一种家蚕shrna表达载体构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及昆虫基因技术领域，具体为一种家蚕shrna表达载体构建方法及应用。
背景技术：
2.rna干扰(rna interference，缩写为rnai)是一种由双链rna诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达，当细胞中导入与内源性mrna编码区同源的双链rna时，该mrna发生降解而导致基因表达沉默。
3.rnai技术目前已广泛应用于动植物的基因功能研究中，结合基因组测序技术的大量数据，可以快速高效的进行特异性的基因功能分析，通过外源合成dsrna或shrna转入细胞，利用细胞内的rnaase将其切割成sirna而发挥调控降解靶基因的作用，与直接合成sirna相比，dsrna更稳定，发挥作用的时间更长，也可进一步筛选构建稳转细胞系。
4.家蚕是鳞翅目的模式物种，有独特的性别决定方式及细胞周期调控方式。家蚕中大约有15000个基因，其中大部分功能未知，利用家蚕细胞系进行基因功能验证时普遍存在转染效率低，敲减效率低等诸多问题，限制了家蚕基因功能研究的进展，通过将线虫的dsrna跨膜通道蛋白sid转入家蚕细胞可以大大提高敲减效率，但是依然存在实验操作复杂、干扰效果是瞬时等弊端。
技术实现要素：
5.(一)解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种家蚕shrna表达载体构建方法及应用，通过将昆虫表达载体pizt/v5-his中的opie2启动子重组替换为bmu6启动子，可以实现快速高效的shrna克隆表达，具有低成本、高效率的特点。
7.(二)技术方案
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种家蚕shrna表达载体构建方法，采用家蚕rna聚合酶u6启动子，并对该启动子的两端分别引入gtatcttatcatgtctggat和ggtaccaagctttaaattcg重组位点，通过pcr扩增将pizt/v5-his载体线性化后重组置换载体上的opie2启动子。
9.优选的，仅需体外合成一对互补的单长链dna，两端选择kpni和ecori作为酶切位点，通过高温孵育3分钟后退火形成含有黏性末端的长双链dna片段，将kpni和ecori双酶切后的载体和双链dna通过t4 dna连接酶连接，克隆转化大肠杆菌后菌p验证，挑选正确的克隆进行测序验证。
10.优选的，体外合成两条单链dna，通过稀释片段后体外退火形成具有黏性末端的长双链dna片段。
11.优选的，退火形成长链dna片段末端为黏性末端，突出的末端为4个碱基，分别为gtac和ttaa。
12.优选的，体外合成的单长链由21nt的发夹结构和6nt的茎环结构组成，6nt的茎环
结构由ctcgag序列组成。
13.优选的，退火后形成的dna片段能够和权力要求书1中构建的载体双酶切之后的黏性末端进行连接。
14.为配合上述家蚕shrna表达载体构建方法，现提供以下实验步骤：s1、运用ce designv1.04软件设计基因特异性重组引物，该引物末端含有gtatcttatcatgtctggat和ggtaccaagctttaaattcg重组位点；
15.s2、克隆bmu6启动子的具体方法为：以家蚕卵巢组织基因组dna为模板，通过pcr技术扩增家蚕bmu6启动子，反应条件：95℃预变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s(循环30次)；72℃延伸10min，反应体系：2x mix：10μl；引物-f：1μl；引物-r：1μl；dna模板：1μl；ddh2o：补齐至20μl。将pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收纯化；
16.s3、pizt/v5-his载体线性化的具体方法为：以pizt/v5-his载体为模板，通过pcr技术扩增将其线性化，正向引物pizt-v5-f(cgaatttaaagcttggtaccgag)，反向引物pizt-v5-r(atccagacatgataagatacattgatga)，反应条件：95℃预变性5min；95℃1min30s，58℃2min，72℃2min(循环30次)；72℃延伸10min，反应体系：2x mix：10μl；引物-f：1μl；引物-r：1μl；dna模板：1μl；ddh2o：补齐至20μl，将pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收纯化；
17.s4、pizt/v5-his-bmu6载体重组的具体方法为：将s2和s3回收的片段计算浓度后按照载体：目的片段＝67:20的比例计算重组反应体系，反应条件：37℃重组40min，反应体系：5x buffer：2μl；重组酶：0.5μl；pizt/v5-his线性化载体：3.5μl；bmu6目的片段：4μl；
18.s5、pizt/v5-his-bmu6载体验证的具体方法为：将s4的重组体系转化100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞，反应条件：冰浴30min；42℃水浴热激90s，立即冰浴5min，加入800μl lb无抗液体培养基，37℃孵育1h；适当体积的转化细胞均匀涂在含有相应博来霉素的lb固体平板培养基上，37℃倒置培养18h后挑选单菌落进行菌落pcr验证，阳性克隆测序验证；
19.s6、目的基因shrna载体构建的具体方法为：通过在线软件设计目的基因的shrna靶点信息，体外合成针对靶点序列的由21nt的发夹结构和6nt环形结构组成的单长链，6nt的茎环结构由ctcgag序列组成，通过合成正义链和反义链，合成的正义链和反义链通过体外加热变性后自然冷却降温复性形成双链结构，反应体系：正义链(1μl)；反义链(1μl)；退火buffer(8μl)；水(10μl)。反应结束后加入80μl水，将退火产物稀释5倍，反应条件：水浴锅升温至100℃后将反应体系保温3min，关闭水浴锅，自然冷却降温，约3h，降温至30℃左右即完成退火；
20.s7、退火形成的长双链dna片段末端为黏性末端，突出的末端为为4个碱基，分别为gtac和ttaa，退火形成的长双链dna和通过kpni和ecori双酶切的pizt/v5-his-bmu6载体连接形成目的基因的shrna干扰载体，酶切体系：kpni和ecori各1μl，10x buffer：2μl，pizt/v5-his-bmu6载体模板1μl，ddh2o：补齐至20μl，37℃孵育20min。连接体系：t4 dna ligase：0.5μl；t4 dna buffer：1μl；kpni和ecori双酶切的pizt/v5-his-bmu6载体：1.5μl；退火稀释片段：1μl；ddh2o：补齐至10μl，22℃连接1h；
21.s8、目的基因shrna载体验证的具体方法为：将s7的连接体系转化100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞，反应条件：冰浴30min；42℃水浴热激90s，立即冰浴5min，加入800μl lb无抗液体培养基，37℃孵育1h；适当体积的转化细胞均匀涂在含有相应博来霉素的lb固体平板培养基上，37℃倒置培养18h后挑选单菌落进行菌落pcr验证，阳性克隆测序验证。
22.(三)有益效果
23.与现有技术相比，本发明提供了一种家蚕shrna表达载体构建方法，具备以下有益效果：
24.1、该家蚕shrna表达载体构建方法，通过通过重组法将骨架载体pizt/v5-his中的启动子opie2重组替换为家蚕中的u6启动子bmu6，不受酶切位点的限制，而且重组效率很高。
附图说明
25.图1为本发明载体pizt/v5-his-bmu6构建过程示意图；
26.图2为本发明中载体构建琼脂糖凝胶电泳图；
27.图3为利用本发明载体对目的基因进行细胞转染效果图；
28.图4为利用本发明载体对目的基因抑制效率的qrt-pcr检测结果；
29.图5为利用本发明载体对目的基因抑制h3thr3ph检测结果；
30.图6为利用本发明载体对目的基因抑制细胞周期检测结果。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.请参阅图1-4，本发明提供了一种家蚕shrna表达载体构建方法，采用家蚕rna聚合酶u6启动子，并对该启动子的两端分别引入gtatcttatcatgtctggat和ggtaccaagctttaaattcg重组位点，通过pcr扩增将pizt/v5-his载体线性化后重组置换载体上的opie2启动子，需体外合成一对互补的单长链dna，两端选择kpni和ecori作为酶切位点，通过高温孵育3分钟后退火形成含有黏性末端的长双链dna片段，将kpni和ecori双酶切后的载体和双链dna通过t4 dna连接酶连接，克隆转化大肠杆菌后菌p验证，挑选正确的克隆进行测序验证，体外合成两条单链dna，通过稀释片段后体外退火形成具有黏性末端的长双链dna片段，退火形成长链dna片段末端为黏性末端，突出的末端为4个碱基，分别为gtac和ttaa，体外合成的单长链由21nt的发夹结构和6nt的茎环结构组成，6nt的茎环结构由ctcgag序列组成，退火后形成的dna片段能够和权力要求书1中构建的载体双酶切之后的黏性末端进行连接。
33.一种家蚕shrna表达载体构建方法，包括以下步骤：s1、运用ce designv1.04软件设计基因特异性重组引物，该引物末端含有gtatcttatcatgtctggat和ggtaccaagctttaaattcg重组位点；
34.s2、克隆bmu6启动子的具体方法为：以家蚕卵巢组织基因组dna为模板，通过pcr技术扩增家蚕bmu6启动子，反应条件：95℃预变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s(循环30次)；72℃延伸10min。反应体系：2x mix：10μl；引物-f：1μl；引物-r：1μl；dna模板：1μl；ddh2o：补齐至20μl。将pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收纯化；
35.s3、pizt/v5-his载体线性化的具体方法为：以pizt/v5-his载体为模板，通过pcr
技术扩增将其线性化，正向引物pizt-v5-f(cgaatttaaagcttggtaccgag)，反向引物pizt-v5-r(atccagacatgataagatacattgatga)，反应条件：95℃预变性5min；95℃1min30s，58℃2min，72℃2min(循环30次)；72℃延伸10min，反应体系：2x mix：10μl；引物-f：1μl；引物-r：1μl；dna模板：1μl；ddh2o：补齐至20μl，将pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收纯化；
36.s4、pizt/v5-his-bmu6载体重组的具体方法为：将s2和s3回收的片段计算浓度后按照载体：目的片段＝67:20的比例计算重组反应体系。反应条件：37℃重组40min，反应体系：5x buffer：2μl；重组酶：0.5μl；pizt/v5-his线性化载体：3.5μl；bmu6目的片段：4μl；
37.s5、pizt/v5-his-bmu6载体验证的具体方法为：将s4的重组体系转化100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞，反应条件：冰浴30min；42℃水浴热激90s，立即冰浴5min，加入800μl lb无抗液体培养基，37℃孵育1h；适当体积的转化细胞均匀涂在含有相应博来霉素的lb固体平板培养基上，37℃倒置培养18h后挑选单菌落进行菌落pcr验证，阳性克隆测序验证；
38.s6、目的基因shrna载体构建的具体方法为：通过在线软件设计目的基因的shrna靶点信息，体外合成针对靶点序列的由21nt的发夹结构和6nt环形结构组成的单长链，6nt的茎环结构由ctcgag序列组成。通过合成正义链和反义链，合成的正义链和反义链通过体外加热变性后自然冷却降温复性形成双链结构，反应体系：正义链(1μl)；反义链(1μl)；退火buffer(8μl)；水(10μl)，反应结束后加入80μl水，将退火产物稀释5倍，反应条件：水浴锅升温至100℃后将反应体系保温3min，关闭水浴锅，自然冷却降温，约3h，降温至30℃左右即完成退火；
39.s7、退火形成的长双链dna片段末端为黏性末端，突出的末端为为4个碱基，分别为gtac和ttaa，退火形成的长双链dna和通过kpni和ecori双酶切的pizt/v5-his-bmu6载体连接形成目的基因的shrna干扰载体，酶切体系：kpni和ecori各1μl，10x buffer：2μl，pizt/v5-his-bmu6载体模板1μl，ddh2o：补齐至20μl，37℃孵育20min，连接体系：t4 dna ligase：0.5μl；t4 dna buffer：1μl；kpni和ecori双酶切的pizt/v5-his-bmu6载体：1.5μl；退火稀释片段：1μl；ddh2o：补齐至10μl，22℃连接1h；
40.s8、目的基因shrna载体验证的具体方法为：将s7的连接体系转化100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞，反应条件：冰浴30min；42℃水浴热激90s，立即冰浴5min，加入800μl lb无抗液体培养基，37℃孵育1h；适当体积的转化细胞均匀涂在含有相应博来霉素的lb固体平板培养基上，37℃倒置培养18h后挑选单菌落进行菌落pcr验证，阳性克隆测序验证。
41.pizt/v5-his-bmu6载体构建
42.以pizt/v5-his为出发载体，构建本发明的pizt/v5-his-bmu6载体，具体构建方法包括以下步骤：用家蚕bmu6启动子代替pizt/v5-his载体上的opie2启动子，具体方法为：采用家蚕卵巢组织基因组dna为模板，pcr扩增家蚕bmu6启动子(正向引物为bmu6-f：gtatcttatcatgtctggataggttatgtagtacacattgttgtaaatca下划线为重组位点；反向引物bmu6-r：ggtaccaagctttaaattcgacttgtagagcacgatattttgtatatatacc下划线为重组位点)，pcr反应结束后进行2％浓度的琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增条带长度为467bp(图2a)，与预期条带大小一致，利用pizt/v5-his为模板，pcr扩增使载体线性化(正向引物pizt-v5-f：cgaatttaaagcttggtaccgag；反向引物pizt-v5-r：atccagacatgat aagatacattgatga)，pcr反应结束后进行1％浓度的琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增条带长度为3336bp(图2b)，与预期条带大小一致，pcr产物纯化回收后进行重组反应，对重组反应产物进行转化和鉴定测
序，最后得到pizt/v5-his-bmu6载体(载体图谱如图1所示，bmu6启动子序列见序列列表1)。
43.利用本发明的pizt/v5-his-bmu6载体抑制家蚕细胞中haspin基因(基因号：xm_012694372.1)的表达，具体构建方法包括以下步骤：
44.(1)抑制haspin基因表达的shrna干扰序列设计
45.将家蚕的haspin基因序列(见序列列表2)，输入shrna在线设计软件(http://sirecords.umn.edu/sirecords/)，得到8个匹配的长度为21bp的rna干扰序列，结合已经验证的人haspin基因shrna序列，设计针对家蚕haspin基因的三条小干扰rna，序列如下：bomb-haspin-shrna-1:gcaatcaaacggatgctatac；
46.bomb-haspin-shrna-2:gctttggatctacatgctata；
47.bomb-haspin-shrna-3:gcaatgattggaagaactttg
48.根据shrna设计方案，分别添加kpni黏末端、21bp链、6bp茎环序列、21bp反向互补链、转录终止区tttt和ecori黏末端，三条序列对应的正义链和反义链序列如下：
49.bmu6-bmh-shrna1-fgtaccgtaattaaatggatgttatatctcgaggtatagcatccgtttgattgcttttttbmu6-bmh-shrna1-raattaaaaaagcaatcaaacggatgctatacctcgagatataacatccatttaattacgbmu6-bmh-shrna2-fgtaccgttttggatttatatgttatactcgagtatagcatgtagatccaaagcttttttbmu6-bmh-shrna2-raattaaaaaagctttggatctacatgctatactcgagtataacatataaatccaaaacgbmu6-bmh-shrna3-fgtaccgtaatgattggaagaactttgctcgagcaaagttcttccaatcattgcttttttbmu6-bmh-shrna3-raattaaaaaagcaatgattggaagaactttgctcgagcaaagttcttccaatcattacg
50.合成的序列分别用无dna/rna酶的无菌水溶解为10μm/μl
51.(2)抑制家蚕haspin基因表达的shrna干扰载体构建
52.将步骤(1)合成的每对正义链和反义链分别退火形成双链dna。20μl的反应体系：正义链(1μl)；反义链(1μl)；退火buffer(8μl)；水(10μl)，反应条件：水浴锅升温至100℃后将反应体系保温3min，关闭水浴锅，自然冷却降温，约3h，降温至30℃左右即完成退火，反应结束后加入80μl水，将退火产物稀释5倍备用。
53.将pizt/v5-his-bmu6载体进行kpni和ecori双酶切后与退火稀释的双链dna进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞后，在博来霉素抗性的平板上筛选，菌落pcr验证阳性克隆，并测序验证，验证正确的克隆命名为pizt/v5-bmu6-bmh-shrna1/2/3。
54.(3)pizt/v5-bmu6-bmh-shrna1/2/3干扰载体转染家蚕bmn细胞
55.将步骤(2)构建的pizt/v5-bmu6-bmh-shrna1/2/3载体用fugene(promega)转染家蚕bmn细胞，转染方法按照fugene说明书操作，48h后荧光显微镜下观察转染效率(图3)。
56.(4)家蚕haspin基因表达水平鉴定
57.转染48h后分别收集细胞，提取总rna，进行定量pcr验证，定量pcr的引物为bmhaspin-rt-f：ggcgaaggtgtgtacggggaagt；bmhaspin-rt-r：agcgtcagtat cattcccttcgtcaa，内参引物为bma3-f：atgtgcgacgaagaagttgc；bma3-r：gtctcctacgtacgagtcct。
58.(5)敲减细胞系中的h3thr3ph表达分析
59.选择敲减效率最高的pizt/v5-bmu6-bmh-shrna1进行下一步的细胞学验证。已知haspin基因可以催化组蛋白h3thr3位点的磷酸化修饰，h3thr3ph被survivin亚基上的bir结构域识别从而将染色体乘客复合体定位在中期着丝粒处调控有丝分裂周期的顺利进行，
我们检测了转染pizt/v5-bmu6-bmh-shrna1质粒的bmn细胞系中h3thr3ph的改变(图5)。具体方法为：转染48h的bmn细胞用4％多聚甲醛室温固定15min，1
×
pbs漂洗3次，0.25％的triton x-100透化10min，1
×
pbs漂洗3次，3％牛血清蛋白(bsa)室温封闭1h，1
×
pbs漂洗3次，组蛋白h3thr3磷酸化的抗体(1:500稀释,v/v)4℃孵育过夜，alexa fluorr 594标记的羊抗兔igg(goat anti-rabbit igg,jackson immunoresearch)(1:2 000,v/v)37℃孵育2h。最后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,0.01mg/ml+90％甘油)封片固定，zeiss激光共聚焦显微镜观察荧光信号。
60.(6)敲减细胞系细胞周期表型变化分析
61.为了进一步探究haspin基因敲减改变h3thr3ph表达对细胞周期的影响，我们通过细胞爬片结合免疫荧光，看到转染pizt/v5-bmu6-bmh-shrna1质粒48h出现较多异常状态的细胞如图6。
62.bmu6 dna序列信息：
63.》bmu6-2
64.aggttatgtagtacacattgttgtaaatcactgaattgttttagatgattttaacaattagtacttattaatattaaataagtacataccttgagaatttaaaaatcgtcaactataagccatacgaatttaagcttggtacttggcttatagataaggacagaataagaattgttaacgtgtaagacaaggtcagatagtcatagtgattttgtcaaagtaataacagatggcgctgtacaaaccataactgttttcatttgtttttatggattttattacaaattctaaaggttttattgttattatttaatttcgttttaattatattatatatctttaatagaatatgttaagagtttttgctctttttgaataatctttgtaaagtcgagtgttgttgtaaatcacgctttcaatagtttagtttttttaggtatatatacaaaatatcgtgctctacaagt
65.家蚕haspin基因序列信息：
66.bombyx mori putative serine/threonine-protein kinase haspin homolog(loc101745149),mrna。xm_012694372.1
67.atgcatcttaccctgcaatacacaggatttttgagcgacgattgtgatgatacgattgtcgggttatcaaaactctcgctcgatgatgtggaaccggagatcaccgttctaggtatacatgatacttcgaatcgtgttgctacagctcgagattacgtgttacgtcgatgcaatcaaacggatgctatactatttgatgaatgctatccagacgcacttttgaaaaactgtcacaagattggcgaaggtgtgtacggggaagtatttctttggcgtgctcgagatggcagagctcgagtaatgaaaatagttccaattgctggtcataccaaggtcaatggagaagaccaaaaggactatcacgagattatctcggaaattgtgattgctatggaattgagcgccctgcgcgctcccatagccgatatcgaacgacattttgacgaagggaatgatactgacgctttggatctacatgctataggcaatgcaacggatgtttttaatcaggttctagcagtaaggtgtgtgtacggcagctacccatcacgtttgctagatctctgggacttgtacgacgaatgtaaaggttccgagaacgacaatccggccatcttgcccgtcgatcaacaatacatcgtactagagctggccaacgccggacaagatttggagagctaccagttcaacaacgctgaacaagcacacgcgctgttcctccaggtggcattcggtctggccgtgggcgaggaggcctaccagttcgagcatcgcgatctgcactggggaaacgttctcatcgcgcccaccgaacaaaagtttgccacgttcgtgctccgcgggcggcggcactgcacgccccgctgcggcgtcgcggccaccatcatcgactactcgctgtcgcgcgtgtcgctgccggcgagcgcgcccgcacgctgcgccgcgctctacaacgacctggcggacgacgacggactcttcgacgccgtcggagactatcagtttgaggtctaccgcctcatgaaaagcaagttgggcaatgattggaagaactttgaaccatatacaaacatactgtggctacattacactgttgataaaatgataacggccctacgctacaaaagaaccaatacaaagatacacaagcattacatagacaaattgaagggcatcaagaatagaattctcgattacaagagtgcaac
cgattttgttttaacggacaacgaatattaa。
68.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。