤：1）将奶牛乳腺上皮细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组和三个氯化锂处理组，三个氯化锂处理组的氯化锂浓度为别为5 mm 、10 mm和20mm，处理4天；2）qpcr检测4个不同组别中jak2、elf5、stat5-β、socs2、socs3、pi3k、akt1、mtor、s6k1、eif-4e 、4ebp1、acc、fasn、lpl、hif-1α、epo以及epor基因表达的影响；3）western blotting 检测不同组别中 β-酪蛋白、p-stat5-β、mtor、p-mtor、s6k1、p-s6k1、scd、pparγ、srebp1、hif-1α、β-catenin、p-β-catenin的蛋白表达影响。
13.进一步的技术方案，步骤二筛选出的最佳氯化锂的浓度为10 mm一种规格。
14.进一步的技术方案，氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞共轭亚油酸(cla)合成影响的应用包括以下步骤：i. 生长期乳腺上皮细胞接种至六孔板，每孔采用生长培养液静置培养直至细胞长至70%-80%；ii. 取六孔板，进行如下分组处理，处理组：吸弃培养液，用pbs清洗后加入含10mm氯化锂的分化培养液，置于37℃细胞培养箱中培养4天，并每天更换培养液，4天后添加50μm tva处理4h，处理组分为以下三组：10mm氯化锂组、tva组、tva+10mm氯化锂组；对照组：吸弃培养液，用pbs清洗后加入分化培养液，置于37℃细胞培养箱中培养4天，并每天更换培养液；iii. 收集奶牛乳腺上皮细胞，提取rna和蛋白，利用qpcr检测与cla合成相关基因的表达，western blot 检测与cla合成相关的蛋白的表达，气相色谱法检测奶牛乳腺上皮细胞中cla的含量。
15.进一步的技术方案，氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞cla合成相关基因和蛋白的qpcr及western blot检测包括以下步骤：1）将奶牛乳腺上皮细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、10mm氯化锂组、tva组、tva+10mm氯化锂组；2）qpcr检测4个不同组别中scd、psma5、acc、fasn、lpl、plin2、srebp1、gsk3β、β-catenin、hif-1α、epo、epor基因表达的影响；3）western blotting 检测不同组别中scd、psma5、pparγ、srebp1、β-catenin、p-β-catenin、gsk3β、p-gsk3β和hif-1α的蛋白表达影响。
16.本发明实施例提供的一种用于调节牛乳腺上皮细胞的氯化锂的应用方法，利用实时荧光定量检测乳蛋白和脂肪酸合成相关基因的表达水平、利用蛋白质印迹检测相关蛋白和气相色谱法检测细胞中cla的含量，发现10mm浓度的氯化锂促进奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白和脂肪酸的合成，增强奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能。本发明中氯化锂可以有效激活hif-1α和wnt/β-catenin及其下游信号途径，并激活jak2/stat5、mtor和srebp1信号通路促进乳腺上皮细胞（mac-t）细胞中乳蛋白的合成并调节乳脂和cla的合成，改善奶牛乳腺的泌乳机能，增加经济效益。本发明也是首次为氯化锂调控奶牛乳腺组织中乳合成的机制提供了新的方向。
附图说明
17.图1为不同浓度氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响示意图；图2为不同浓度氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞内jak2 / stat5信号通路的影响示意图；图3为不同浓度氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞socs家族表达影响示意图；图4为不同浓度氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞pi3k / akt1 / mtor信号通路的影响示意图；图5为不同浓度氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因表达的影响示意图；图6为不同浓度氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞wnt/β-catenin和hif-1α信号通路影响示意图；图7氯化锂提高奶牛乳腺上皮细胞中cla内源性的合成过程中scd和psma5的表达示意图；图8氯化锂提高奶牛乳腺上皮细胞中cla的内源性合成示意图；图9氯化锂提高奶牛乳腺上皮细胞中cla内源性的合成过程中脂肪酸合成相关基因和蛋白表达示意图；图10氯化锂提高奶牛乳腺上皮细胞中cla内源性的合成过程中wnt/β-catenin通路基因和蛋白表达的影响示意图。
18.图11氯化锂提高奶牛乳腺上皮细胞中cla内源性的合成过程中hif-1α通路基因和蛋白表达的影响示意图。
具体实施方式
19.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
20.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
21.试验一：氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂合成影响的应用实施方案1：奶牛乳腺上皮细胞的培养奶牛乳腺上皮细胞（mac-t）。将mac-t细胞置于生长培养基【dmem，10%fbs，5μg/ml 胰岛素，1μg/ml 氢化可的松，1% 青霉素-链霉素（100iu/ml 青霉素+100ug/ml 链霉素）】中进行培养，传代2-3次后，将mac-t细胞接种于含有2ml分化培养基【dmem，10%fbs，5μg/ml 胰岛素，1μg/ml 氢化可的松，5μg/ml 催乳素，1% 青霉素-链霉素（100iu/ml 青霉素+100μg/ml 链霉素）】的六孔板中进行分化诱导4天，同时加入不同浓度氯化锂（5，10，20mm）进行培养。
22.实施方案2：氯化锂在促进奶牛泌乳中的应用—氯化锂对乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白的影响1、实施方案1制备的生长期乳腺上皮细胞接种至六孔板，每孔采用生长培养液静置培养直至细胞长至70%-80%左右；2、完成步骤1后，取所述六孔板，进行如下分组处理
处理组：吸弃培养液，用pbs清洗后加入含氯化锂（5，10，20mm）的分化培养液，置于37℃细胞培养箱中培养4天（每天均需更换培养液）；对照组：吸弃培养液， 用pbs清洗后加入分化培养液，置于37℃细胞培养箱中培养4天（每天均需更换培养液）。
23.将各组培养4天后收集奶牛乳腺上皮细胞，提取蛋白，利用western blot检测β-酪蛋白的表达。
24.β-酪蛋白的基因表达情况如图1a，1b所示，结果表明与对照组相比，添加氯化锂（5，10，20mm）的处理组均显著提高β-酪蛋白的蛋白表达（p《0.05）。
25.实施方案3：氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成相关通路的影响1、奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路jak2/stat5的qpcr及western blot检测将细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、氯化锂（5，10，20mm）处理组，处理4天。qpcr检测4个不同组别中jak2、elf5、stat5-β、socs2、socs3基因表达的影响，结果为附图2a所示，氯化锂（5，10，20mm）处理组jak2 的mrna表达水平与对照组比较差异无统计学意义（p 》0.05）。此外，10 mm氯化锂处理组细胞elf5的 mrna水平显著高于对照组(p《0.05)。在氯化锂（5，10，20mm）处理的mac-t细胞中，附图2a所示，stat5
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βmrna水平显著高于对照组(p《0.05)。值得注意的是，附图2b，2c氯化锂（5，10，20mm）处理组较对照组处理的mac-t细胞中，p-stat5-β蛋白水平显著升高。同时检测stat5-β抑制剂socs2和socs3的表达(图3a)。其中，氯化锂（5，10，20mm）处理组较对照组显著抑制jak2 / stat5通路抑制剂( socs2和socs3 )的mrna水平。而且，western blotting显示、氯化锂（5，10，20mm）处理组较对照组能明显抑制socs2的蛋白表达，氯化锂（5，10，mm）处理组较对照组明显抑制socs3的蛋白表达(图3b和3c)。
26.这些发现说明氯化锂可以通过抑制socs2和socs3的表达激活jak2/ stata5信号通路。
27.2、奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路pi3k/akt1/mtor的qpcr及western blot检测将细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、氯化锂（5，10，20mm）处理组，处理4天。qpcr检测4个不同组别中pi3k/akt1/mtor通路相关基因表达的影响。结果为附图4a所示，氯化锂（5，10，20mm）处理组与对照组相比，pi3k的mrna表达水平无显著性差异（p 》0.05）。氯化锂（5，10，20mm）处理组与对照组相比细胞中akt1的 mrna水平显著上调(p《0.05)。10和20 mm 氯化锂浓度处理与对照组相比细胞中s6k1的 mrna表达水平显著增高(p《0.05)。氯化锂（5，10，20mm）处理处理组与对照组相比细胞中eif-4e的 mrna 表达水平的无显著差异（p 》0.05）。氯化锂（5，10，20mm）处理组的 4ebp1 表达水平显著低于对照组(p《0.05)。western blotting显示（图 4b和4 c），结果表明氯化锂（5，10，20mm）与对照组之间的 mtor 蛋白表达水平没有显著差异（p 》0.05）。 此外，与对照组相比，氯化锂（5，10，20mm）显著增加了 p-mtor 蛋白表达(p《0.05)， 10 mm和 20 mm 氯化锂处理组与对照组相比显著增加了 s6k1和 p-s6k1 蛋白表达水平(p《0.05)。 最后，我们观察到 5 mm 氯化锂和对照组之间 s6k1和 p-s6k1 蛋白表达水平没有显著差异（p 》0.05）。
28.这些发现表明，氯化锂通过抑制socs2和socs3的表达激活jak2/stat5、mtor信号通路，影响磷酸化stat5-β、p-mtor、s6k1、p-s6k1水平，并最终调控β-酪蛋白表达。
29.实施方案4：氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关细胞因子的影响
1、奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关细胞因子的qpcr检测将细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、氯化锂（5，10，20mm）处理组，处理4天。qpcr检测4个不同组别中脂肪酸摄取基因（lpl）、活化和转运基因（fasn、acc）表达的影响。结果为附图5a所示，氯化锂（5，10，20mm）处理组显著提高acc和lpl基因表达水平（p《0.05），10 mm和 20 mm 氯化锂处理组与对照组相比显著提高了fasn基因表达水平（p《0.05）。
30.2、奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关细胞因子的western blot检测细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、氯化锂（5，10，20mm）处理组，处理4天。western blot检测4个不同组别中scd、pparγ、srebp1的蛋白水平影响。结果为附图5b和5c所示，氯化锂（5，10，20mm）处理组显著提高scd、srebp1、pparγ蛋白水平（p《0.05）。
31.这些发现表明，氯化锂影响乳脂合成相关酶以及网络调控因子，最终调控乳腺上皮细胞泌乳能力。
32.实施方案5：氯化锂调控wnt/β-catenin和hif-1α信号通路从而影响乳蛋白乳脂相关基因表达细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、氯化锂（5，10，20mm）处理组，处理4天。qpcr及western blot检测4个不同组别中wnt/β-catenin和hif-1α 信号通路基因和蛋白表达的影响。结果为附图6a所示，10mm和20mm 氯化锂显著提高hif-1α的基因表达（p《0.05），10mm氯化锂显著提高hif-1α下游基因epo的mrna表达（p《0.05），5mm和10mm氯化锂显著提高了hif-1α下游基因epor的mrna表达（p《0.05），附图6b和6c中western blotting结果显示，氯化锂（5，10，20mm）处理组显著提高了β-catenin和p-β-catenin的蛋白表达（p《0.05），10mm和20mm 氯化锂显著提高hif-1α的蛋白表达（p《0.05）这些发现表明，氯化锂可以通过激活wnt/β-catenin和hif-1α 信号通路从而影响乳蛋白乳脂相关基因和蛋白的表达。
33.试验二：氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞共轭亚油酸合成影响的应用实施方案1：奶牛乳腺上皮细胞的培养奶牛乳腺上皮细胞（mac-t）。将mac-t细胞置于生长培养基【dmem，10%fbs，5μg/ml 胰岛素，1μg/ml 氢化可的松，1% 青霉素-链霉素（100iu/ml 青霉素+100ug/ml 链霉素）】中进行培养，传代2-3次后，将mac-t细胞接种于含有2ml分化培养基【dmem，10%fbs，5μg/ml 胰岛素，1μg/ml 氢化可的松，5μg/ml 催乳素，1% 青霉素-链霉素（100iu/ml 青霉素+100μg/ml 链霉素）】的六孔板中进行分化诱导4天，同时加入不同浓度的氯化锂（1mm、5mm、10mm、15mm、20mm）进行浓度筛选，筛选出最佳氯化锂处理浓度后，再用50μm的tva处理 4小时。
34.实施方案2：氯化锂提高奶牛乳腺上皮细胞cla内源性的合成过程相关基因scd和psma5的表达影响1、实施方案1制备的生长期乳腺上皮细胞接种至六孔板，每孔采用生长培养液静置培养直至细胞长至70%-80%左右；2、完成步骤1后，取所述六孔板，进行如下分组处理处理组
①
：吸弃培养液，用pbs清洗后加入含（1mm、5mm、10mm、15mm、20mm）氯化锂的分化培养液，置于37℃细胞培养箱中培养4天（每天均需更换培养液），4天后提取rna和蛋白，利用qpcr检测scd和psma5的表达，初步筛选浓度。
35.处理组
②
：吸弃培养液，用pbs清洗后加入含（1mm、10mm、15mm）氯化锂的分化培养液，置于37℃细胞培养箱中培养4天（每天均需更换培养液），4天后再用50μm的tva处理 4小时，提取rna，利用qpcr和western blot检测scd和psma5的表达，筛选出最佳处理浓度。
36.对照组：吸弃培养液， 用pbs清洗后加入分化培养液，置于37℃细胞培养箱中培养4天（每天均需更换培养液）。
37.将各组培养4天后收集奶牛乳腺上皮细胞，提取rna，利用qpcr检测scd和psma5的表达。
38.scd和psma5的表达情况如图7a和7b所示，结果表明与对照组相比，添加氯化锂（5，10，15mm）的处理组显著提高scd的mrna表达（p《0.05）。氯化锂（5，10mm）的处理组显著提高psma5的mrna表达（p《0.05）。所以筛选出氯化锂（1mm、10mm、15mm）分化4天后再用50μm的tva处理 4小时，如图7c和7d所示，tva处理组与对照组相比显著抑制了scd和psma5的mrna表达（p《0.05），tva+氯化锂（1mm、10mm、15mm）与tva组相比，显著提高了scd的mrna表达（p《0.05），tva+氯化锂（1mm、10mm）与tva组相比，显著提高了psma5的mrna表达（p《0.05），这其中10mm氯化锂处理效果更好，所以筛选出10mm氯化锂为最佳处理浓度。用western blotting检测了氯化锂提高奶牛乳腺上皮细胞cla内源性的合成过程相关基因scd和psma5的蛋白表达影响，如图7e、7f和7g所示，氯化锂组对对照组相比显著提高了scd和psma5的蛋白表达（p《0.05），tva组与对照组相比显著抑制了scd和psma5的蛋白表达（p《0.05），tva+氯化锂组与tva组相比，显著提高了scd和psma5的蛋白表达（p《0.05）。
39.这些发现表明，氯化锂可以提高奶牛乳腺上皮细胞cla内源性的合成过程相关基因scd和psma5的表达影响。
40.实施方案3：氯化锂提高奶牛乳腺上皮细胞内源性cla的合成1、利用气相色谱法检测氯化锂在奶牛乳腺上皮细胞对内源性cla的合成作用将细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、tva组，10mm氯化锂组，tva+氯化锂组，细胞处理4天后再用50μm的tva处理 4小时。气相色谱法检测氯化锂在奶牛乳腺上皮细胞对内源性cla的合成作用，结果附图8所示，tva+氯化锂组与tva组相比，显著提高了显著提高了cis-9， trans-11cla的内源性合成（p《0.01）及cla指数（p《0.05）。
41.这些发现表明，氯化锂可以提高奶牛乳腺上皮细胞cla内源性的合成。
42.实施方案4：氯化锂对奶牛乳腺上皮细胞中cla内源性的合成过程中脂肪酸合成相关基因表达影响1、奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关细胞因子的qpcr和western blot检测将细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、tva组，10mm氯化锂组，tva+氯化锂组，细胞处理4天后再用50μm的tva处理 4小时。qpcr检测4个不同组别中脂肪酸摄取基因（lpl）、活化和转运基因（fasn、acc）表达的影响，脂肪分化相关蛋白（plin2）、脂肪酸网络调控基因（srebp1）表达的影响。结果为附图9所示，氯化锂组对对照组相比显著提高了acc、fasn、lpl、plin2、srebp1的mrna表达（p《0.05），tva组与对照组相比显著抑制了acc、fasn、lpl、srebp1的mrna表达（p《0.05），tva+氯化锂组对tva组相比，显著提高了acc、fasn、lpl、plin2以及srebp1的mrna表达（p《0.05）。western blotting检测了srebp1和pparγ的蛋白表达，结果为附图9f、g和h所示，氯化锂组与对照组相比，显著提高了pparγ的蛋白表达（p《0.05），tva+氯化锂组对tva组相比，显著提高了pparγ的蛋白表达（p《0.05），氯化锂组与对
照组相比，显著提高了srebp1的蛋白表达（p《0.05），tva组与对照组相比显著抑制了srebp1的蛋白表达（p《0.05），tva+氯化锂组对tva组相比，显著提高了srebp1的蛋白表达（p《0.05）。
43.这些发现表明，氯化锂可以提高奶牛乳腺上皮细胞中cla内源性的合成过程中脂肪酸合成相关基因和蛋白表达影响，氯化锂可以和tva相互作用，缓解了tva对这些基因的抑制作用。
44.实施方案5：氯化锂提高乳腺上皮细胞中cla内源性的合成过程中wnt/β-catenin和hif-1α相关基因表达的影响研究将细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、tva组，10mm氯化锂组，tva+氯化锂组，细胞处理4天后再用50μm的tva处理 4小时。qpcr及western blot检测4个不同组别中wnt/β-catenin和hif-1α 信号通路基因和蛋白表达的影响。结果为附图10a和b所示，tva组与对照组相比显著抑制了wnt/β-catenin通路抑制因子gsk3β的mrna表达（p《0.05），tva组与对照组相比显著抑制了wnt/β-catenin通路下游代表性蛋白β-catenin的mrna表达（p《0.05），tva+氯化锂组与tva组相比显著提高了β-catenin的mrna表达（p《0.05），同时我们对hif-1α信号通路相关基因进行了检测，如附图11a、b和c所示tva组与对照组相比显著抑制了hif-1α、epo和epor的mrna表达（p《0.05），氯化锂组与对照组相比显著提高了hif-1α、epo和epor的mrna表达（p《0.05），tva+氯化锂组与tva组相比显著提高了hif-1α、epo和epor的mrna表达（p《0.05）。western blotting检测了wnt/β-catenin和hif-1α 信号通路相关基因的蛋白表达，结果如附图10c、d、e、f和g所示，氯化锂组与对照组相比显著提高了β-catenin的蛋白表达（p《0.05），tva+氯化锂组与tva组相比显著提高了β-catenin的蛋白表达（p《0.05），tva组与对照组相比p-β-catenin的蛋白表达没有显著差异（p 》0.05），tva+氯化锂组与tva组相比显著提高了p-β-catenin的蛋白表达（p《0.05），氯化锂组、tva组、tva+氯化锂组与对照组相比，显著抑制了wnt/β-catenin信号通路的抑制因子gsk3β的蛋白表达（p《0.05），氯化锂组与对照组相比显著增加了p-gsk3β的蛋白表达（p《0.05），tva组与对照组相比p-gsk3β的蛋白表达没有显著差异（p 》0.05），tva+氯化锂组与tva组和对照组相比显著提高了p-gsk3β的蛋白表达（p《0.05）。对于hif-1α信号通路，如附图11d和e所示，tva组与对照组相比，显著抑制了hif-1α的蛋白表达（p《0.05），氯化锂组与对照组相比显著提高了hif-1α的蛋白表达（p《0.05），tva+氯化锂组与tva组相比显著提高了hif-1α的蛋白表达（p《0.05）。
45.这些发现表明，氯化锂可以通过激活wnt/β-catenin和hif-1α信号通路从而提高乳腺上皮细胞中cla内源性的合成。
46.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。