1.本发明涉及生物制氢技术领域，具体为一种生物质光合产氢混合菌群的制备方法。
背景技术：
2.化石能源的日渐枯竭及其使用所带来环境污染问题迫使人们开发新的清洁可再生能源以满足未来经济和社会发展的需要。氢能因能量密度高、燃烧无污染且利用形式多样而被公认为未来主要的能源载体形式。以氢能使用为核心的“氢能经济”和“氢能社会”发展模式是人们对未来能源使用技术的憧憬。
3.生物制氢是利用微生物自身代谢释放氢气的过程，其产氢条件温和，环境友好且原料来源丰富而被认为是未来氢能生产的主要替代形式。在各类生物制氢技术比较中，光合细菌制氢不仅有较高的产氢能力，其还可以利用多种有机废弃物作为产氢原料，实现氢能生产和废弃物处理的双重目标而成为制氢技术研究的热点问题。光合细菌制氢是光合细菌在厌氧光照条件下将有机质转化为氢气的生理代谢过程，其制备和应用是光合细菌制氢技术研究从实验室向实际生产转化的基础环节。
4.hau-m1光合细菌由沼泽红假单胞菌、深红红螺菌、荚膜红细菌荚膜红细菌和类球红细菌组成。目前hau-m1光合细菌进行光发酵产氢有较大的提升空间。已有研究证实表面活性剂能够显著促进光发酵过程的氢生产，这与表面活性剂促进细菌生长有关，表面活性剂在光发酵制氢领域的应用空间较大。霍氏肠杆菌被证实能够产生鼠李糖脂类表面活性剂，将霍氏肠杆菌引入hau-m1光合细菌体系，光合细菌生长代谢的同时，能够产生表面活性剂，从而促进光发酵体系的产氢效率。现有光发酵产氢技术的产氢效率较低，光发酵产氢效果不明显，且成本较高，缺乏应用前景。
技术实现要素：
5.(一)解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种生物质光合产氢混合菌群的制备方法，解决了现有光发酵产氢技术的产氢效率较低，光发酵产氢效果不明显，且成本较高，缺乏应用前景的问题。
7.(二)技术方案
8.本发明的目的在于提供一种光合细菌菌液的制备方法，制备的光合细菌混合菌群在培养过程中会分泌鼠李糖脂类表面活性剂，能够显著提高氢气产量，且效果明显。此外，相比于外加表面活性剂，本发明在降低成本方面具有显著优点。
9.本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：
10.一种生物质光合产氢混合菌群的制备方法，包括以下制备步骤：
11.s1、制备细菌生长培养基：包括以下组分及其密度：氯化铵(1g
·
l-1
)、碳酸氢钠(2g
·
l-1
)、酵母膏(1g
·
l-1
)、磷酸氢二钾(0.2g
·
l-1
)、乙酸钠(4g
·
l-1
)、硫酸镁(0.2g
·
l
‑1)和氯化钠(2g
·
l-1
)；
12.s2、扩增菌液：新型光合细菌以hau-m1光合细菌与霍氏肠杆菌为共培养产氢菌，在厌氧密封培养容器中加入生长培养基与共培养产氢菌，置于适宜条件下进行培养扩增；
13.s3、产氢实验：采用批次实验，称取适量底物于150ml的锥形瓶中，分别加入适量酶、ph为4.8的柠檬酸钠缓冲液以及产氢培养基，调整光发酵生物制氢体系ph为中性后，加入培养至对数期的新型光合细菌，创造厌氧环境，在30℃、3000lux的恒温培养箱中进行产氢实验；每隔12h进行取样。
14.具体的，所述新型光合细菌菌落由沼泽红假单胞菌、深红红螺菌、荚膜红细菌荚膜红细菌、类球红细菌和霍氏肠杆菌组成。
15.进一步地，所述新型光合细菌的制氢效果通过改变添加霍氏肠杆菌的体积分数(2％，4％，6％，8％，10％)进行探究。
16.进一步地，所述光发酵生物制氢体系在光发酵生物制氢过程中采用同步糖化发酵方式，在30℃、3000lx的光照厌氧培养条件下进行。
17.(三)有益效果
18.与现有技术相比，本发明提供了一种生物质光合产氢混合菌群的制备方法，具备以下有益效果：
19.本发明在hau-m1光合细菌菌群中引入霍氏肠杆菌，制备的光合细菌混合菌群在培养过程中会分泌鼠李糖脂类表面活性剂，有效增加了光发酵生物制氢体系的产氢量，且效果明显；添加霍氏肠杆菌为6％时，光发酵累计产氢量达到峰值，且远远大于未添加组；此外，本发明的新型光合细菌具有成本低，效率高，环境友好且适应性强等优点，在光发酵生物制氢领域有广泛的应用前景。
附图说明
20.图1为本发明不同体积分数下霍氏肠杆菌下新型光合细菌光发酵制氢过程中细菌生长浓度的变化示意图；
21.图2为本发明不同体积分数下霍氏肠杆菌下新型光合细菌光发酵制氢过程中累计产氢量和产氢速率的变化示意图；
22.图3为本发明不同体积分数下霍氏肠杆菌下新型光合细菌光发酵制氢过程中还原糖的变化示意图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例
25.如图1-3所示，本发明一个实施例提出的生物质光合产氢混合菌群的制备方法，包括以下制备步骤：
26.s1、制备细菌生长培养基：包括以下组分及其密度：氯化铵(1g
·
l-1
)、碳酸氢钠
(2g
·
l-1
)、酵母膏(1g
·
l-1
)、磷酸氢二钾(0.2g
·
l-1
)、乙酸钠(4g
·
l-1
)、硫酸镁(0.2g
·
l-1
)和氯化钠(2g
·
l-1
)；
27.s2、扩增菌液：新型光合细菌以hau-m1光合细菌与霍氏肠杆菌为共培养产氢菌，在厌氧密封培养容器中加入生长培养基与共培养产氢菌，置于适宜条件下进行培养扩增；
28.s3、产氢实验：采用批次实验，称取适量底物于150ml的锥形瓶中，分别加入适量酶、ph为4.8的柠檬酸钠缓冲液以及产氢培养基，调整光发酵生物制氢体系ph为中性后，加入培养至对数期的新型光合细菌，创造厌氧环境，在30℃、3000lux的恒温培养箱中进行产氢实验；每隔12h进行取样。
29.具体的，本发明的新型光合细菌由hau-m1细菌和霍氏肠杆菌组成，其中，hau-m1光合细菌由28％的沼泽红假单胞菌、27％的深红红螺菌、25％的荚膜红细菌和、11％的荚膜红细菌和9％的类球红细菌等5种光合细菌组成。通过改变霍氏肠杆菌的体积分数，探究新型光合细菌的制氢效果。
30.细菌生长浓度测定：150ml的锥形瓶经高压灭菌后，加入产氢培养基105ml，以hcl溶液和naoh溶液调节ph值为7后，接种45ml的共培养产氢菌，摇匀，胶塞密封；胶塞设有液体取样口；如此构建若干反应系统，置于30℃、3000lux恒温培养箱中，对照组所用细菌为单纯hau-m1光合细菌，每12小时取样一次，测量波长660处的吸光度，即od660。实验结果取3次平行实验结果的平均值。
31.细菌干重可以直接反映光合细菌的生长状况，计算公式为:
32.y＝0.5158x+0.0998
33.其中，y为光合细菌干重，g/l；x为产氢料液的od660值；r2＝0.919
34.通过一系列的测量，光发酵生物制氢过程中菌体干重的变化情况如图1所示。由此可以看出，新型光合细菌对制氢有促进作用，研究其促进机理十分重要。光发酵制氢过程持续108h，细菌经历了三个生长阶段：适应期、对数期和稳定期。在制氢过程中，细菌干重是能够反映细菌生长的重要指标。在0-12h时，细菌对发酵环境适应，生物量增加，此时产氢率较低。在12-36h时，细菌以对数形式快速繁殖，数量和活性均达到最佳状态。产氢速度快，产气速率在36h达到峰值。36h后，由于发酵环境的限制，细菌进入稳定阶段，数量达到动态平衡。产氢速率逐渐降低。在整个制氢过程中，需要注意的是，添加不同量霍氏肠杆菌对细菌的生长和制氢代谢活性有不同程度的刺激，且效果明显优于对照组，其中霍氏肠杆菌的最佳添加量为6％。
35.生物制氢实验：在每个150ml锥形瓶中依次加入5g玉米芯(60目)、100ml缓冲液、15fpu/g纤维素酶、产氢培养基和45ml新型光合细菌。加入接种细菌前，将混合液的初始ph调整为中性。实验变量为接种细菌中霍氏肠杆菌的体积分数(2％，4％，6％，8％，10％)。对照组所用细菌为单纯hau-m1光合细菌。所有的锥形烧瓶用橡胶塞密封，置于30℃、3000lux的恒温培养箱中发酵。产生的气体用集气袋收集，每12h检测一次，每次实验重复3次。采用气体集气袋收集氢气，气体体积利用校准过的注射器测量。采用二硝基水杨酸法测定还原糖浓度。
36.通过一系列的测量，光发酵生物制氢过程中累计产氢量及还原糖的变化情况如图2和图3所示。由此可以看出，新型光合细菌对光发酵生物制氢性能有较大影响。随着新型光合细菌中霍氏肠杆菌的增加，产氢量和产氢速率呈现先增加后降低的趋势。结果表明，适当
浓度的霍氏肠杆菌的增加对产氢能力有很大的促进作用，而过高或过低的添加浓度对产氢能力有负面影响。综合考虑得出最佳的霍氏肠杆菌添加量为6％。最佳添加条件下，霍氏肠杆菌可大大提高产氢速率。添加量为6％时，前60h的产氢量约为总产氢量的80％～90％。随着霍氏肠杆菌的增加，初始还原糖浓度先增加后降低。整个光发酵产氢过程中，还原糖浓度逐渐降低。在0-24h内，还原糖浓度显著降低，这是因为光合细菌的生长和产氢消耗了大部分还原糖。在60h后，还原糖浓度缓慢下降，这可能是由于副产物挥发性脂肪酸取代了一定浓度的还原糖产生氢气。同时，一些抑制剂抑制了产氢代谢。
37.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。