1.本发明属于生物高技术领域，涉及一种协同降解苯腈类除草剂的微生物组合物及其生产的菌剂。
背景技术：
2.卤代芳烃类化合物多具有化学性质稳定，化学性能优越的优点，可作为农药、阻燃剂、染料、药物及各类中间体，被广泛运用于工农业生产，产生了巨大的经济和社会价值，大大改善了人类的生活。但卤代芳烃同时也具有高毒性、高稳定性的特点，可在环境中长期稳定存在，有一定刺激性、致癌性、致畸性与神经和生殖毒性等。卤代芳烃污染对生态系统以及人类健康造成了严重的威胁，因此卤代芳烃污染物的治理已成为严峻的环境科学问题。
3.辛酰溴苯腈(bromoxynil octanoate，简称bo)，化学名称为3,5-二溴-4-辛酰氧基苄腈，是一种具有传导活性的选择性苗后茎叶处理触杀型除草剂。(辛酰)溴苯腈为ii类-中毒农药，对小兔、蚯蚓、鱼类、藻类等生物的生存有严重毒害作用。
4.卤代苯甲酸是一类重要的化工中间体，也是复杂的卤代芳烃在环境中代谢的重要中间产物。由于卤素元素的电负性极强，易于生命细胞中的酶系统结合，导致这类化合物稳定性高、毒性强，易在环境中迁移，造成土壤和水体严重的面源污染。3,5-二溴-4-羟基苯甲酸(3,5-dibromo-4-hydroxybenzoate,简称dbhb)是重要的一类重要的化工中间体，比如是抗痛风药苯溴马隆的合成前体。同时，dbhb是除草剂溴苯腈的主要中间代谢物，由于溴苯腈的大量使用导致dbhb在环境中被广泛检出，对环境与人类健康有较大威胁。
5.生物降解是农药在环境中的一类重要转化过程。微生物由于大量存在于自然界、并且具有种类繁多、繁殖迅速和对环境适应性强等特点，在农药的生物降解过程中起到了重要作用。利用微生物的新陈代谢作用，对易残留的农药进行转化，使其无毒化，也是目前研究的热点。自然环境中，有机污染物的降解往往不是单一细菌的作用，而是复杂的微生物群落中的菌株相互作用完成对有机污染物快速高效的分解代谢。近年来，随着微生物组学、计算生物学、合成生物学等研究的迅猛发展，人工构建高效稳定的人工菌群逐渐成为研究热点，合成微生物菌群能够完成单一菌株无法完成的目标，使其适应更复杂的环境，从而满足更广泛的需要。
技术实现要素：
6.本发明针对环境修复的实际问题与重要需求，开发研制出一种新型的苯腈类除草剂污染修菌剂，使用本菌剂可以使土壤和水体中(辛酰)溴苯腈的残留量降低95％以上，且生产成本较低。
7.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
8.一种微生物组合物，其特征在于由pseudoxanthomonas sp.x-1和bacillus sp.r45组成。其中菌株x-1是革兰氏染色阴性的pseudoxanthomonas sp.，2021年10月18日保存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no：m20211288。菌株x-1的形态学特
征为在lb平板上呈淡黄色菌落，菌落圆形，小而凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明。主要生物学特性为g-，菌体为短棒状，大小约0.8μm宽,2.0μm长，无鞭毛，好氧；吲哚反应阴性，不能水解淀粉，不能氧化葡萄糖产酸。菌株x-1对氨苄西林，新生霉素，林可霉素以及呋喃妥因有耐受性；菌株生长后期会产生红褐色分泌物。菌株r45是革兰氏染色阳性的bacillus sp.，2021年10月13日保存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no：m20211262。菌株r45的形态学特征为在lb平板上呈白色菌落，菌落圆形，大而凸起，表面干燥褶皱，边缘整齐，不透明。在加了辛酰溴苯腈的lb平板上生长时，菌落周围产生透明水解圈。主要生物学特性为g
+
，菌体为短棒状，大小约1.1μm宽,2.1μm长，周生鞭毛，好氧；吲哚反应阴性，不能水解淀粉。菌株r45对壮观霉素有耐受性。菌株r45可以降解辛酰溴苯腈但是速度极其缓慢，而菌株x-1可以快速降解辛酰溴苯腈并将产生的溴苯腈释放给菌株r45，有利于菌株r45对溴苯腈直接高效代谢，并产生碳源和能源供菌株x-1和r45的生长代谢，实现共赢。在实验室摇瓶培养条件下降解率皆达99％以上。该人工合成菌群可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
9.本发明所述的微生物组合物在降解卤代芳烃类除草剂和/或卤代苯甲酸中的应用。
10.作为本发明的一种优选，所述的卤代芳烃类除草剂为苯腈类除草剂，优选自辛酰溴苯腈、溴苯腈中的任意一种或多种；所述的卤代苯甲酸选自3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸中的任意一种或多种。
11.本发明所述的微生物组合物在制备降解卤代芳烃类除草剂和/或卤代苯甲酸的菌剂中的应用；所述的卤代芳烃类除草剂优选苯腈类除草剂，进一步优选自辛酰溴苯腈、溴苯腈中的任意一种或多种；所述的卤代苯甲酸优选自3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸中的任意一种或多种。
12.一种协同降解卤代芳烃类除草剂或卤代苯甲酸的菌剂，由所述的pseudoxanthomonas sp.x-1的发酵液和所述的bacillus sp.r45的发酵液混合制备得到液体菌剂。
13.作为本发明的一种优选，所述的pseudoxanthomonas sp.x-1的发酵液和所述的bacillus sp.r45的发酵液按照1:0.8～1.5体积比混合制备得到液体菌剂；优选按照1:1体积比混合制备得到液体菌剂。
14.使用上述苯腈类除草剂降解菌生产菌剂的工艺为：斜面种－摇瓶种－种子罐－生产罐－产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。
15.本发明的详细实施步骤为：
16.(1)将苯腈类除草剂降解菌x-1和r45的试管种分别接种于lb培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；
17.(2)将上述培养好的菌液按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖8g/l，酵母膏5g/l，k2hpo
4 1g/l，nacl 5g/l，caco
3 2g/l，mgso
4 0.2g/l，大豆油0.1％(v/v)，ph值7.2-7.5；
18.(3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；
19.(4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6－1.2，搅拌速度
为180－240转/分，培养温度为35℃，全流程培养时间为96-108小时,发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上,发酵完成后两个菌种的培养液出罐直接按1:0.8～1.5体积比，优选按照1：1的体积比等浓度混合，混合均匀后的培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
20.本发明所述的菌剂在降解卤代芳烃类除草剂和/或卤代苯甲酸中的应用。
21.作为本发明的一种优选，所述的卤代芳烃类除草剂为苯腈类除草剂，优选自辛酰溴苯腈(bo)、溴苯腈中的任意一种或多种；所述的卤代苯甲酸选自3,5-二溴-4-羟基苯甲酸(dbhb)、3-溴-4-羟基苯甲酸(bhb)中的任意一种或多种。
22.作为本发明的进一步优选，所述的菌剂在消除环境中卤代芳烃和/或卤代苯甲酸的污染中的应用，优选在消除土壤、水体中卤代芳烃和/或卤代苯甲酸的污染中的应用。
23.有益效果本发明提供一个苯腈类除草剂的协同降解菌群，该菌群由两种微生物组成(菌株r45和菌株x-1)。人工合成降解菌群具有较广的降解谱，可降解辛酰溴苯腈、溴苯腈、3,5-二溴-4-羟基苯甲酸和3-溴-4-羟基苯甲酸等多种卤代芳烃。降解菌群具有较高的降解效率，可在90小时内降解60mg/l的辛酰溴苯腈(bo)达100％，可在90小时内降解其产物溴苯腈达75％。具有广泛的应用潜力和价值。使用该细菌菌群生产的降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，修复效果好的优点，比单菌株降解污染物效果更好，环境适应性更强。适合在全国受卤代芳烃污染的化工园区、农业生产区、粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于治理苯腈类除草剂污染，保护生态环境，防治地下水污染，保护人民的身体健康等方面具有重要的意义。
24.本发明成功地解决了工农业生产活动中造成的苯腈类除草剂的污染问题，从而保护生态环境，维护人类健康。
附图说明
25.图1菌株x-1在lb平板上的菌落形态(a)、在辛酰溴苯腈平板上产生水解圈(b)和电镜照片(c)
26.图2菌株r45在lb平板上的菌落形态(a)、在辛酰溴苯腈平板上产生水解圈(b)和电镜照片(c)
27.图3菌株x-1的16s rrna基因系统发育分析
28.图4菌株r45的16s rrna基因系统发育分析
29.图5协同菌群对辛酰溴苯腈的降解曲线与产物溴苯腈生成的曲线
30.图6环境因素对协同菌群降解辛酰溴苯腈的影响
31.图7菌株x-1对辛酰溴苯腈的降解曲线(a)及hplc对其降解产物的检测(b)
32.图8菌株r45对辛酰溴苯腈(a)及溴苯腈(b)的降解曲线
33.生物材料保藏信息
34.r45，分类命名为bacillus sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no：m20211262，保藏日期为2021年10月13日，保藏地址为湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心。
35.x-1，分类命名为pseudoxanthomonas sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no：m20211288，保藏日期为2021年10月18日，保藏地址为湖北省武汉市，洪
山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心。
具体实施方式
36.实施例1、菌株的分离与鉴定
37.本发明提供一个苯腈类除草剂的协同降解菌群及其生产的菌剂，所用菌株为革兰氏染色阳性菌r45和革兰氏染色阴性菌x-1，分离自江苏常州某农药厂厂区的土壤中。菌株具体的分离筛选方法为：
38.取土样5.0g加入到100ml含有0.2mm辛酰溴苯腈的无机盐(以下简称mm)培养基，30℃、150rpm摇床培养5d，以5％接种量(v/v)转接至新鲜的同一培养基中，连续富集培养四次。将第五代富集液在含有1mm辛酰溴苯腈的mm固体培养基上稀释涂布，30℃培养4d，挑取平板上产生透明水解圈的单菌落于4ml液体lb试管培养基中，然后保存并转接至20ml含有0.2mm辛酰溴苯腈的mm培养基中，30℃培养5d，用等体积的二氯甲烷萃取，紫外分光光度计检测效果，从而获得辛酰溴苯腈降解菌株，将这些菌株人工组合成不同菌群，检测菌群的降解效果，从而获得最优组合的人工合成降解菌群。
39.2021年10月18日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc m 20211288，经鉴定属于pseudoxanthomonas sp.。菌株x-1的形态学特征为在lb平板上呈淡黄色菌落，菌落圆形，小而凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明。主要生物学特性为g-，菌体为短棒状，大小约0.8μm宽,2.0μm长，无鞭毛，好氧(图1)；吲哚反应阴性，不能水解淀粉，不能氧化葡萄糖产酸。菌株x-1对氨苄西林，新生霉素，林可霉素以及呋喃妥因有耐受性；菌株生长后期会产生红褐色分泌物。将菌株r45的16s rrna基因序列在数据库ezbiocloud中比对分析，结果显示菌株r45与属亲缘关系最近，其中与pseudoxanthomonas winnipegensis nml130738
t
相似性达99.23％，与pseudoxanthomonas helianthi roo10
t
相似性达96.95％。结合菌落形态特性、生理生化特征以及16s rrna基因系统发育分析，菌株x-1初步鉴定为pseudoxanthomonas属(图3)。
40.2021年10月13日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc m 20211262，经鉴定属于bacillus sp.。菌株r45的形态学特征为在lb平板上呈白色菌落，菌落圆形，大而凸起，表面干燥褶皱，边缘整齐，不透明。在加了辛酰溴苯腈的lb平板上生长时，菌落周围产生透明水解圈。主要生物学特性为g
+
，菌体为短棒状，大小约1.1μm宽,2.1μm长，周生鞭毛，好氧(图2)；吲哚反应阴性，不能水解淀粉。菌株r45对壮观霉素有耐受性。将菌株r45的16s rrna基因序列在数据库ezbiocloud中比对分析，结果显示菌株r45与属亲缘关系最近，其中与bacillus velezensis cr-502
t
相似性达99.21％，与bacillus siamensis kctc 13613
t
相似性达98.83％。结合菌落形态特性、生理生化特征以及16s rrna基因系统发育分析，菌株r45初步鉴定为bacillus属(图4)。
41.实施例2、实验室降解实验
42.2.1协同菌群对辛酰溴苯腈的生长利用和降解
43.高效液相色谱法检测辛酰溴苯腈：取20ml样品加5ml二氯甲烷整瓶萃取，用无水硫酸钠去除有机相多余水分后取0.25ml于1.5ml离心管中，在通风处中吹干后，加入1ml甲醇复溶，经孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用hplc检测。检测条件：高效液相色谱仪为岛津rid-10a；色谱柱为c18反相柱，规格250mm
×
4.6mm；柱温30℃；流动相为100％甲醇，流速为
1.0ml/min；检测波长为221nm和229nm。
44.高效液相色谱法检测溴苯腈：取1ml样品，12000rpm离心5min，小心吸取上清，上清经孔径为0.22μm水相滤膜过滤后用hplc检测。检测条件：高效液相色谱仪为岛津rid-10a；色谱柱为c18反相柱，规格250mm
×
4.6mm；柱温30℃；流动相为乙腈:水:乙酸(50:50:0.5,v:v:v)，流速为1.0ml/min；检测波长为221nm和250nm。
45.高效液相色谱法检测dbhb：取1ml样品，12000rpm离心5min，小心吸取上清，上清经孔径为0.22μm水相滤膜过滤后用hplc检测。检测条件：高效液相色谱仪为岛津rid-10a；色谱柱为c18反相柱，规格250mm
×
4.6mm；柱温30℃；流动相为甲醇:水:乙酸(60:40:0.5,v:v:v)，流速为1.0ml/min；检测波长为221nm和250nm。
46.高效液相色谱法检测bhb：取1ml样品，12000rpm离心5min，小心吸取上清，上清经孔径为0.22μm水相滤膜过滤后用hplc检测。检测条件：高效液相色谱仪为岛津rid-10a；色谱柱为c18反相柱，规格250mm
×
4.6mm；柱温30℃；流动相为甲醇:水:乙酸(60:40:0.5,v:v:v)，流速为1.0ml/min；检测波长为221nm和250nm。
47.将菌株r45和菌株x-1按终浓度分别为0.03-0.04(od
600
值)的接种量接至含有60mg/l辛酰溴苯腈和1％lb液体培养基的20ml mm中，30℃、150rpm摇床培养，期间取1ml用于检测溶液中溴苯腈的含量，绘制溴苯腈含量变化曲线，对于剩下的mm进行整瓶破坏性取样，用等体积二氯甲烷萃取，取至90h。用高效液相色谱(hplc)检测辛酰溴苯腈的浓度，绘制其降解曲线。结果如图5所示，协同菌群可在90h完全降解60mg/l辛酰溴苯腈，并生成溴苯腈，而溴苯腈在生成后也会进一步被r45继续降解。
48.2.2种子液制备
49.分别挑取菌株r45与菌株x-1单菌落至100ml添加有0.2mm辛酰溴苯腈的lb液体培养基中，30℃，160rpm摇床培养至菌体生长对数期，6000rpm离心5min收集菌体，用灭菌的mm培养基洗涤菌体2次，再用10ml灭菌的mm培养基重悬，将两种菌液等浓度等体积混合均匀，此即为菌体种子液。
50.2.3环境因素对协同菌群降解辛酰溴苯腈的影响
51.在装有20ml mm液体培养基的50ml锥形瓶中添加0.2mm的辛酰溴苯腈并加1％lb培养液，接种种子液至初始菌体浓度为od
600
＝0.3，同时设置不加菌的对照组，然后分别置于不同温度(16℃、25℃、30℃、37℃和45℃)的摇床中，160rpm培养20h后取取20ml样品加5ml二氯甲烷整瓶萃取，用无水硫酸钠去除有机相多余水分后取0.25ml于1.5ml离心管中，在通风处中吹干后，加入1ml甲醇复溶，经孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用hplc检测，计算辛酰溴苯腈降解率。每种处理设三个重复。结果如图6所示，协同菌群对辛酰溴苯腈的最适降解温度为25-30℃。
52.在装有20ml不同nacl浓度(0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％)的mm液体培养基的50ml锥形瓶中添加0.2mm的辛酰溴苯腈并加1％lb培养液，接种种子液至初始菌体浓度为od
600
＝0.3，同时设置不加菌的对照组，然后分别置于30℃的摇床中，160rpm培养20h后取取20ml样品加5ml二氯甲烷整瓶萃取，用无水硫酸钠去除有机相多余水分后取0.25ml于1.5ml离心管中，在通风处中吹干后，加入1ml甲醇复溶，经孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用hplc检测，计算辛酰溴苯腈降解率。每种处理设三个重复。结果如图6所示，协同菌群在盐浓度为0.5％时对辛酰溴苯腈的降解效果最好。
53.在装有20ml不同辛酰溴苯腈浓度(0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.6mm和0.8mm)的mm液体培养基的50ml锥形瓶中添加0.2mm的辛酰溴苯腈并加1％lb培养液，接种种子液至初始菌体浓度为od
600
＝0.3，同时设置不加菌的对照组，然后置于温度30℃的摇床中，160rpm培养20h后取取20ml样品加5ml二氯甲烷整瓶萃取，用无水硫酸钠去除有机相多余水分后取0.25ml于1.5ml离心管中，在通风处中吹干后，加入1ml甲醇复溶，经孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用hplc检测，计算辛酰溴苯腈降解率。每种处理设三个重复。结果如图6所示，协同菌群在加辛酰溴苯腈0.4mm浓度时对辛酰溴苯腈的降解效果最好。
54.在装有20ml mm(不含mgso4)培养基的50ml锥形瓶中添加0.2mm的辛酰溴苯腈并加1％lb培养液，分别加入1mm的不同金属(al
3+
、co
2+
、cu
2+
、ca
2+
、cd
2+
、ni
2+
和fe
2+
)。接种种子液至初始菌体浓度为od
600
＝0.3，同时设置不加菌的对照组，然后置于温度30℃的摇床中，160rpm培养20h后取取20ml样品加5ml二氯甲烷整瓶萃取，用无水硫酸钠去除有机相多余水分后取0.25ml于1.5ml离心管中，在通风处中吹干后，加入1ml甲醇复溶，经孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用hplc检测，计算辛酰溴苯腈降解率。每种处理设三个重复。结果如图6所示，co
2+
和cu
2+
能强烈抑制协同菌群对辛酰溴苯腈的降解能力，fe
2+
和al
3+
对协同菌群对辛酰溴苯腈的降解由促进作用，其它金属离子影响效果不明显。
55.在装有20ml mm液体培养基的50ml锥形瓶中添加0.2mm的辛酰溴苯腈并加1％lb培养液，接种不同种子液浓度(60μl、120μl、180μl、240μl和300μl)，同时设置不加菌的对照组，然后置于温度30℃的摇床中，160rpm培养20h后取取20ml样品加5ml二氯甲烷整瓶萃取，用无水硫酸钠去除有机相多余水分后取0.25ml于1.5ml离心管中，在通风处中吹干后，加入1ml甲醇复溶，经孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用hplc检测，计算辛酰溴苯腈降解率。每种处理设三个重复。结果如图6所示，协同菌群在接菌量60μl(菌株x-1与r45等浓度且体积比为1：1)时对辛酰溴苯腈的降解效果最好。
56.在装有20ml mm液体培养基的50ml锥形瓶中加入0.2mm的辛酰溴苯腈，再分别添加1g/l的d-木糖、甘露醇、麦芽糖、半乳糖和葡萄糖和乳糖作为外加碳源，以不添加外源碳源的处理为对照组，分别接种种子液至初始菌体浓度为od
600
＝0.3，30℃，160rpm摇床培养后6h分别测定辛酰溴苯腈的降解率。每种处理设三个重复。结果如图6所示，外加碳源都会促进协同菌群对辛酰溴苯腈的降解，其中d-木糖、麦芽糖、半乳糖对促进协同菌群对辛酰溴苯腈的降解尤为显著。
57.实施例3、协同菌群降解能力与单菌株降解能力对比
58.在装有20ml mm液体培养基的50ml锥形瓶中加入25mg/l的辛酰溴苯腈和1％lb液体培养基，接种菌株x-1种子液至初始菌体浓度为od
600
＝0.3，30℃，160rpm摇床培养后，每隔一段时间对于20的mm进行整瓶破坏性取样，用等体积二氯甲烷萃取，取至70h。用高效液相色谱(hplc)检测辛酰溴苯腈的浓度，绘制其降解曲线。结果如图7所示，菌株x-1可以快速降解辛酰溴苯腈并产生溴苯腈(图7b)，48h时对辛酰溴苯腈降解率达90％左右(图7a)。
59.在装有20ml mm液体培养基的50ml锥形瓶中加入25mg/l的辛酰溴苯腈和1％lb液体培养基，接种菌株r45种子液至初始菌体浓度为od
600
＝0.3，30℃，160rpm摇床培养后，每隔10h对于20的mm进行整瓶破坏性取样，用等体积二氯甲烷萃取，取至70h。用高效液相色谱(hplc)检测辛酰溴苯腈的浓度，绘制其降解曲线。结果如图8(a)所示，菌株r45可以降解辛酰溴苯腈但是速度极其缓慢，70h时对辛酰溴苯腈降解率达90％左右。
60.在装有20ml mm液体培养基的50ml锥形瓶中加入30mg/l的溴苯腈和1％lb液体培养基，接种菌株r45种子液至初始菌体浓度为od
600
＝0.3，30℃，160rpm摇床培养后，期间取1ml溶液离心过水相滤膜，用高效液相色谱(hplc)检测溴苯腈的浓度，绘制其降解曲线。结果如图8(b)所示，菌株r45可以在45h内降解溴苯腈，降解率达99％以上。
61.综上，菌株r45可以降解辛酰溴苯腈但是速度极其缓慢(图8)，而菌株x-1可以快速降解辛酰溴苯腈并将产生的溴苯腈释放给菌株r45(图7)，有利于菌株r45对溴苯腈直接高效代谢，并产生碳源和能源供菌株x-1和r45的生长代谢，实现共赢。而菌株x-1与r45作为菌群降解时，30h不到即可降解30mg/l辛酰溴苯腈(图5)，在相同接菌量的情况下，90h即可100％降解60mg/l辛酰溴苯腈，大大提高降解效率，节约生产成本。
62.实施例4
63.将本发明的苯腈类除草剂的协同降解菌群的原种(菌株r45和菌株x-1)分别在培养皿上活化，并接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml lb培养基(lb培养基配方：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，ph 7.4)的1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种一级种子罐。一级种子罐50l，投料量40l，培养基配方为：葡萄糖8g/l，酵母膏5g/l，k2hpo
4 1g/l，nacl 5g/l，caco
3 2g/l，mgso
4 0.2g/l，大豆油0.1％(v/v)，ph值7.2-7.5；投料完毕后高压蒸汽灭菌，冷却至35℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入50l一级种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1:0.6-1.2。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入二级种子罐。二级种子罐500l，投料量400l，培养基配方和培养条件与一级种子罐一致。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐高压蒸汽灭菌，灭菌后冷却至35℃，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.9，搅拌速度为220转/分，整个工艺流程培养时间为108小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。
64.发酵完成后两个菌种的培养液出罐直接按1：1的体积比等浓度混合，混合均匀后的培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
65.实施例5、土壤降解实验
66.采取菜园土作为供试土样。将土样过2mm筛，分别取一定量的辛酰溴苯腈、溴苯腈粉剂溶于100ml甲醇中，然后浸泡硅藻土，使农药被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中农药的浓度约为10mg/kg。每一种土样各取500g，按10％的接种量接入实施例4制备的液体菌剂，于30℃恒温培养箱中培养，以接入等量无菌mm液体的土样作为对照，土壤的持水量保持在60％。培养3d后取样，hplc测定残留量。测定结果如表1。
67.表1协同菌群在土壤中对相关农药的降解
68.