专利名称：脂肽衍生物，它们的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂肽配合物A1437的抗菌素衍生物，它们的制备方法以及它们作为药物的用途。
欧洲专利申请号0629636公开了一类脂肽，它们有十分类似的氨基酸序列但有不同的脂肪酸残基(脂类部分)，它们于发酵期间通过游动放线菌属.SP.被合成并释放到培养基中，该专利还公开了从培养基中游离脂肽的方法以及提纯方法及这种脂肽作为药理学活性物质的用途，制别是用于抗革兰氏阳性菌。
本发明的目的是寻找比天然的A1437脂肽毒性低的脂肽配合物A1437的衍生物。
本发明的上述目的通过式Ⅰ化合物的衍生物可达到。
因之本发明涉及1.以式Ⅰ表示的脂肽A1437衍生物及其药学上可接受的盐
其中R1是OH或NH2R2是直链或支链，饱和或不饱和脂肪族C8-C22酰基，它可以被苯基或环烷基或被氧隔开。
2.制备式Ⅰ化合物的方法，该方法包括使式Ⅱ化合物 其中R1和上述定义相同，R3是肽化学中公知的氨基保护基，优选叔丁氧羰基(BOC)，苄氧羰基(Z，CbZ)，药基甲氧羰基(Fmoc)或烯丙氧羰基(AllOC)保护基，和式Ⅲ的羧酸其中R2和上述定义相同，或者和羰基被活化的上述羧酸的衍生物进行反应;
3.含式Ⅰ脂肽衍生物及药物赋形剂的药剂，4.式Ⅰ的脂肽衍生物在制备抗细菌感染药物方面的用途。
本发明通过下文，特别是其优选的实施方案被详细地说明，本发明通过专利权利要求书的内容被进一步确定。
原料化合物(式Ⅱ化合物)从保护的发酵产品中获得，例如从A 1437 B(I，R1＝OH，R2＝(CH3)2CH(CH2)7CH＝CHCH2CO)和9-芴基甲基氯代甲酸酯得到，形成 的相应化合物，并随后通过用游动放线菌utabensisNRRL12052酶解消除脂肪酸残基(J.Antibiotics，1988，1093)。
假如使用式Ⅲ的羧酸本身作为酰化剂的话，存在缩合剂例如碳化二亚胺如N，N’-二环己基碳化二亚胺是方便的。式Ⅲ的羧酸可通过在肽化学中常规的方法，例如在“ChemieinunsererZeit”27-274-286(1993)中所述的方法使其活化。自然，合适的活化衍生物是酰卤如酰氯，酸酐或混合酸酐例如和甲酸酯形成的酸酐，叠氮化物，活性酯例如对硝基苯基酯，五氟苯酯，4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基酯，或者和N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑形成的酯，它们可通过碳化二亚胺作偶合剂来得到，也可以是硫代酯例如和2-巯基苯并三唑形成的硫代酯。另一些合适的偶合剂是N，N’-羰基二咪唑或基于磷盐或脲盐的那些化合物，例如BOP，HBTU，PyBOP，TBTU或TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基氨基-1，1，3，3-四甲基]脲四氟硼酸盐。
式Ⅱ化合物和式Ⅲ的羧酸或其活性衍生物的反应通常在惰性溶剂中例如二氯甲烷或二甲基甲酰胺中进行，优选在叔碱如吡啶或乙基二异丙基胺存在下进行。当使用取代的苯甲酰氯时，可以存在水并且加入碱如吡啶或碳酸钠。反应发生于-20°-+50℃范围内，优选-10°-+30℃之间。
消除保护基R3并形成式Ⅰ化合物是用文献中公知的方法完成的。例如BOC基团用三氟乙酸除去，Z基团用HBr/冰醋酸或催化氢化法除去，烯丙氧羰基用亲核试剂加pd催化剂除去，Fmoc基团用仲胺如哌啶除去。
式Ⅰ的优选化合物是其中R2是下述基团的那些式Ⅰ化合物;即R2是饱和脂族酰基CH3(CH2)nCO，支链饱和脂族酰基，优选(CH3)2CH(CH2)nCO或CH3CH2CH(CH3)nCO，不饱和脂族酰基，其中含一个或多个双键且其中一个双键可能是反式或是顺式的，优选H2C＝CH(CH2)nCO，(CH3)2CH(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO，CH3(CH2CH＝CH)n(CH2)nCO，CH3(CH2)nCH＝CH(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO，CH3(CH2)nCH＝CHCO，CH3(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO.或H(CH2CCCH3)＝CHCH2)nCO，有一个或多个三键的不饱和脂族基，优选HC≡C-(CH2)nCO，CH3(CH2)nC≡C(CH2)nCO，CH3(CH2)nC≡C-C≡C(CH2)nCO，被苯基或环烷基隔开的脂族酰基，优选 被氧隔开的酰基，优选 并且其中的n是0-20之间的整数特别优选的化合物是下述化合物它们有直链或支链C12-C15酰基例如十四烷酰基，十三烷酰基，12-甲基十三烷酰基，有一个或多个双键或叁键的不饱和C12-C18酰基例如顺-10-十五烯酰基，反-9-十六烯酰基，或H(CH2C(CH3)＝CHCH2)3CO，被1-3个苯基和/或又被氧隔开的脂肪酰基例如 其中n是0-8之间的整数。
更为特别优选的化合物是其中含被3个苯基隔开的脂族酰基如
的那些化合物，其中n是0-2之间的整数。
本发明还包括制备式Ⅰ化合物的方法，该方法包括使式Ⅱ化合物 其中R1有上述定义，以及R2是肽化学中公知的氨基保护基，例如是叔丁氧羰基(BOC)，苄氧羰基(Z，CbZ)，芴基甲氧羰基(Fmoc)，或烯丙氧羰基(Alloc)保护基，和式Ⅲ的羧酸进行反应，
其中R2有上述定义。
式Ⅰ化合物的特别有用的药学上可接受的盐是和无机或有机酸形成的盐，例如和盐酸，硫酸，乙酸，柠檬酸，对甲苯磺酸形成的盐，以及和无机或有机碱如NaOH，KOH，Mg(OH)2，二乙醇胺，亚乙基二胺，形成的盐，或是和氨基酸例如如精氨酸，赖氨酸，谷氨酸形成的盐，它们可通过标准方法制备。
本发明的一个或多个脂肽或其盐由于它们可贵的药理学性质因而可用作药物使用。
本发明的物质有药理学活性，特别是作为抗革兰氏阳性菌的抗菌剂，尤其特别是对于MRSA和抗糖肽类菌株。
经常仅仅糖肽类如万古霉素或teicoplanin对能进一步产生抗菌素抗性的抗青霉素或抗甲氧苯青霉素菌株(MRSA株)具有足够的治疗效果，但对这些抗菌素有抗性的菌株不断出现(FEMSMicrobiol.Lett.98(1992)109-116)。本发明的一个或多个脂肽类化合物对于有上述问题的菌类具有优异的效果。
本发明还涉及本发明的一个或多个脂肽类化合物或其盐的药物组合物。
本发明的一个或多个脂肽类化合物，优选其中酰基R2中有三个苯基的一个或多个化合物原则上不同稀释即可给药，但较好的用药方法是和助剂，载体或稀释剂混合使用。在用作兽药时可以用食品混合物作为载体，在用作药剂情况下，可以使用所有药理学上可接受的载体和/或助剂。
本发明的药物通常可口服或非肠道给药，但原则上讲也可以直肠给药。合适的固体或液体药剂的实例是颗粒剂，粉剂，片剂，包衣片剂，(微)胶囊，栓剂，糖浆，乳剂，悬浮剂，气雾剂，滴剂，安瓶形式的注射溶液以及活性物质可以缓释的产品。在其制备过程中通常可以使用赋形剂，添加剂和/或各种助剂，如崩解剂，或粘合剂，涂敷剂和膨胀剂，滑动剂或润滑剂，调味剂或甜味剂或增溶剂。可以提出的经常使用的赋形剂或助剂的实例是碳酸镁，二氧化钛，乳糖，甘露醇及其它糖，滑石粉，乳白蛋白，明胶，淀粉，维他命，纤维素及其衍生物，动物油或植物油，聚乙二醇和溶剂如无菌水，醇类，甘油及多羟基醇。
可以提出的稀释剂的实例是聚乙二醇，乙醇和水。缓冲物的实例是有机物如N，N’-二苄基亚乙基二胺，二乙醇胺，亚乙基二胺，N-甲基葡糖胺，N-苄基苯乙胺，二乙胺，三(羟甲基)氨基甲烷，或者是无机化合物如磷酸盐缓冲剂，碳酸氢钠，碳酸钠等。以及无赋形剂或稀释剂的合适形式的活性物质给药也是可以的。工Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐的合适的剂量对每个体体重约75kg的成人每天约为0.4g，优选0.5g到最大20g。通常也可以单剂或多次剂给药，单剂可含约50-1000mg活性物质。
合适的话，口服给药的剂型可以是微囊，这样可以缓慢释放或延迟较长时间，例如在聚合物，蜡等中以合特定的形式涂或包进活性物质。
药用产品优选以剂型形式生产和给药，每个剂型含一定剂量的一个或多个本发明的脂肽化合物作为活性成份。在如片剂，胶囊和检剂的固体剂型中，剂量每天可以到约200mg，但优选0.1-100mg，在安瓶形式的注射溶液中，剂量每天可以到约200mg，但优选0.5～100mg。
每日给药剂量依赖于哺乳动物的体重，性别，年龄和其它状况。但在某些情况下较多或较低的日剂量也是可以的。日剂量可以一剂型形式一次给药，也可以以许多较小的剂型给药，以及可以间隔一定时间分剂量多次给药。
本发明的药物是通过将本发明的一个或多个脂肽化合物和常规的赋形剂及合适的话还有添加剂和/或助剂一起较变成合适的给药形式制备出来的。
酰基R2中带三个苯基的特别优选的式Ⅰ化合物(实施例55，56)具有十分好的毒理学性质。在标准的溶血试验中，它们实际上未显示出血细胞溶解的证据，而直链或支链脂族酰基的所有试验化合物，包括天然物质均显示出16-25%的极大活性(见表1)表1离体试验中的溶血活性表1
1)发酵产物Ⅰ(R1＝OH，R2＝(CH3)2CH(CH2)9CH＝CHCH2CO)2)使用从恒河猴静脉取出的新鲜血液测定溶血活性，将血液放进肝素化的试管里，每份取200μl放入12个聚乙烯的小管中，往其中一份中加200μl蒸馏水，它作为100%的标准，另一份加200μl生理食盐水(0.9%NaCl)(作为0%标准)，往其余的小管中加入分别含1600，800，400，200，100，50，25，12.5，6.25和3.125mg/l试验化合物的200μl生理食盐水稀溶液。将所有小管小心旋动并于37℃下保温3小时，然后往100%标准管中加5ml蒸馏水，其余各支管中各加5ml生理食盐水，于700g下离心5分钟。用分光光度计在波长为540nm处测定上清液的吸收来确定溶血情况，将完全溶血的标准吸收(加蒸馏水的)设定为100%，测定试验产品稀溶液及0%标准的吸收，并以可归纳的最大血溶百分率记录下来。
按照本发明制备的下述实施例的化合物可进一步说明本发明。
本发明进一步用以下实施例阐明，百分比均为重量百分数，除另有说明以外，在液体情况下的混合比都是体积比。
反应产品的纯度用分析用HPLC测定(Merck，Darmstadl，Lichrospher(R)100RP-8，125×4mm，洗脱体系为水加三氟乙酸，pH2.5，0.1%辛基磺酸钠/乙腈，用UV在220nm处检测)，结构用电子撞击质谱(BIO-Q-MS)确定。
为了简便，以下用术语A 1437环肽表示R2＝H的式Ⅰ化合物。
实施例1A1437环肽的十三烷酰衍生物(式Ⅰ化合物，R1＝HO，R2＝CH3(CH2)nCO)TOTU偶联法a)十三烷酸的活化113mg(0.527mmol)十三烷酸溶于3.75mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入172.5mg(0.526mmol)TOTU和乙基二异丙基胺(0.5mmol)在DMF中的1.25g溶液(0.4mmol/g)。将该溶液于室温下放置1小时。
b)偶联将348mg(0.264mmol)Fmoc衍生物Ⅱ(R1＝OH，R3＝芴基甲氧羰基;实施例69)悬浮于7.2ml无水DMF中，于冰浴上加入2.9g活性溶液a)(0.25mmol)，将形成的淡棕色溶液于室温下搅拌1.5小时。
c)Fmoc保护基的消除将溶液b)冷却至10°，加6ml哌啶，混合物于室温下搅拌1小时，用250ml水稀释并冻干。
d)提纯冻干的残留物悬浮于100ml水/乙腈(5∶1)中，用1.5ml 2N HCl调节pH至2.0，将澄清的溶液用90g RP18硅胶进行层析(Merck，Art.9303)，用水+0.01%(CF3COOH/乙腈洗脱，洗脱顺序为500ml(3∶1的混合物)，500ml(2∶1的混合物)，600ml(1∶1的混合物)，标题化合物出现在1∶1的级份中(VV检定，220nm)，产量267mg(理论量的78%)，纯度为72%。
粗产品用Biichi中压柱再一次层析(250g RP18，用水+0.01%CF3COOH/乙腈(3∶2)洗脱)将，含产品的级份冷冻干燥。
产量130mg，纯度96%C58H93N13O20[1292.5]MS1293实施例2A1437环肽的4-辛基苯甲酰基衍生物化合物 I，R1＝HO， 酰氯法a)偶联6.6mg(0.005mmol)Fmoc衍生物Ⅱ(实施例69)被溶于200mg吡啶/水(9∶1)中，并于-20℃加入25mg(0.1mmol)4-辛基苯甲酰氯，于室温将该溶液搅拌4小时，加2ml二噁烷之后于真空下除去溶剂，将残留物溶在0.2mlDMF中。
b)Fmoc保护基的消除将0.2ml哌啶加到溶液a)中，将混合物于室温下放置1小时，溶液用5ml水稀释并冻干。
c)提纯冻干的残留物用10g RP18硅胶进行层析，用水+0.01% CF3COOH/乙腈洗脱，洗脱顺序为80ml(3∶1混合物)，80ml(2∶1混合物)，80ml(1∶1混合物)，将1∶1的产品级份冻干。
产量4.6mg(理论量的70%)，纯度85%C60H80N13O20[1312.5]MS1313用类似于实施例1的方法得到列于其后的其中R1＝HO及取代基R2如表2指出的那些式Ⅰ化合物。产率为理论量的60-85%之间，纯度在75-98%。
表2

用类似实施例2的方法得到下列其中R1＝HO及取代基R2如表3所指出的那些式Ⅰ化合物。产率在理论产率的70-85%之间、纯度在80-98%之间表3
用类似于实施例1(化合物59-66)或实施例2(化合物67和68)的方法，得到下列其中R1＝NH2及取代基R2如表4指出的那些式Ⅰ化合物。产率是在理论量的75-85%之间，纯度是80-98%。
表4
原料化合物制备实施例69A1437的9-芴基甲氧羰基衍生物 10g(7.67mmol)A 1437(式Ⅰ，R1＝HO，R2＝(CH3)2CH(CH2)7CH＝CHCH2CO)和3.24g(38.35mmol)碳酸氢钠溶于920ml水和640ml丙酮的混合物中，然后边监视PH，边将2.97g(11.5mmol)9-芴甲基氯代甲酸酯在240ml丙酮的溶液于pH8.5下于100分钟内滴加到上述混合物中，在此期间将反应溶液温热到27℃，然后于室温搅拌1小时，真空下除去丙酮，将水溶液冻干，无色残留物在搅拌下每次用500ml二氯甲烷萃取两次，除去低分子量的杂质。
产量12.2g，MS1526.7实施例70A1437环肽的9-芴基甲氧羰基衍生物
10g实施例69的产物和300g的湿的Actinoplanes Utahensis mycelium于1升无菌磷酸钾缓冲液·(100mmol，pH7.2，50mmol EPTA，0.02%叠氮化钠)于32℃下搅拌48小时。离心除去生物体，溶液通过500g MCl胶(Mitsubishi制造)过滤，固定该产物，产物用水/甲醇(1∶1)洗脱，浓缩洗脱液以便除去甲醇，水相用500g RP18层析，用水+0.05%三氟乙酸/乙腈(2∶1)洗脱，真空中浓缩产品级份并冻干。
产量6g，MS1318.4实施例714-(2-(4-(2-苯乙基)苯基)乙基苯甲酸第一步33.9g三苯磷加到22.9g4-溴甲基苯甲酸甲酯在1000ml甲苯中的溶液中，回流下将混合物加热，7小时后完成反应，冷后将产品吸滤。
产量47.6g第二步58.9g第一步得到的产物悬浮在500ml无水四氢呋喃中并冷至0℃，加入120ml1M的双三甲基硅胺锂的THF溶液，室温放置1小时后再将混合物冷至0℃，加入19.3g芪-4-醛，将混合物于50℃下搅拌2.5小时，冷至0℃，沉出的固体被吸滤，残留物用0.5升THF洗涤，有机相用750ml乙酸乙酯稀释，用750ml饱和氯化铵溶液洗涤，水相用750ml乙酸乙酯萃取，有机相用硫酸钠干燥，并浓缩，粗产品用于下一步骤。
产量49.9g第3步26.7g第2步得到的粗产品同5g载于活性炭上的钯(10%Pd)一起悬浮于1000ml甲醇中，于室温及大气压下氢化3小时，热滤出催化剂真空浓缩溶液，产品通过硅胶层析提纯，用庚烷/乙酸乙酯(10∶1)洗脱。
产量7.4g第4步1.98g步骤3得到的产物悬浮于60ml乙醇中，加入508mgKOH在10ml水中的溶液，于回流下加热1.5小时，真空下除去乙醇，残留物溶于500ml乙酸乙酯和200ml水中，用2NHCl调至pH为2将混合物搅拌0.5小时，分出水相，水相再用200ml乙酸乙酯萃取一次，合并有机相，用硫酸钠干燥，真空浓缩。
标题化合物产量1.86g第5步酰氯1.23g第4步得到的产物悬浮于10ml二氯亚硫酰中，回流下加热该混合物直至无气体放出，冷后真空下浓缩，每次用5ml甲苯蒸发2次。
产量1.35g，浅灰色晶体化合物。
实施例724-(2-(4-联苯基)乙基)苯甲酸第1步类似于实施例71的第2步，6.4g溴化物(实施例71第1步的产物)和1.82g联苯基-4-醛反应。
产量5.8g第2步5.8g第1步得到的产物，按照和实施例71第3步相似的方法进行加氢，产物经层析提纯。
产量970mg第3步950mg第2步得到的产物按照和实施例71第4步相同的方法进行水解。
产量880mg第4步850mg第3步得到的产品按照和实施例71第5步相同的方法和亚硫酰氯反应得到酰氯产量909mg
权利要求
1.式Ⅰ的脂肽A1437衍生物及其药学上可接受的盐 其中R1是OH或NH2，R2是直链或支链，饱和或不饱和脂族C8-C22酰基，它可被苯基或环烷基或氧隔开。
2.按照权利要求1的脂肽衍生物，其中R2是饱和脂族酰基CH3(CH2)nCO，支链饱和脂族酰基，优选(CH3)2CH(CH2)nCO或CH3CH2CH(CH3)(CH2)nCO，含一个或多个双键的不饱和脂族酰基，其中的一个双键可以是反式或顺式，优选H2C＝CH(CH2)nCO，(CH3)2CH(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO，CH3(CH2CH＝CH)n(CH2)nCO，CH3(CH2)nCH＝CH(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO，CH3(CH2)nCH＝CH-CO，CH3(CH2)nCH＝CH(CH2)nCO或H(CH2C(CH3)＝CH(CH2)nCO，有一个或多个叁键的不饱和脂族基，优选HC≡C-(CH2)nCO，CH3(CH2)nC≡C(CH2)nCO，CH3(CH2)nC≡C-C≡C(CH2)nCO，被苯基，环烷基隔开的脂族酰基，优选 被氧隔开的酰基，优选 其中n是0-20的整数。
3.按照权利要求1的脂肽衍生物，其中R1是OH或NH2，R2是直链或支链C12-C15酰基，优选十四烷酰基，十三烷酰基，12-甲基十三烷酰基，有一个或多个双键或叁键的不饱和C12-C18酰基，优选顺-10-十五烯酰基，反-9-十六烯酰基或H(CH2-C(CH3)＝CHCH2)3CO或被1-3个苯基和/或又被氧隔开的脂族酰基，优选 并且其中n是0-8间的整数。
4.按照权利要求1的脂肽衍生物，其中R1是OH或NH2R2是被3个苯基隔开的脂族酰基，优选 其中n是0-2间的整数。
5.制备式Ⅰ化合物的方法，包括使式Ⅱ化合物 其中R1有上述定义，以及R3是肽化学中公知的氨基保护基;优选叔丁氧羰基(BOC)，苄氧羰基(Z，Cbz)，芴基甲氧羰基(Fmoc)或烯丙氧羰基(Alloc)保护基，和式Ⅲ的羧酸或其羰基被活化的衍生物反应其中R2定义如权利要求1。
6.式Ⅰ的脂肽衍生物作为药物的用途。
7.含式Ⅰ脂肽衍生物及药物赋形剂的药物。
8.式Ⅰ的脂肽衍生物在制备抗细菌感染的药物方面的用途。
全文摘要
公开了式I的脂肽衍生物，其制备方法和用途，该衍生物中R
文档编号C07K14/41GK1111640SQ9510362
公开日1995年11月15日 申请日期1995年3月28日 优先权日1994年3月30日
发明者R·拉特利, T·沃尔曼, H·沃尔梅尔, P·海曼尼, D·艾思特 申请人:赫彻斯特股份公司