一种基于rpa等温扩增技术鉴别非洲猪瘟病毒的方法及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种基于rpa等温扩增技术鉴别非洲猪瘟病毒的方法及试剂盒，属于疾病检测领域。
背景技术：
2.非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（asfv)引起的急性、烈性、高度接触性动物传染病,感染猪的死亡率最高可达100％。从全球的角度看，非洲猪瘟的传播已遍及俄罗斯联邦和东欧的许多国家，仅在2019年1月至2019年9月期间，世界动物卫生组织报告有13个欧洲国家，10个亚洲国家，3个非洲国家共计26个国家和地区发生非洲猪瘟疫情。2018-2019年期间据估计有超过3000万头猪被扑杀，给全球养猪业造成了超过20亿美元的经济损失。更为严重的是，根据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲猪瘟专业实验室在开展非洲猪瘟流行病学监测及病原学研究结果，发现我国部分省区已经出现了低致死率的非洲猪瘟基因ⅱ型自然变异流行株，而且这些变异株的临床表现具有一定的隐蔽性，直接导致了非洲猪瘟早期诊断的难度加大，给我国非洲猪瘟防控带来全新的挑战。
3.非洲猪瘟病毒与其他核质大dna病毒（ncldv）具有相同的结构，具有多层结构和整体二十面体形态，是唯一已知的dna虫媒病毒。非洲猪瘟主要有三种传播模式：一是非洲疣猪和软蜱之间的森林循环传播模式，这一传播模式存在于南部和东部非洲；二是软蜱和家猪之间的传播循环。这一传播模式常见于有软蜱存在的地区；三是猪和猪之间的传播循环，包括欧亚野猪和家猪。研究表明，我国目前主要为猪和猪之间的传播循环模式。
4.非洲猪瘟病毒能够耐受低温环境，4℃可以存活1年，在冷冻猪肉中可以存活数年之久。但是，非洲猪瘟病毒对高温比较敏感，25-37℃可以存活数周，56℃大约可以存活70分钟，而60℃则仅可存活20分钟。乙醚、氯仿、2%氢氧化钠、3%次氯酸钠和0.3%福尔马林等多种消毒剂均可有效杀灭非洲猪瘟病毒。由于目前尚无有效治疗非洲猪瘟的药物和商业化疫苗，因此，加强非洲猪瘟病毒检测技术研究对于生猪养殖业的恢复生产有重要意义。
5.cn202111034821.3具体公开了一种鉴别非洲猪瘟病毒的流行株和基因缺失株的引物探针组、试剂盒及其使用方法和应用。引物探针组包括p72基因检测用上游引物a、下游引物a和检测探针a，mgf基因检测用上游引物b、下游引物b和检测探针b，cd2v基因检测用上游引物c、下游引物c和检测探针c，猪gapdh基因内标检测用上游引物d、下游引物d和检测探针d；试剂盒包括上述引物探针组。本技术的试剂盒用于非洲猪瘟野毒株、疫苗株、流行株、cd2v基因缺失株、mgf基因缺失株以及cd2v基因和mgf基因缺失株感染的鉴别诊断，其具有最低检测限低和灵敏度高、可鉴别诊断非洲猪瘟病毒野毒株及疫苗缺失株的优点。但该探针引物组仅适用于cd2v基因和mgf基因缺失株，缺少普适性。
技术实现要素：
6.本发明旨在通过rpa等温扩增技术建立一种快速、准确鉴别非洲猪瘟病毒的方法，
本发明采用重组酶聚合酶等温扩增（rpa）快速增加非洲猪瘟病毒dna的拷贝数，利用酶标仪或侧流层析试纸条(lfd)检测阳性反应结果，从而建立一种现场、快速、准确鉴别非洲猪瘟病毒核酸的检测技术，该方法具有灵敏性高、特异性强和重复性稳定等优点，可以为非洲猪瘟的早期诊断和建立有效的综合防控体系提供检测平台。
7.本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：一种基于rpa等温扩增技术鉴别非洲猪瘟病毒的方法，其包括下述步骤：1）非洲猪瘟病毒dna阳性质粒标准品的构建：选择非洲猪瘟病毒asfv-sy18毒株的p72 基因的核苷酸序列作为目的基因，将目的基因克隆于t载体上，经测序验证质粒准确无误后转化大肠杆菌，提取重组质粒后测定其浓度,作为重组酶聚合酶扩增模板的标准品；2）重组酶聚合酶扩增反应：按照如下组分配比配制重组酶聚合酶扩增反应体系：浓度为10μmol/l的正向引物2.1μl,浓度为10μmol/l的反向引物2.1μl，浓度为10μmol/l的荧光分子探针0.6μl，无引物再水合缓冲液29.5μl，模板标准品10μl，分子级双蒸水3.2μl和浓度为280mmol/l的醋酸镁2.5μl，总体积50μl；轻微震荡使所有反应试剂充分混合后,短暂离心，加入重组酶聚合酶扩增模板在37-40℃条件下扩增30分钟。
8.如上基于rpa等温扩增技术鉴别非洲猪瘟病毒的方法，所述步骤2中的引物对和探针组合为如下引物对之一：引物对与探针组合1：正向引物为seq.no:1所示，所述的反向引物为seq.no:2所示，所述的荧光分子探针为probe-1所示；引物对与探针组合2：正向引物为seq.no:3所示，所述的反向引物为seq.no:4所示，所述的荧光分子探针为probe-2所示；引物对与探针组合3：正向引物为seq.no:5所示，所述的反向引物为seq.no:6所示，所述的荧光分子探针为probe-3所示。
9.优选地，所述的所述步骤2中的引物对和探针组合为引物对与探针组合1：正向引物为seq.no:1所示，所述的反向引物为seq.no:2所示，所述的荧光分子探针为probe-1所示。
10.一种基于rpa等温扩增技术鉴别非洲猪瘟病毒的试剂盒，其包括：浓度为10μmol/l的正向引物2.1μl,浓度为10μmol/l的反向引物2.1μl，浓度为10μmol/l的荧光分子探针0.6μl，无引物再水合缓冲液29.5μl，分子级双蒸水3.2μl和浓度为280mmol/l的醋酸镁2.5μl，总体积50μl。
11.优选地，所述的正向引物、反向引物以及荧光分子探针为引物对与探针组合1：正向引物为seq.no:1所示，所述的反向引物为seq.no:2所示，所述的荧光分子探针为probe-1所示。
12.如上所述的基于rpa等温扩增技术鉴别非洲猪瘟病毒的试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：将试剂盒中试剂混合，轻微震荡使反应试剂充分混合后,短暂离心，加入处理后的样本在37-40℃条件下扩增30分钟，利用酶标仪或侧流层析试纸条(lfd)检测阳性反应结果。
13.将拷贝数为8.9
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copy/μl非洲猪瘟病毒p72(b646l)基因质粒标准品按照1：10的比例倍比稀释，逐渐稀释到8.9
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100copy/μl，分别检测不同浓度质粒标准品以确定该检
测方法的灵敏性；同时分别以pcv,prv,ppv,csfv和jev等常见的猪病毒核酸样本为对照，以确定该检测方法的特异性。
14.本发明与现有技术相比具有如下技术优势：1）该方法具有较低的检测限度，且检测特异性高，本发明实施例表明，其对于8.9
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100copy/μl的质粒阳性标准品仍可以检出，且对于其他病毒无阳性反应，检测特异性高。
15.2）该方法适合在条件较低的环境下进行检测，且检测迅速，检测结果直观。本发明利用酶标仪或侧流层析试纸条(lfd)检测阳性反应结果建立了一种现场、快速、准确鉴别非洲猪瘟病毒核酸的检测技术。
附图说明
16.图1重组酶聚合酶扩增反应的荧光分子探针。
17.图2不同引物和探针的组合下对质粒标准品的酶标检测结果。
18.图3使用侧流层析试纸条检测引物和探针组合1的最低检测限检测结果图4引物和探针组合1的检测特异性结果
具体实施方式
19.以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
20.实施例1基于rpa等温扩增技术鉴别非洲猪瘟病毒的方法1．非洲猪瘟病毒dna阳性质粒标准品的构建将非洲猪瘟病毒asfv-sy18毒株的p72 (b646l) 基因的核苷酸序列委托上海华津生物科技有限公司合成长度为1941 bp的基因片段，将目的基因克隆于t载体上，经测序验证质粒准确无误后转化大肠杆菌，提取重组质粒后测定浓度为265.8 ng/μl,作为重组酶聚合酶扩增（rpa）模板的标准品（换算成拷贝数为8.9
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10 copy/μl）。
21.2．重组酶聚合酶扩增（rpa）反应体系和反应条件的优化重组酶聚合酶扩增（rpa）反应的体系分别添加以下试剂：浓度为10 μmol/l的正向引物2.1 μl,浓度为10 μmol/l的反向引物2.1μl，浓度为10 μmol/l的荧光分子探针0.6 μl，无引物再水合缓冲液29.5 μl，模板标准品10 μl，分子级双蒸水3.2 μl和浓度为280 mmol/l的醋酸镁2.5 μl，总体积50 μl。轻微震荡使所有反应试剂充分混合后,短暂离心。在37-40 ℃条件下扩增30分钟，分别通过酶标仪检测荧光信号和侧流层析试纸检测确定扩增效果。
22.使用primer 5软件设计了3套重组酶聚合酶扩增（rpa）的反应的特异性扩增引物和相应的分子探针。
23.引物对1：正向引物为seq.no:1所示，所述的反向引物为seq.no:2所示，所述的荧光分子探针为probe-1所示。
24.引物对2：正向引物为seq.no:3所示，所述的反向引物为seq.no:4所示，所述的荧光分子探针为probe-2所示。
25.引物对3：正向引物为seq.no:5所示，所述的反向引物为seq.no:6所示，所述的荧光分子探针为probe-3所示。
26.通过添加不同浓度的正向引物、反向引物和分子探针以优化重组酶聚合酶扩增（rpa）的反应体系，将非洲猪瘟病毒p72 (b646l) 基因质粒标准品按照1：10的比例倍比稀释，逐渐稀释到8.9
×
10
0 copy/μl，分别检测不同浓度质粒标准品，以确定rpa扩增反应的引物和探针的最佳组合（图2）。实验结果表明引物和探针组合1的检测灵敏度最高。
27.为了进一步确定rpa扩增反应的引物和探针组合1的检测灵敏性，采用了侧流层析试纸条检测引物和探针组合1的最低检测限（图3）。检测结果显示，当质粒标准品的浓度在8.9
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100时，本发明所述的鉴定仍能检出。
28.分别以pcv, prv, ppv,csfv和jev等常见的猪病毒核酸样本为对照，在37-40 ℃条件下扩增20分钟，以确定引物和探针组合1的检测特异性（图4）。本发明所述的鉴定方法仅能对asfv检出，对于pcv, prv, ppv,csfv和jev则部呈现阳性反应，说明本发明具有较高的检测特异性。
29.sequence listing《110》苏州荧莱生物工程有限公司《120》一种基于rpa等温扩增技术鉴别非洲猪瘟病毒的方法《130》《160》
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