结合pdgf-b和pdgf-d的抗原结合分子及其用途
技术领域
1.本发明涉及与pdgf-b和/或pdgf-d结合的抗原结合分子、包含其的药物组合物和使用其的方法。


背景技术：

2.许多慢性疾病的特征在于持久且持续的炎症、损伤、组织重塑和纤维化。例如，进行性肾病，包括糖尿病肾病、iga肾病和增殖性狼疮肾炎，其组织学特征在于系膜细胞扩张和肾小球和肾小管间质纤维化。
3.血小板衍生生长因子(pdgf)信号传导是参与纤维化的中枢介体(mediator)中的一种。基质间充质细胞表达pdgf受体(pdgfr)α和β，它们的激活驱动细胞增殖和迁移以及细胞外基质的产生，即纤维化的主要过程(npl1)。pdgf还涉及多种人类疾病，包括但不限于动脉粥样硬化、再狭窄、肺动脉高压、视网膜血管疾病、器官纤维化(例如，心脏、肺、肝和肾)、类风湿性关节炎、骨关节炎、肿瘤发生和系统性硬化症(ssc；硬皮病)(npl2-5)。
4.pdgf家族包括五种同工型：pdgf-aa、pdgf-ab、pdgf-bb、pdgf-cc和pdgf-dd，与酪氨酸激酶pdgf受体(pdgfr)二聚体α-α、α-β或β-β结合。pdgf-a和pdgf-c主要与pdgfr-α链结合，pdgf-b与pdgfr-α和pdgfr-β链结合，而pdgf-d仅与pdgfr-β链结合(npl6)。配体结合后，pdgfr被磷酸化和相互作用并激活各种细胞质下游信号传导通路和转录因子，例如磷脂酶c、ras gtpase激活蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)、janus激酶、丝裂原激活蛋白激酶、p38或钙释放，它们驱动pdgf的基因表达和细胞效应(npl7)。
5.纤维化是许多组织病理性重塑的标志，也是临床疾病的促成因素。几乎所有慢性进行性疾病均与纤维化有关，这代表全世界大量的患者。尽管我们了解纤维化背后的许多细胞和分子过程，但有效的治疗选择很少(npl8)。因此，长期以来一直需要能够有效治疗或改善这些疾病/病症的新型潜在疗法，而本发明满足了这种需要。
6.引用列表
7.非专利文献
8.[npl1]b.m.klinkhammer等人molecular aspects of medicine 62(2018)44-62
[0009]
[npl2]trojanowska，2008，rheumatology 47：v2-v4
[0010]
[npl3]andrae et al.2008genes dev.22：1276-1312.
[0011]
[npl4]ying等人mol med rep.2017dec；16(6)：7879-7889
[0012]
[npl5]p.boor et al.nephrology dialysis transplantation，volume 29，february2014 45-54
[0013]
[npl6]chen等人biochim biophys acta.2013october；1834(10)：2176-2186.
[0014]
[npl7]heldin cell communication and signaling 2013 11：97
[0015]
[npl8]don c.rockey等人n engl j med 2015；372：1138-1149


技术实现要素：

[0016]
技术问题
[0017]
本发明的目的是提供有效抑制pdgf介导的疾病或病症(例如纤维变性疾病或纤维化)的抗原结合分子。
[0018]
问题的解决方案
[0019]
本发明人经过潜心研究，成功制备了特异性结合血小板衍生生长因子b(pdgf-b)和/或血小板衍生生长因子d(pdgf-d)的抗原结合分子，例如抗体及其抗原结合片段。本发明进一步涉及包含与pdgf-b和pdgf-d结合的多特异性抗体的组合物，以及使用这些抗体作为药物的方法。已知pdgf家族由四种不同的多肽链pdgf-a、pdgf-b、pdgf-c和pdgf-d组成(形成pdgf-aa、pdgf-cc、pdgf-ab、pdgf-bb和pdgf-dd二聚体)，其各自均能够通过激活酪氨酸激酶受体pdgf-rα和β来介导pdgf信号传导。本发明人已发现pdgf的五种同工型(aa、cc、ab、bb和dd)中的pdgf-b和pdgf-d的双重阻断足以有效抑制或治疗pdgf介导的疾病或病症，例如纤维化。重要的是，本发明人已经制备了结合和抑制pdgf-b和pdgf-d的抗体，并且已经证明双重结合pdgf-b和pdgf-d的抗体具有联合抑制作用并且有效抑制、预防或治疗pdgf-介导的疾病或病症。
[0020]
更具体地，本发明涉及：
[0021]
[1]一种药物组合物，其包含与pdgf-b结合的抗原结合分子和与pdgf-d结合的抗原结合分子。
[0022]
[1a]包含与pdgf-b结合的抗原结合分子的药物组合物，其与包含与pdgf-d结合的抗原结合分子的药物组合物组合。
[0023]
[1b]包含与pdgf-d结合的抗原结合分子的药物组合物，其与包含与pdgf-b结合的抗原结合分子的药物组合物组合。
[0024]
[1c]包含药物组合物的组合药物，所述药物组合物包含与pdgf-b结合的抗原结合分子和与pdgf-d结合的抗原结合分子。
[0025]
[1d][1]至[1c]中任一项的药物组合物，其中向受试者同时、单独或序贯施用所述与pdgf-b结合的抗原结合分子和所述与pdgf-d结合的抗原结合分子。
[0026]
[2]一种多特异性抗原结合分子，包含与pdgf-b结合的第一抗原结合结构域和与pdgf-d结合的第二抗原结合结构域。
[0027]
[3][2]的多特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有一种或多种以下特性：
[0028]
i)抑制pdgf-b和pdgf-d与pdgfrα和/或pdgfrβ的结合；
[0029]
ii)抑制pdgf-b和pdgf-d介导的pdgfrα和/或pdgfrβ的磷酸化；
[0030]
iii)抑制pdgf-b和pdgf-d诱导的pdgfrα和/或pdgfrβ的二聚化；
[0031]
iv)抑制pdgf-b和pdgf-d诱导的展示pdgfrα和/或pdgfrβ的细胞的有丝分裂；和
[0032]
v)不与pdgf-a和/或pdgf-c结合。
[0033]
[4][2]至[3]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是抗体，优选单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或或其片段。
[0034]
[5][2]至[4]中任一项的抗原结合分子，其中所述与pdgf-b结合的第一抗原结合结构域是：
[0035]
(a)包含以下项的抗原结合结构域：包含seq id no：1的氨基酸序列的vh；和包含seq id no：2的氨基酸序列的vl；
[0036]
(b)包含以下项的抗原结合结构域：包含seq id no：5的cdr-h1氨基酸序列、seq id no：6的cdr-h2氨基酸序列和seq id no：7的cdr-h3氨基酸序列的vh；以及包含seq id no：8的cdr-l1氨基酸序列、seq id no：9的cdr-l2氨基酸序列和seq id no：10的cdr-l3氨基酸序列的vl；
[0037]
(c)与(a)至(b)中任一抗原结合结构域结合pdgf-b上相同表位的抗原结合结构域；或
[0038]
(d)与(a)至(b)中任一抗原结合结构域竞争结合pdgf-b的抗原结合结构域；
[0039]
和/或
[0040]
所述与pdgf-d结合的第二抗原结合结构域是：
[0041]
(e)包含以下项的抗原结合结构域：包含seq id no：3的氨基酸序列的vh；和包含seq id no：4的氨基酸序列的vl；
[0042]
(f)包含以下项的抗原结合结构域：包含seq id no：11的cdr-h1氨基酸序列、seq id no：12的cdr-h2氨基酸序列和seq id no：13的cdr-h3氨基酸序列的vh；以及包含seq id no：14的cdr-l1氨基酸序列、seq id no：15的cdr-l2氨基酸序列和seq id no：16的cdr-l3氨基酸序列的vl；
[0043]
(g)与(e)至(f)中任一抗原结合结构域结合pdgf-d上相同表位的抗原结合结构域；或
[0044]
(h)与(e)至(f)中任一抗原结合结构域竞争结合pdgf-d的抗原结合结构域。
[0045]
[6][2]至[5]中任一项的抗原结合分子，进一步包含对fcγ受体具有降低的结合活性的抗体fc区。
[0046]
[7][1]至[1d]中任一项的药物组合物，或[2]至[6]中任一项的抗原结合分子，其用于治疗纤维变性疾病或纤维化。
[0047]
[7a][1]至[1d]中任一项的药物组合物，或[2]至[6]中任一项的抗原结合分子，其用于生产治疗纤维变性疾病或纤维化的药物中的用途。
[0048]
[8]一种用于预防、治疗或抑制纤维变性疾病或纤维化的方法，包括：向患有纤维变性疾病或纤维化的哺乳动物受试者施用[1]至[1d]中任一项的药物组合物，或[2]至[6]中任一项的抗原结合分子。
[0049]
[8a]一种用于预防或治疗由pdgf-b与pdgfr结合介导的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的[1]至[1d]中任一项的药物组合物，或[2]至[6]中任一项的抗原结合分子。
[0050]
[8b][8a]的方法，其中所述疾病、病症或病况是选自由以下项组成的组中的至少一种：纤维化(例如心肌纤维化、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化和骨髓纤维化)、肾炎和人相关疾病，包括但不限于肾炎、进行性肾病和相关疾病，例如iga肾病、系膜增生性肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、肾间质纤维化、肾功能衰竭、糖尿病肾病、多囊性肾病、奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化和膜性肾病。
[0051]
[9]根据[5]-[8]中任一项使用的药物组合物或抗原结合分子、用途或方法，其中
所述纤维变性疾病或纤维化的特征在于pdgf信号传导激活上调。
[0052]
[10]根据[5]-[8]和[9]中任一项使用的药物组合物或抗原结合分子、用途或方法，其中所述纤维变性疾病或纤维化是心肌纤维化、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化和骨髓纤维化、肾炎、进行性肾病、iga肾病、系膜增生性肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、肾间质纤维化、肾功能衰竭、糖尿病肾病、多囊性肾病、奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化或膜性肾病。
[0053]
[11]根据[5]-[8]和[9]中任一项使用的药物组合物或抗原结合分子、用途或方法，其中所述纤维变性疾病或纤维化是肾纤维化，优选其特征在于具有间质纤维化或肾小球硬化。
[0054]
[11a]根据[5]-[8]和[9]中任一项使用的药物组合物或抗原结合分子、用途或方法，其中所述纤维变性疾病或纤维化是肝纤维化或非酒精性脂肪肝炎(nash)。
[0055]
[11b]根据[5]至[11a]中任一项使用的药物组合物或抗原结合分子、用途或方法，其中所述受试者是人。
[0056]
[12]分离的多核苷酸，其包含编码[1]至[6]中任一项的抗原结合分子的核苷酸序列。
[0057]
[13]包含根据[12]的多核苷酸的表达载体。
[0058]
[14]用根据[12]的多核苷酸或根据[13]的表达载体转化或转染的宿主细胞。
[0059]
[15]产生抗原结合分子的方法，其包括：
[0060]
(a)鉴定与pdgf-b结合的一个或多个抗原结合结构域；
[0061]
(b)鉴定与pdgf-d结合的一个或多个抗原结合结构域；和
[0062]
(c)制备包含在(a)和(b)中鉴定的抗原结合结构域的抗原结合分子。
[0063]
[16][15]的方法，其进一步包括以下一个或多个步骤：
[0064]
(a)鉴定具有以下一种或多种特性的一个或多个抗原结合结构域
[0065]
i)抑制pdgf-b与pdgfrα和/或pdgfrβ的结合；
[0066]
ii)抑制pdgf-b介导的pdgfrα和/或pdgfrβ的磷酸化；
[0067]
iii)抑制pdgf-b诱导的pdgfrα和/或pdgfrβ的二聚化；
[0068]
iv)抑制pdgf-b诱导的展示pdgfrα和/或pdgfrβ的细胞的有丝分裂；
[0069]
v)不与pdgf-a和/或pdgf-c结合；和
[0070]
(b)鉴定具有以下一种或多种特性的一个或多个抗原结合结构域
[0071]
i)抑制pdgf-d与pdgfrα和/或pdgfrβ的结合；
[0072]
ii)抑制pdgf-d介导的pdgfrα和/或pdgfrβ的磷酸化；
[0073]
iii)抑制pdgf-d诱导的pdgfrα和/或pdgfrβ的二聚化；
[0074]
iv)抑制pdgf-d诱导的展示pdgfrα和/或pdgfrβ的细胞的有丝分裂；
[0075]
v)不与pdgf-a和/或pdgf-c结合。
[0076]
[17][15]至[16]中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是抗体，优选单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或其片段。
[0077]
另一方面，本发明进一步涉及特异性结合pdgf-d并阻断其与神经纤毛蛋白(neuropilin)1(nrp1)相互作用的抗原结合分子。nrp1与pdgf-d结合并且是pdgf-d-pdgfr-β信号传导中的共同受体(muhl，lars，等人，j cell sci 130.8(2017)：1365-1378)。在一个
实施方案中，抗原结合分子是一种抗体，其特异性结合pdgf-d并阻断/抑制其与神经纤毛蛋白1(nrp1)的相互作用并且还阻断/抑制pdgf-d与pdgfr的结合，从而抑制pdgf-d诱导的信号传导。与不能阻断nrp1-pdgf-d相互作用的抗pdgf-d抗体相比，预期此类抗体对pdgf-d介导的信号传导的抑制作用增强，用作治疗/预防pdgf-d介导的疾病/病况的更有效的抗pdgf-d抗体。获得与pdgf-d特异性结合并阻断/抑制其与nrp1相互作用以及还阻断/抑制pdgf-d与pdgfr结合的抗体的方法包括已知的抗原免疫，随后使用公知的方法例如elisa、octet、biacore和/或ecl等评估和筛选nrp1-pdgf-d相互作用的抑制。
附图说明
[0078]
[图1]图1显示了评价小鼠成纤维细胞系nih3t3中pdgfrβ磷酸化的结果。cpr是抗pdgf-b抗体，cr是抗pdgf-d抗体，以及cpr//cr是抗pdgf-b和pdgf-d双特异性抗体。
[0079]
[图2]图2显示了评价人成纤维细胞系imr90中pdgfrβ磷酸化的结果。cpr是抗pdgf-b抗体，cr是抗pdgf-d抗体，以及cpr//cr是抗pdgf-b和pdgf-d双特异性抗体。
[0080]
[图3]图3显示了评价人成纤维细胞系imr90中pdgfrα磷酸化的结果。cpr是抗pdgf-b抗体，cr是抗pdgf-d抗体，以及cpr//cr是抗pdgf-b和pdgf-d双特异性抗体。
[0081]
[图4]图4显示了小鼠成纤维细胞系nih3t3中brdu细胞增殖测定的结果。cpr是抗pdgf-b抗体，cr是抗pdgf-d抗体，以及cpr//cr是抗pdgf-b和pdgf-d双特异性抗体。
[0082]
[图5]图5显示了评价人成纤维细胞系imr90中pdgfrβ磷酸化的结果。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cr是抗pdgf-d抗体。nrp1-fc是重组蛋白，其中融合了人神经纤毛蛋白-1ecd和人igg1的fc区。
[0083]
[图6]图6显示了人成纤维细胞中brdu细胞增殖测定的结果。cr是抗pdgf-d抗体。nrp1-fc是重组蛋白，其中融合了人神经纤毛蛋白-1ecd和人igg1的fc区。
[0084]
[图7a]图7a显示了评价肾脏中1型胶原α1(col1a1)mrna水平的结果。在单侧输尿管梗阻(uuo)诱导的小鼠肾纤维化模型中评价单克隆抗体的有效性。假手术组代表非疾病诱导的对照。col1a1 mrna是通过用抗pdgf抗体处理来抑制的。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr001是抗pdgf-b抗体。cr002是抗pdgf-d抗体。
[0085]
[图7b]图7b显示了评价肾脏中羟脯氨酸含量的结果。在单侧输尿管梗阻(uuo)诱导的小鼠肾纤维化模型中评价单克隆抗体的有效性。假手术组代表非疾病诱导的对照。通过用抗pdgf抗体处理来减少肾纤维化。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr001是抗pdgf-b抗体。cr002是抗pdgf-d抗体。
[0086]
[图8a]图8a显示了血浆肌酸酐浓度测量结果。上图显示了血浆肌酸酐浓度随时间的变化。下图显示了第20周血浆肌酸酐的结果。在alport小鼠慢性肾病(ckd)模型(col4a3 ko小鼠)中评价单克隆抗体的有效性。野生型代表非疾病诱导的对照(c57bl/6j)。通过用抗pdgf抗体处理来抑制血浆肌酸酐。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr001是抗pdgf-b抗体。cr002是抗pdgf-d抗体。
[0087]
[图8b]图8b显示了血浆半胱氨酸蛋白酶抑制剂c浓度测量结果。上图显示了血浆半胱氨酸蛋白酶抑制剂c浓度随时间的变化。下图显示了第20周血浆半胱氨酸蛋白酶抑制剂c测量结果。在alport小鼠慢性肾病(ckd)模型(col4a3ko小鼠)中评价单克隆抗体的有效性。野生型代表非疾病诱导的对照(c57bl/6j)。通过用抗pdgf抗体处理来抑制血浆半胱氨
酸蛋白酶抑制剂c。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr001是抗pdgf-b抗体。cr002是抗pdgf-d抗体。
[0088]
[图8c]图8c显示了评价肾脏中1型胶原α1(collal)mrna水平的结果。在alport小鼠慢性肾病(ckd)模型(col4a3 ko小鼠)中评价单克隆抗体的有效性。野生型组代表非疾病诱导的对照。通过用抗pdgf抗体处理来抑制col1a1 mrna。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr001是抗pdgf-b抗体。cr002是抗pdgf-d抗体。
[0089]
[图8d]图8d显示了评价肾脏中羟脯氨酸含量的结果。在alport小鼠慢性肾病(ckd)模型(col4a3 ko小鼠)中评价单克隆抗体的有效性。野生型组代表非疾病诱导的对照。通过用抗pdgf抗体处理来减少肾纤维化。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr001是抗pdgf-b抗体。cr002是抗pdgf-d抗体。
[0090]
[图9a]图9a显示了评价肝脏中1型胶原α1 mrna水平的结果。在胆碱缺乏l-氨基酸定义的高脂饲料(cdahfd)诱导的小鼠nash/肝纤维化模型中评价单克隆抗体的有效性。正常饲料组代表非疾病诱导的对照。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr是抗pdgf-b ab，cr是抗pdgf-d抗体(如wo2007059234中所述的cr002)。combi组用cpr和cr处理。
[0091]
[图9b]图9b显示了评价肝脏中羟脯氨酸含量的结果。在胆碱缺乏l-氨基酸定义的高脂饲料(cdahfd)诱导的小鼠nash/肝纤维化模型中评价单克隆抗体的有效性。正常饲料组代表非疾病诱导的对照。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr是抗pdgf-b抗体。cr是抗pdgf-d抗体(如wo2007059234中所述的cr002)。combi组用cpr和cr处理。通过用抗pdgf抗体处理来减少肝纤维化。
[0092]
[图10]图10显示了评价肾脏中1型胶原α1(colla1)mrna水平的结果。在单侧输尿管梗阻(uuo)诱导的小鼠肾纤维化模型中评价单克隆抗体的有效性。假手术组代表非疾病诱导的对照。通过用cpr//cr处理来抑制col1a1 mrna。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr//cr是针对pdgf-b和pdgf-d的双特异性抗体。
[0093]
[图11]图11显示了评价肾脏中羟脯氨酸含量的结果。在单侧输尿管梗阻(uuo)诱导的小鼠肾纤维化模型中评价单克隆抗体的有效性。假手术组代表非疾病诱导的对照。通过用cpr//cr处理来减少肾纤维化。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr//cr是针对pdgf-b和pdgf-d的双特异性抗体。
[0094]
[图12]图12显示了血浆肌酸酐浓度测量结果。血浆肌酸酐浓度随时间的变化显示于a中，第20周血浆肌酸酐的结果显示于b中。在alport小鼠慢性肾病(ckd)模型(col4a3 ko小鼠)中评价单克隆抗体。野生型代表非疾病诱导的对照(c57bl/6j)。通过用cpr//cr处理来抑制血浆肌酸酐。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr//cr是针对pdgf-b和pdgf-d的双特异性抗体。
[0095]
[图13]图13显示了评价肾脏中1型胶原α1(col1a1)mrna水平的结果。在alport小鼠慢性肾病(ckd)模型(col4a3 ko小鼠)中评价单克隆抗体的有效性。野生型组代表非疾病诱导的对照。通过用cpr//cr处理来抑制col1a1 mrna。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr//cr是针对pdgf-b和pdgf-d的双特异性抗体。
[0096]
[图14]图14显示了评价肾脏中羟脯氨酸含量的结果。在alport小鼠慢性肾病(ckd)模型(col4a3 ko小鼠)中评价单克隆抗体的有效性。野生型组代表非疾病诱导的对照。通过用cpr//cr处理来减少肾纤维化。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr//cr是针对
pdgf-b和pdgf-d的双特异性抗体。
[0097]
[图15]图15显示了评价肝脏中1型胶原α1 mrna的结果。在胆碱缺乏l-氨基酸定义的高脂饲料(cdahfd)诱导的小鼠nash/肝纤维化模型中评价单克隆抗体的有效性。正常饲料组代表非疾病对照。通过用cpr//cr处理来抑制colla1 mrna。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr//cr是针对pdgf-b和pdgf-d的双特异性抗体。
[0098]
[图16]图16显示了评价血浆天冬氨酸氨基转移酶(ast)和丙氨酸氨基转移酶(alt)的结果。在胆碱缺乏l-氨基酸定义的高脂(cdahfd)诱导的小鼠nash/肝纤维化模型中评价单克隆抗体的有效性。通过用cpr//cr处理来抑制血浆ast(上图)和alt(下图)。正常饲料组代表非疾病对照。ic17是抗klh抗体，用作阴性对照。cpr//cr是针对pdgf-b和pdgf-d的双特异性抗体。
[0099]
[图17]图17是显示抗pdgf-d抗体(cr002)和hpdgfrβ针对hpdgf-d的竞争结合的浓度反应曲线，如用预混物竞争测定所评价。pdgf-d与pdgfrβ的结合被浓度增加的抗pdgf-d抗体(cr002)阻断。
[0100]
[图18]图18显示了biacore串联阻断测定的结果，以表征抗pdgf-d抗体(cr002)和hnrp1-fc在hpdgf-d上的结合表位。cr002注射的结合反应大于缓冲液注射观察到的结果，表明cr002和hnrp-1结合hpdgf-d上的不同表位。
具体实施方式
[0101]
本文描述或引用的技术和程序通常被本领域技术人员充分理解并使用常规方法学普遍采用，例如，sambrook等人，分子克隆：实验室手册第3版(2001)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州；现代分子生物学方法(f.m.ausubel，等人编辑(2003))；酶学方法系列(academic press，inc.)：pcr 2：实用方法(m.j.macpherson，b.d.hames和g.r.taylor编辑(1995))，harlow和lane，编辑(1988)抗体、实验室手册和动物细胞培养(r.i.freshney，编辑(1987))；寡核苷酸合成(m.j.gait，编辑，1984)；分子生物学方法，humana出版社；细胞生物学：实验室记录(j.e.cellis，编辑，1998)学术出版社；动物细胞培养(r.i.freshney)，编辑，1987)；细胞和组织培养简介(j.p.mather和p.e.roberts，1998)plenum press；细胞和组织培养：实验室程序(a.doyle，j.b.griffiths和d.g.newell，编辑，1993-8)j.wiley和sons；实验免疫学手册(d.m.weir和c.c.blackwell，编辑)；哺乳动物细胞基因转移载体(j.m.miller和m.p.calos，编辑，1987)；pcr：聚合酶链反应，(mullis等人，编辑，1994)；当代免疫学方法(j.e.coligan等人，编辑，1991)；分子生物学简论(wiley和sons，1999)；免疫生物学(c.a.janeway和p.travers，1997)；抗体(p.finch，1997)；抗体：实用方法(d.catty.，编辑，irl press，1988-1989)；单克隆抗体：实用方法(p.shepherd和c.dean，编辑，牛津大学出版社，2000)；使用抗体：实验室手册(e.harlow和d.lane(冷泉港实验室出版社，1999)；抗体(m.zanetti和j.d.capra，编辑，harwood学术出版社，1995)；以及癌症：肿瘤学的原理和实践(v.t.devita等人，编辑，j.b.lippincott公司，1993)中描述的广泛利用的方法学。
[0102]
提供以下定义和详细描述以促进对本文所示的本发明的理解。
[0103]
氨基酸
[0104]
本文中氨基酸由三字母或单字母代码或两者描述，例如丙氨酸为ala/a，亮氨酸为
leu/l，精氨酸为arg/r，赖氨酸为lys/k，天冬酰胺为asn/n，蛋氨酸为met/m，天冬氨酸为asp/d，苯丙氨酸为phe/f，半胱氨酸为cys/c，脯氨酸为pro/p，谷氨酰胺为gln/q，丝氨酸为ser/s，谷氨酸为glu/e，苏氨酸为thr/t，甘氨酸为gly/g，色氨酸为trp/w，组氨酸为his/h，酪氨酸为tyr/y，异亮氨酸为ile/i，或缬氨酸为val/v。
[0105]
氨基酸的改变
[0106]
对于抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸改变，可以适当地采用已知方法例如定点诱变法(kunkel等人(proc.natl.acad.sci.usa(1985)82，488-492))和重叠延伸pcr。此外，还可以采用几种已知的方法作为氨基酸改变方法来置换为非天然氨基酸(annu rev.biophys.biomol.struct.(2006)35，225-249；和proc.natl.acad.sci.u.s.a.(2003)100(11)，6353-6357)。例如，适合使用含trna的无细胞翻译系统(clover direct(protein express))，该系统具有与终止密码子之一(uag密码子(琥珀密码子))的互补琥珀抑制trna结合的非天然氨基酸。
[0107]
在本说明书中，当描述氨基酸改变位点时，术语“和/或”的含义包括其中“和”和“或”适当组合的所有组合。具体地，例如，“第33、55和/或96位的氨基酸被置换”包括以下氨基酸改变的变体：(a)第33位、(b)第55位、(c)第96位、(d)第33和55位、(e)第33和96位、(f)第55和96位以及(g)第33、55和96位的氨基酸改变。
[0108]
此外，在本文中，作为显示氨基酸的特定改变的缩写表示，可以适当使用将数字(表示改变的氨基酸的位置)和单字母或三字母氨基酸代码(表示改变前后的氨基酸)组合的表示，该表示可以按以下顺序组织：改变前氨基酸代码-指示位置的数字-改变后氨基酸代码。例如，用于指代抗体可变区中所含氨基酸置换的表示n100bl或asn100bleu指示第100b位(根据kabat编号)的asn置换为leu。即，数字显示根据kabat编号的氨基酸位置，数字前书写的单字母或三字母的氨基酸代码显示置换前的氨基酸，以及数字后书写的单字母或三字母的氨基酸代码显示置换后的氨基酸。类似地，用于指代包含在抗体恒定区中的fc区的氨基酸置换的改变p238d或pro238asp指示第238位(根据eu编号)的pro置换为asp。即，数字显示根据eu编号的氨基酸位置，数字前书写的单字母或三字母氨基酸代码显示置换前的氨基酸，以及数字后书写的单字母或三字母的氨基酸代码显示置换后的氨基酸。
[0109]
抗原结合分子
[0110]
如本文所用，术语“抗原结合分子”是指包含抗原结合结构域的任何分子或对抗原具有结合活性的任何分子，并且可以进一步指例如具有约五个或更多个氨基酸长度的肽或蛋白质的分子。肽和蛋白质不限于源于生物体的那些，并且例如可以是由人工设计序列产生的多肽。它们还可以是天然存在的多肽、合成多肽、重组多肽等中的任一种。
[0111]
本发明的抗原结合分子的有利实例是包含多个抗原结合结构域的抗原结合分子。在某些实施方案中，本发明的抗原结合分子包含具有不同抗原结合特异性的两个抗原结合结构域。在某些实施方案中，本发明的抗原结合分子包含具有不同抗原结合特异性的两个抗原结合结构域，和包含在抗体fc区中的fcrn结合结构域。作为用于延长向生物体施用的蛋白的血液半衰期的方法，将抗体的fcrn结合结构域添加至目标蛋白和利用fcrn介导的再循环的功能的方法是熟知的。
[0112]
抗原结合结构域
[0113]
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的全
部或部分特异性结合并与之互补的区域。当抗原的分子量较大时，抗体可仅与抗原的特定部分结合。该特定部分称为“表位”。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域提供。优选地，抗原结合结构域含有包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)的抗体可变区。这种优选的抗原结合结构域包括，例如，“单链fv(scfv)”、“单链抗体”、“fv”、“单链fv2(scfv2)”、“fab”和“f(ab
′
)
2”。
[0114]
本发明的抗原结合分子的抗原结合结构域与pdgf-b和/或pdgf-d特异性结合。即，pdgf-b和pdgf-d分别是优选的目标抗原(抗原结合结构域对其目标抗原具有结合活性，但基本上不识别和结合含有混合抗原分子群的样品中的其他分子)。如本文所用，短语“具有结合活性”是指抗原结合结构域、抗体、抗原结合分子、抗体可变片段等(在下文中，“抗原结合结构域等”)以高于非特异性或背景结合水平的特异性结合水平与目标抗原结合。换言之，此类抗原结合结构域等对目标抗原“具有特异性/显著结合活性”。可以通过如本文所述或本领域已知的用于检测亲和力或结合活性的任何方法来测量特异性。上述特异性结合水平可足够高以被技术人员认为具有显著性。例如，当技术人员可以在合适的结合测定中检测或观察抗原结合结构域等与目标抗原之间的结合的任何显著或相对强的信号或值时，可以认为抗原结合结构域等对目标抗原具有“特异性/显著结合活性”。备选地，“具有特异性/显著结合活性”可以改述为(与目标抗原)“特异性/显著结合”。有时，短语“具有结合活性”与本领域中的短语“具有特异性/显著结合活性”具有基本上相同的含义。如本文所用，与抗原“特异性结合”的抗原结合分子或抗体是指以高亲和力结合抗原和基本上相同的抗原的抗原结合分子或抗体，这表示具有10-7
m或更小，优选10-8
m或更小，甚至更优选10-9
m或更小，并且最优选10-8
m至10-10
m或更小的kd，但不以高亲和力与无关抗原结合，如通过表面等离子体共振测定或细胞结合测定所测量的。
[0115]
在一些实施方案中，使用例如biacore t200仪器(ge healthcare)在25℃下评估本发明的抗原结合结构域对目标抗原(即pdgf-b或pdgf-d)的结合活性或结合亲和力(kd)。使用胺偶联试剂盒(例如，ge healthcare)将抗人fc(例如，ge healthcare)固定在cm4传感器芯片的所有流动池上。抗原结合分子或抗原结合结构域被捕获至抗fc传感器表面，然后将抗原(例如pdgf-b或pdgf-d)进样至流动池上方。所有抗原结合结构域和分析物均在pbs-net(10mm磷酸盐、287mm nacl、2.7mm kcl、3.2mm edta、0.01％p20、0.005％nan3，ph 7.4)中制备。传感器表面在每个循环均使用3m mgcl2进行再生。通过使用例如biacore t200评价软件2.0版(ge healthcare)处理数据并将数据拟合至1∶1结合模型以确定结合亲和力。
[0116]
pdgf-b和pdgf-d
[0117]
术语“pdgf-b”意指任何天然存在的pdgf-b形式，无论是单体还是二聚体，其可以源自任何合适的生物体。该术语涵盖包含pdgf-b的任何二聚体，即pdgf-ab和pdgf-bb。如本文所用，“pdgf-b”是指哺乳动物pdgf-b，例如人、大鼠或小鼠，以及非人灵长类动物、牛、羊或猪pdgf-b。优选地，pdgf-b是人pdgf-b。术语“pdgf-b”还涵盖此类pdgf-b分子的片段、变体、同工型和其他同源物。变体pdgf-b分子的特征通常在于具有与天然存在的pdgf-b相同类型的活性，例如结合pdgfr的能力、诱导受体磷酸化的能力、通过此类受体介导信号传导的能力、诱导细胞迁移或增殖的能力，以及诱导或增加细胞外基质沉积的能力。示例性人pdgf-b的氨基酸序列如seq id no：17所示。
[0118]
类似地，术语“pdgf-d”意指任何天然存在的pdgf-d形式，无论是单体还是二聚体，
其可以源自任何合适的生物体。该术语涵盖包含pdgf-d的二聚体，即pdgf-dd。如本文所用，“pdgf-d”是指哺乳动物pdgf-d，例如人、大鼠或小鼠，以及非人灵长类动物、牛、羊或猪pdgf-d。优选地，pdgf-d是人pdgf-d。术语“pdgf-d”还涵盖此类pdgf-d分子的片段、变体、同工型和其他同源物。变体pdgf-d分子的特征通常在于具有与天然存在的pdgf-d相同类型的活性，例如结合pdgfr的能力、诱导受体磷酸化的能力、通过此类受体介导信号传导的能力、诱导细胞迁移或增殖的能力，以及诱导或增加细胞外基质沉积的能力。示例性人pdgf-d的氨基酸序列如seq id no：18所示。
[0119]
一方面，本发明的抗原结合分子特异性结合pdgf-b(例如pdgf-b、pdgf-ab和pdgf-bb)并抑制其与pdgfr的相互作用，从而抑制pdgf-b活性。术语“pdgf-b介导的活性”、“pdgf-b介导的效应”、“pdgf-b活性”、“pdgf-b生物活性”或“pdgf-b功能”在本文中可互换使用，意指由pdgf-b与同源受体相互作用介导的任何活性，该活性包括但不限于pdgf-b与pdgfr的结合、pdgfr的磷酸化、细胞迁移的增加、细胞增殖的增加、细胞外基质沉积的增加，以及本领域已知的或待将来阐明的pdgf-b的任何其他活性。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子是与pdgf-b特异性结合的抗体。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子/抗体与无关的非pdgf-b蛋白的结合程度小于抗体与pdgf-b结合的约10％，例如，如通过放射性免疫测定(ria)所测量的。在一个实施方案中，所述非pdgf-b是pdgf-a、pdgf-c或pdgf-d。在某些实施方案中，与pdgf-b结合的抗体具有1μm或更小、100nm或更小、10nm或更小、1nm或更小、0.1nm或更小、0.01nm或更小、或0.001nm或更小(例如10-8
m或更小，例如10-8
m至10-13
m，例如10-9
m至10-13
m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗pdgf-b抗体与在来自不同物种的pdgf-b之间保守的pdgf-b表位结合。
[0120]
另一方面，本发明的抗原结合分子特异性结合pdgf-d(例如pdgf-d和pdgf-dd)并抑制其与pdgfr的相互作用，从而抑制pdgf-d活性。术语“pdgf-d介导的活性”、“pdgf-d介导的效应”、“pdgf-d活性”、“pdgf-d生物活性”或“pdgf-d功能”在本文中可互换使用，意指由pdgf-d与同源受体的相互作用介导的任何活性，该活性包括但不限于pdgf-d与pdgfr的结合、pdgfr的磷酸化、细胞迁移的增加、细胞增殖的增加、细胞外基质沉积的增加，以及本领域已知的或待将来阐明的pdgf-d的任何其他活性。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子是与pdgf-d特异性结合的抗体。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子/抗体与无关的非pdgf-d蛋白的结合程度小于抗体与pdgf-d结合的约10％，例如，如通过放射性免疫测定(ria)所测量的。在一个实施方案中，所述非pdgf-d是pdgf-a、pdgf-b或pdgf-c。在某些实施方案中，与pdgf-d结合的抗体具有1μm或更小、100nm或更小、10nm或更小、1nm或更小、0.1nm或更小、0.01nm或更小、或0.001nm或更小(例如10-8
m或更小，例如10-8
m至10-13
m，例如10-9
m至10-13
m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗pdgf-d抗体与在来自不同物种的pdgf-d之间保守的pdgf-d表位结合。
[0121]
另一方面，本发明的抗原结合分子是多特异性抗原结合分子，优选多特异性抗体，其特异性结合pdgf-b(即，pdgf-b、pdgf-ab和pdgf-bb)和pdgf-d(即，pdgf-d和pdgf-dd)并抑制它们与pdgfr的相互作用，从而抑制pdgf-b和pdgf-d活性。
[0122]
因此，本发明的方法使用本发明的抗原结合分子或抗体，其阻断、抑制或降低(包括显著降低)pdgf-b和/或pdgf-d活性，包括由pdgf-b和/或pdgf-d介导的下游事件。本发明的抗原结合分子或抗体表现出以下特征中的任一种或多种：(a)与pdgf-b和/或pdgf-d特异
性结合；(b)阻断pdgf-b和/或pdgf-d与细胞表面受体的相互作用和下游信号传导事件；(c)阻断pdgfr的磷酸化；(d)阻断pdgf-b和/或pdgf-d介导的细胞增殖诱导；(e)阻断pdgf-b和/或pdgf-d介导的细胞迁移诱导；以及(f)阻断或减少pdgf-b和/或pdgf-d介导的细胞外基质沉积。在一个优选的实施方案中，本发明的抗原结合分子或抗体优选以阻断pdgf-b和/或pdgf-d与细胞表面受体(例如，pdgfr)相互作用的方式与pdgf-b和/或pdgf-d反应。
[0123]
亲和力
[0124]“亲和力”是指分子(例如，抗原结合分子或抗体)的单结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗原结合分子和抗原，或抗体和抗原)之间的1：1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以用解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法测量，包括本文所述的那些。以下描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
[0125]
确定亲和力的方法
[0126]
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合分子或抗体的抗原结合结构域对其抗原的解离常数(kd)为1μm或更小、120nm或更小、100nm或更小、80nm或更小、70nm或更小、50nm或更小、40nm或更小、30nm或更小、20nm或更小、10nm或更小、2nm或更小、1nm或更小、0.1nm或更小、0.01nm或更小、或0.001nm或更小(例如，10-8
m或更小，10-8
m至10-13
m，10-9
m至10-13
m)。在某些实施方案中，抗体/抗原结合分子的第一抗原结合结构域对pdgf-b或pdgf-d的kd值落在1-40、1-50、1-70、1-80、30-50、30-70、30-80、40-70、40-80或60-80nm的范围内。
[0127]
在一个实施方案中，kd通过放射性标记抗原结合测定(ria)测量。在一个实施方案中，使用目标抗体的fab形式及其抗原进行ria。例如，fab对抗原的溶液结合亲和力通过以下进行测量：在存在一系列滴定的未标记抗原的情况下用最小浓度的(
125
i)标记的抗原平衡fab，然后用抗fab抗体包被的板捕获结合的抗原(参见，例如，chen等人，j.mol.biol.293：865-881(1999))。为建立测定条件，将microtiter(注册商标)多孔板(thermo scientific)用50mm碳酸钠(ph 9.6)中的5μg/ml捕获抗fab抗体(cappel labs)包被过夜，随后在室温(约23℃)下用pbs中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭两至五个小时。在非吸附板(nunc#269620)中，将100pm或26pm[
125
i]-抗原与目标fab的系列稀释液混合(例如，与presta等人，cancer res.57：4593-4599(1997)中抗vegf抗体fab-12的评估一致)。然后将目标fab孵育过夜；然而，孵育可以持续较长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板用于在室温下孵育(例如，一小时)。然后弃液并用pbs中的0.1％聚山梨醇酯20(tween-20(注册商标))将板洗涤八次。当板干燥后，加入150μl/孔闪烁剂(microscint-20
tm
；packard)，并在topcount
tm
伽马计数器(packard)上对板计数10分钟。选择产生小于或等于最大结合20％的每种fab的浓度用于竞争性结合测定。
[0128]
根据另一实施方案，使用biacore(注册商标)表面等离子体共振测定测量kd。例如，使用biacore(注册商标)-2000或biacore(注册商标)-3000(biacore，inc.，piscataway，nj)的测定在25℃下使用固定的抗原cm5芯片以～10个响应单位(ru)进行。在一个实施方案中，将羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(cm5，biacore，inc.)根据供应商的说明用n-乙基-n
′‑
(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)激活。在以5μl/分钟的流速注射前，将抗原用10mm乙酸钠(ph 4.8)稀释至5μg/ml(～0.2μm)，
以获得约10个响应单位(ru)的偶联蛋白。抗原注射后，注射1m乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下以约25μl/分钟的流速将fab的两倍系列稀释液(0.78nm至500nm)注射至含有0.05％聚山梨醇酯20(tween-20
tm
)表面活性剂的pbs(pbst)中。缔合速率(k
on
)和解离速率(k
off
)使用简单one-to-one langmuir结合模型(biacore(注册商标)评价软件3.2版)通过同时拟合缔合和解离传感图进行计算。平衡解离常数(kd)计算为k
otr
/k
on
比。参见，例如，chen等人，j.mol.biol.293：865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定，导通速率(on-rate)超过106m-1
s-1
，则可以通过使用荧光猝灭技术来确定导通速率，该技术测量在存在浓度增加的抗原的情况下，于25℃下在pbs(ph 7.2)中的20nm抗抗原抗体(fab形式)在荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)下的增加或减少，如在分光计中所测量的，例如配备停流的分光光度计(aviv instruments)或带有搅拌比色皿的8000系列slm-aminco
tm
分光光度计(thermospectronic)。
[0129]
抗体的抗原结合结构域亲和力的测量方法如上所述，并且本领域技术人员可以对其他抗原结合结构域进行亲和力测量。
[0130]
抗体
[0131]
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用并涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原-结合活性即可。
[0132]
抗体类别
[0133]
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要的抗体类别：iga、igd、ige、igg和igm，并且其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
[0134]
框架
[0135]“框架”或“fr”是指高变区(hvr)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的fr通常由四个fr结构域组成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，hvr和fr序列在vh(或vl)中通常以下面序列出现：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。
[0136]
人共有框架
[0137]“人共有框架”是代表人免疫球蛋白vl或vh框架序列选择中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白vl或vh序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如kabat等人，免疫学目标蛋白序列(sequences of proteins of immunological interest)，第五版，nih出版91-3242，bethesda md(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于vl，该亚组是如kabat等人(同上)中的亚组κi。在一个实施方案中，对于vh，该亚组是如kabat等人(同上)中的亚组iii。
[0138]
hvr
[0139]
如本文所用，术语“高变区”或“hvr”是指抗体可变结构域的每个区域，其在序列上是高变的(“互补决定区”或“cdr”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个hvr：三个在vh(h1、h2、h3)中，并且三个在vl(l1、l2、l3)中。本文的示例性hvr包括：
[0140]
(a)出现在氨基酸残基26-32(l1)、50-52(l2)、91-96(l3)、26-32(h1)、53-55(h2)
和96-101(h3)的高可变环(chothia和lesk，j.mol.biol.196：901-917(1987))；
[0141]
(b)出现在氨基酸残基24-34(l1)、50-56(l2)、89-97(l3)、31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)的cdr(kabat等人，免疫学目标蛋白序列，第5版公共卫生服务，国立卫生研究院，bethesda，md(1991))；
[0142]
(c)出现在氨基酸残基27c-36(l1)、46-55(l2)、89-96(l3)、30-35b(h1)、47-58(h2)和93-101(h3)的抗原接触(maccallum等人j.mol.biol.262：732-745(1996))；以及
[0143]
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括hvr氨基酸残基46-56(l2)、47-56(l2)、48-56(l2)、49-56(l2)、26-35(h1)、26-35b(h1)、49-65(h2)、93-102(h3)和94-102(h3)。
[0144]
除非另有说明，可变结构域中的hvr残基和其他残基(例如，fr残基)在本文中根据kabat等人(同上)编号。
[0145]
hvr-h1、hvr-h2、hvr-h3、hvr-l1、hvr-l2和hvr-l3也可分别称为“hcdr1”、“hcdr2”、“hcdr3”、lcdr1”、“lcdr2”和“lcdr3”。
[0146]
可变区
[0147]
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为vh和vl)通常具有相似结构，每个结构域包含四个保守框架区(fr)和三个高变区(hvr)。(参见，例如，kindt等人，kuby免疫学，第6版，w.h.freeman and co.，第91页(2007)。)单个vh或vl结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的vh或vl结构域以分别筛选互补vl或vh结构域的文库，从而分离结合特定抗原的抗体。参见，例如，portolano等人，j.immunol.150：880-887(1993)；clarkson等人，nature 352：624-628(19911。
[0148]
同一性(序列同一性)
[0149]
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入缺口(如有必要)以实现最大序列同一性百分比并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以以本领域技术范围内的各种方式实现用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如blast、blast-2、align、megalign(dnastar)软件，或genetyx(注册商标)(genetyx co.，ltd.)。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
[0150]
align-2序列比较计算机程序由genentech，inc.编写，源代码已与用户文档一起提交给华盛顿特区美国版权局，20559，在美国版权注册号为txu510087。align-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的genentech，inc.公开获得，或可以从源代码编译。应编译align-2程序以在unix操作系统上使用，包括数字unix v4.0d。所有序列比较参数均由align-2程序设置而未更改。在采用align-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列a与、对或针对给定氨基酸序列b的氨基酸序列同一性％(备选地，其可以被表述为与、对或针对给定氨基酸序列b具有或包含特定氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列a)计算如下：
[0151]
100乘以x/y分数
[0152]
其中x是序列比对程序align-2对a和b进行程序比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，并且其中y是b中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度时，a与b的氨基酸序列同一性百分比将不等于b与a的氨基酸序列同一性百
分比。除非另外特别说明，本文所用的所有氨基酸序列同一性％值均如前段所述使用align-2计算机程序获得。
[0153]
嵌合抗体
[0154]
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。类似地，术语“嵌合抗体可变结构域”是指抗体可变区，其中重链和/或轻链可变区的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链可变区的其余部分源自不同来源或物种。
[0155]
人源化抗体
[0156]“人源化”抗体是指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个(并且通常为两个)可变结构域，其中所有或基本上所有的hvr(例如，cdr)对应于非人抗体的hvr，以及所有或基本上所有的fr对应于人抗体的fr。人源化抗体可以任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指经人源化的抗体。“人源化抗体可变区”是指人源化抗体的可变区。
[0157]
人抗体
[0158]“人抗体”是具有与由人或人细胞产生的或源自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人抗体可变区”是指人抗体的可变区。
[0159]
产生具有期望结合活性的抗体的方法
[0160]
产生具有期望结合活性的抗体的方法是本领域技术人员已知的。以下是描述用于产生与pdgf-b或pdgf-d结合的抗体(即抗pdgf-b抗体或抗pdgf-d抗体)的方法的实例。
[0161]
抗pdgf-b或pdgf-d抗体可以使用已知方法作为多克隆或单克隆抗体获得。产生的抗pdgf-b或pdgf-d抗体优选是源自哺乳动物的单克隆抗体。这种源自哺乳动物的单克隆抗体包括由通过基因工程技术用携带抗体基因的表达载体转化的杂交瘤或宿主细胞产生的抗体。
[0162]
产生单克隆抗体的杂交瘤可以使用已知技术产生，例如，如下所述。具体地，通过使用pdgf-b或pdgf-d蛋白作为致敏抗原的常规免疫方法对哺乳动物进行免疫。产生的免疫细胞通过常规细胞融合方法与已知的亲代细胞融合。然后，可以通过使用常规筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞以选择产生抗pdgf-b或pdgf-d抗体的杂交瘤。
[0163]
具体地，如下所述制备单克隆抗体。首先，可以合成或表达包含pdgf-b或pdgf-d的多肽，其将用作抗体制备的致敏抗原或免疫原。备选地，可以表达编码全长pdgf-b或pdgf-d或者pdgf-b或pdgf-d的截短或其他变体形式的核酸以产生含有pdgf-b或pdgf-d的蛋白(以单体形式或二聚体形式)。可以通过已知方法从宿主细胞或其培养物上清液纯化期望的人全长pdgf-b或pdgf-d(单体或二聚体)，pdgf-b或pdgf-d的截短或其他变体形式。
[0164]
纯化的全长pdgf-b或pdgf-d，或者pdgf-b或pdgf-d的截短或其他变体形式，可用作用于哺乳动物免疫的致敏抗原或免疫原。全长pdgf-b或pdgf-d的部分肽也可用作致敏抗原。在这种情况下，部分肽也可以从人pdgf-b或pdgf-d氨基酸序列通过化学合成获得。此外，它们也可以通过将pdgf-b或pdgf-d基因的一部分掺入表达载体并表达来获得。
[0165]
备选地，可以使用通过将全长pdgf-b或pdgf-d或者pdgf-b或pdgf-d ecd蛋白的期
望部分多肽或肽与不同多肽融合而制备的融合蛋白作为致敏抗原。例如，抗体fc片段和肽标签优选用于产生用作致敏抗原的融合蛋白。用于表达此类融合蛋白的载体可以通过将编码框架内的两个或更多个期望多肽片段的基因融合并将融合基因插入如上所述的表达载体中进行构建。分子克隆第2版(sambrook，j等人，分子克隆第2版，9.47-9.58(1989)cold spring harbor lab.press)中描述了产生融合蛋白的方法。制备用作致敏抗原的pdgf-b或pdgf-d的方法以及使用pdgf-b或pdgf-d的免疫方法也在本说明书后面的实施例中描述。
[0166]
对用致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限制。然而，优选通过考虑它们与待用于细胞融合的亲代细胞的相容性来选择哺乳动物。通常，优选使用啮齿动物，例如小鼠、大鼠和仓鼠、兔以及猴。
[0167]
通过已知方法用致敏抗原免疫上述动物。通常进行的免疫方法包括，例如，腹腔或皮下注射致敏抗原至哺乳动物。具体地，致敏抗原用pbs(磷酸盐缓冲盐水)、生理盐水等适当稀释。如有需要，将常规佐剂(例如弗氏完全佐剂)与抗原混合，并将混合物乳化。然后，向哺乳动物以4至21天的间隔多次施用致敏抗原。合适的运载体可用于用致敏抗原的免疫中。特别是，当使用低分子量部分肽作为致敏抗原时，有时需要将致敏抗原肽与运载体蛋白(例如白蛋白或钥孔血蓝蛋白)偶联以进行免疫。
[0168]
备选地，可以使用如下所述的dna免疫来制备产生期望抗体的杂交瘤。dna免疫是通过在动物中表达致敏抗原来赋予免疫刺激的免疫方法，该动物是施用构建为允许在动物中表达抗原蛋白编码基因的载体dna的结果。
[0169]
为了使用dna免疫制备本发明的单克隆抗体，首先，向待免疫动物施用用于表达pdgf-b或pdgf-d蛋白的dna。编码pdgf-b或pdgf-d的dna可以通过已知的方法(例如pcr)合成。将获得的dna插入适当的表达载体，然后将其施用于待免疫的动物。优选使用的表达载体包括，例如，可商购获得的表达载体，例如pcdna3.1。可以使用常规方法向生物体施用载体。例如，dna免疫是通过使用基因枪以便将表达载体包被的金颗粒导入待免疫动物体内的细胞进行的。
[0170]
如上所述对哺乳动物进行免疫后，证实血清中pdgf-b或pdgf-d结合抗体的效价增加。然后，从哺乳动物采集免疫细胞，然后进行细胞融合。特别地，脾细胞优选用作免疫细胞。
[0171]
哺乳动物骨髓瘤细胞用作与上述免疫细胞融合的细胞。骨髓瘤细胞优选包含用于筛选的合适选择标记。选择标记赋予细胞在特定培养条件下存活(或死亡)的特征。已知次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷(以下简称为hgprt缺陷)和胸苷激酶缺陷(以下简称为tk缺陷)作为选择标记。具有hgprt或tk缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为hat敏感性)。hat敏感细胞不能在hat选择培养基中合成dna，因此在hat选择培养基中培养可被杀死；然而，如果细胞与正常细胞融合，它们可被拯救。细胞可以使用正常细胞的拯救途径继续dna合成，因此它们甚至可以在hat选择培养基中生长。
[0172]
hgprt缺陷细胞可以在含6-硫鸟嘌呤或8-氮鸟嘌呤(以下简称为8ag)的培养基中筛选，并且tk缺陷细胞可以在含5
′‑
溴脱氧尿苷的培养基中筛选。正常细胞在选择培养基中被杀死，因为它们将这些嘧啶类似物掺入至它们的dna中。同时，缺乏这些酶的细胞可以在选择培养基中存活，因为它们未掺入这些嘧啶类似物。此外，由新霉素抗性基因提供的称为g418抗性的选择标记赋予对2-脱氧链霉胺类抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。适用于细胞
融合的各种类型的骨髓瘤细胞是已知的。
[0173]
例如，可以优选使用包括以下细胞的骨髓瘤细胞：
[0174]
p3(p3x63ag8.653)(j.immunol.(1979)123(4)，1548-1550)；
[0175]
p3x63ag8u.1(current topics in microbiology and immunology(1978)81，1-7)；
[0176]
ns-1(c.eur.j.immunol.(1976)6(7)，511-519)；
[0177]
mpc-11(cell(1976)8(3)，405-415)；
[0178]
sp2/0(nature(1978)276(5685)，269-270)；
[0179]
fo(j.immunol.methods(1980)35(1-2)，1-21)；
[0180]
s194/5.xx0.bu.1(j.exp.med.(1978)148(1)，313-323)；
[0181]
r210(nature(1979)277(5692)，131-133)等。
[0182]
免疫细胞和骨髓瘤细胞之间的细胞融合基本上使用已知方法进行，例如，kohler和milstein等人(methods enzymol.(1981)73：3-46)的方法。
[0183]
更具体地，细胞融合可以在例如常规培养基中在细胞融合促进剂的存在下进行。融合促进剂包括，例如，聚乙二醇(peg)和仙台病毒(hvj)。如有需要，还可以添加辅助物质(例如二甲基亚砜)以提高融合效率。
[0184]
免疫细胞与骨髓瘤细胞的比例可以适当确定，并且优选实例包括每一个至十个免疫细胞对应一个骨髓瘤细胞。用于细胞融合的培养基包括，例如，适合骨髓瘤细胞系生长的培养基，例如rpmi1640培养基和mem培养基，以及用于此类细胞培养的其他常规培养基。此外，可以优选地将血清补充物(例如胎牛血清(fcs))添加到培养基中。
[0185]
对于细胞融合，将预定数量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养基中充分混合。然后，以通常30％至60％(w/v)的浓度向其中加入预热至约37℃的peg溶液(例如，平均分子量为约1,000至6,000)。将其轻轻混合以产生期望的融合细胞(杂交瘤)。然后，将上述适当的培养基逐渐加入细胞中，并反复离心以去除上清液。因此，可以去除不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。
[0186]
如此获得的杂交瘤可以通过使用常规选择培养基(例如，hat培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基))培养进行选择。通过在上述hat培养基中继续培养足够的时间段，可以杀死期望杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)。通常，该时间段是数天至数周。然后，通过常规的有限稀释方法筛选并单克隆产生期望抗体的杂交瘤。
[0187]
可以基于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标记使用选择培养基来选择由此获得的杂交瘤。例如，hgprt缺陷细胞或tk缺陷细胞可以通过使用hat培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)进行培养来选择。具体地，当hat敏感的骨髓瘤细胞用于细胞融合时，与正常细胞成功融合的细胞可以在hat培养基中选择性增殖。通过在上述hat培养基中继续培养足够的时间段，可以杀死期望杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)。具体地，通常可以通过培养数天至数周来选择期望的杂交瘤。然后，通过常规的有限稀释方法筛选并单克隆产生期望抗体的杂交瘤。
[0188]
由此制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常规培养基中传代并在液氮中长期保存。
[0189]
通过常规方法培养上述杂交瘤，并且可以从培养上清液制备期望的单克隆抗体。
备选地，向相容的哺乳动物施用杂交瘤并在其中生长，然后从腹水制备单克隆抗体。前一种方法适用于制备高纯度抗体。
[0190]
还可以优选使用由从产生抗体的细胞(例如上述杂交瘤)克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因插入合适的载体中，并将其导入宿主以表达由该基因编码的抗体。例如，vandamme等人(eur.j.biochem.(1990)192(3)，767-775)已经建立了分离抗体基因、将基因插入载体和转化宿主细胞的方法。产生重组抗体的方法也是已知的，如下所述。
[0191]
优选地，本发明提供了编码本发明的抗原结合分子或多特异性抗原结合分子的核酸。本发明还提供了其中导入编码抗原结合分子或多特异性抗原结合分子的核酸的载体，即，包含该核酸的载体。此外，本发明提供了包含核酸或载体的细胞。本发明还提供了通过培养细胞产生抗原结合分子或多特异性抗原结合分子的方法。本发明进一步提供了通过该方法产生的抗原结合分子或多特异性抗原结合分子。
[0192]
例如，从表达抗pdgf-b或抗pdgf-d抗体的杂交瘤细胞制备编码抗pdgf-b或pdgf-d抗体可变区(v区)的cdna。为此，首先从杂交瘤提取总rna。用于从细胞提取mrna的方法包括，例如：
[0193]-胍超速离心法(biochemistry(1979)18(24)，5294-5299)，和
[0194]-agpc方法(anal.biochem.(1987)162(1)，156-159)。
[0195]
提取的mrna可以使用mrna纯化试剂盒(ge healthcare bioscience)等进行纯化。备选地，用于直接从细胞中提取总mrna的试剂盒，例如quickprep mrna纯化试剂盒(ge healthcare bioscience)，也可以商购获得。可以使用此类试剂盒从杂交瘤制备mrna。可以使用逆转录酶从制备的mrna合成编码抗体v区的cdna。可以使用amv逆转录酶第一链cdna合成试剂盒(seikagaku co.)等合成cdna。此外，smart racecdna扩增试剂盒(clontech)和基于pcr的5
′‑
race方法(proc.natl.acad.sci.usa(1988)85(23)，8998-9002；nucleic acids res.(1989)17(8)，2919-2932)可适当用于合成和扩增cdna。在此类cdna合成过程中，可以将下述适当的限制酶位点引入cdna的两个末端。
[0196]
从得到的pcr产物中纯化目标cdna片段，然后将其连接至载体dna。由此构建重组载体并将其导入大肠杆菌等。菌落选择后，可以从形成菌落的大肠杆菌制备期望的重组载体。然后，通过已知方法例如双脱氧核苷酸链终止法检测重组载体是否具有目标cdna核苷酸序列。
[0197]
使用引物以扩增可变区基因的5
′‑
race方法方便地用于分离编码可变区的基因。首先，使用从杂交瘤细胞中提取的rna作为模板，通过cdna合成来构建5
′‑
race cdna文库。可商购获得的试剂盒，例如smart race cdna扩增试剂盒适用于合成5
′‑
race cdna文库。
[0198]
使用制备的5
′‑
race cdna文库作为模板，通过pcr扩增抗体基因。可以根据已知的抗体基因序列设计用于扩增小鼠抗体基因的引物。引物的核苷酸序列根据免疫球蛋白亚类而异。因此，优选使用可商购获得的试剂盒例如iso strip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(roche diagnostics)预先确定亚类。
[0199]
具体地，例如，允许扩增编码γa1、γ2a、γ2b和γ3重链以及κ和λ轻链的基因的引物用于分离小鼠igg编码基因。通常，退火至靠近可变区的恒定区位点的引物用作3
′
侧引物以扩增igg可变区基因。同时，附接至5
′
race cdna文库构建试剂盒的引物被用作5
′
侧引物。
[0200]
由此扩增的pcr产物用于重构由重链和轻链组合组成的免疫球蛋白。可以使用重
构免疫球蛋白的pdgf-b或pdgf-d结合活性作为指标来选择期望的抗体。例如，当目的是分离针对pdgf-b或pdgf-d的抗体时，更优选抗体与pdgf-b或pdgf-d的结合是特异性的。pdgf-b或pdgf-d结合抗体可以例如通过以下步骤进行筛选：
[0201]
(1)使pdgf-b或pdgf-d与包含由从杂交瘤分离的cdna编码的v区的抗体接触；
[0202]
(2)检测抗体与pdgf-b或pdgf-d的结合；
[0203]
(3)选择与pdgf-b或pdgf-d特异性结合的抗体；并且优选地
[0204]
(4)选择对pdgf-b或pdgf-d表现出强结合的抗体。
[0205]
使用结合活性作为指标的优选抗体筛选方法还包括使用噬菌体载体的淘选方法。当从来自表达多克隆抗体的细胞群的重链和轻链亚类文库分离抗体基因时，使用噬菌体载体的筛选方法是有利的。编码重链和轻链可变区的基因可以通过合适的接头序列连接以形成单链fv(scfv)。可以通过将编码scfv的基因插入噬菌体载体中来产生在其表面呈递scfv的噬菌体。噬菌体与目标抗原接触。然后，可以通过收集与抗原结合的噬菌体来分离编码具有目标结合活性的scfv的dna。可以根据需要重复该过程以富集具有期望结合活性的scfv。
[0206]
在分离编码目标抗pdgf-b或抗pdgf-d抗体v区的cdna后，将cdna用识别引入至cdna的两个末端的限制性位点的限制性内切酶消化。优选的限制酶识别并切割在抗体基因的核苷酸序列中以低频率出现的核苷酸序列。此外，优选将产生粘性末端的酶的限制性位点引入载体中以在正确方向插入单拷贝消化片段。编码抗pdgf-b或抗pdgf-d抗体的v区的cdna如上所述经消化，并将其插入合适的表达载体中以构建抗体表达载体。在这种情况下，如果编码抗体恒定区(c区)的基因和编码上述v区的基因框内融合，则获得嵌合抗体。在本文中，“嵌合抗体”是指恒定区的起源与可变区的起源不同。因此，除了小鼠/人异源嵌合抗体之外，人抗体/人异源嵌合(allochimeric)抗体也包括在本发明的嵌合抗体中。嵌合抗体表达载体可以通过将上述v区基因插入已具有恒定区的表达载体中来构建。具体地，例如，可以在携带编码期望抗体恒定区(c区)的dna的表达载体的5
′
侧适当地置入用于切除上述v区基因的限制酶的识别序列。嵌合抗体表达载体通过将用相同限制酶组合消化的两个基因框内融合进行构建。
[0207]
为了产生抗pdgf-b或抗pdgf-d单克隆抗体，将抗体基因插入表达载体，使基因在表达调控区的控制下表达。抗体表达的表达调控区包括，例如，增强子和启动子。此外，可以将合适的信号序列附接至氨基末端，以将表达的抗体分泌到细胞外。同时，可以附接其他适当的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端被切割，并且得到的多肽作为成熟多肽分泌到细胞外。然后，用表达载体转化合适的宿主细胞，获得表达抗pdgf-b或抗pdgf-d抗体编码dna的重组细胞。
[0208]
将编码抗体重链(h链)和轻链(l链)的dna单独插入不同的表达载体以表达抗体基因。具有h链和l链的抗体分子可以通过用其中分别插入h链和l链基因的载体共转染同一宿主细胞进行表达。备选地，可以用其中插入编码h和l链的dna的单表达载体转化宿主细胞(参见wo 94/11523)。
[0209]
有多种已知的宿主细胞/表达载体组合用于通过将分离的抗体基因引入合适的宿主来制备抗体。这些表达系统均适用于分离包括本发明抗体可变区的结构域。用作宿主细胞的合适真核细胞包括动物细胞、植物细胞和真菌细胞。具体地，动物细胞包括，例如，以下细胞。
[0210]
(1)哺乳动物细胞：cho、cos、骨髓瘤细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、hela、vero等；
[0211]
(2)两栖类动物细胞：爪蟾卵母细胞等；和
[0212]
(3)昆虫细胞：sf9、sf21、tn5等。
[0213]
另外，作为植物细胞，已知使用源自烟草属(例如烟草(nicotianatabacum))的细胞的抗体基因表达系统。愈伤组织培养细胞可以适当地用于转化植物细胞。
[0214]
此外，以下细胞可用作真菌细胞：
[0215]
酵母菌：酵母菌属(例如酿酒酵母)，和毕赤酵母属(例如毕赤酵母(pichia pastoris))；以及
[0216]
丝状真菌：曲霉属，例如黑曲霉(aspergillus niger)。
[0217]
此外，还已知利用原核细胞的抗体基因表达系统。例如，当使用细菌细胞时，大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞等可适当地用于本发明。通过转染将携带目标抗体基因的表达载体导入这些细胞中。体外培养转染的细胞，并可以从转化细胞培养物制备期望抗体。
[0218]
除上述宿主细胞外，还可以使用转基因动物产生重组抗体。即，可以从导入了编码目标抗体的基因的动物中获得抗体。例如，抗体基因可以通过将其框内插入编码特异地产生并分泌到乳汁中的蛋白的基因中而构建为融合基因。例如，可以使用山羊β-酪蛋白等作为分泌至乳汁中的蛋白。将含有包含导入的抗体基因的融合基因的dna片段注射到山羊胚胎中，然后将该胚胎导入雌性山羊中。期望抗体可以作为与来自胚胎受体山羊所生的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁的乳蛋白融合的蛋白质获得。此外，为了增加由转基因山羊产生的含有期望抗体的乳汁量，可以根据需要向转基因山羊施用激素(ebert，km等人，bio/technology(1994)12(7)，699-702)。
[0219]
产牛人源化抗体的方法
[0220]
当向人施用本文所述的抗原结合分子时，源自经人工修饰以降低对人的异源抗原性等的基因重组抗体的结构域可适当用作抗原结合分子的结构域，包括抗体可变区。此类基因重组抗体包括，例如，人源化抗体。这些修饰抗体通过已知的方法适当产生。此外，通常可以通过cdr移植将某种抗体的结合特异性引入到另一抗体。
[0221]
具体地，通过将非人动物抗体(例如小鼠抗体)的cdr移植到人抗体制备的人源化抗体是已知的。用于获得此类人源化抗体的基因工程技术也是公知的。具体地，例如，已知重叠延伸pcr作为将小鼠抗体cdr移植到人fr的方法。在重叠延伸pcr中，将编码待移植的小鼠抗体cdr的核苷酸序列添加至用于合成人抗体fr的引物中。制备用于四个fr中的每一个的引物。通常认为，在将小鼠cdr移植到人fr时，选择与小鼠fr具有高同一性的人fr有利于维持cdr功能。即，通常优选使用包含与待移植的小鼠cdr相邻的fr的氨基酸序列具有高同一性的氨基酸序列的人fr。
[0222]
待连接的核苷酸序列被设计成使它们在框内彼此连接。人fr使用各自的引物单独合成。结果，获得小鼠cdr编码dna附接于单个fr编码dna的产物。每个产物的编码小鼠cdr的核苷酸序列被设计为彼此重叠。然后，进行互补链合成反应，以便将使用人抗体基因为模板合成的产物的重叠cdr区退火。通过该反应，人fr通过小鼠cdr序列连接。
[0223]
其中连接了三个cdr和四个fr的全长v区基因使用退火至其5
′
或3
′
末端的引物进行扩增，这些引物添加有合适的限制酶识别序列。人源化抗体的表达载体可以通过将如上所述获得的dna和编码人抗体c区的dna插入表达载体使得它们框内连接来产生。在将重组
载体转染到宿主中以建立重组细胞后，培养重组细胞，并表达编码人源化抗体的dna以在细胞培养中产生人源化抗体(参见欧洲专利公开号ep 239400和国际专利公开号wo 1996/002576)。
[0224]
通过定性或定量地测量和评价如上所述产生的人源化抗体的抗原结合活性，可以适当地选择当通过cdr连接时允许cdr形成有利的抗原结合位点的人抗体fr。fr中的氨基酸残基可以根据需要进行置换，从而使重构人抗体的cdr形成合适的抗原结合位点。例如，可以通过应用用于将小鼠cdr移植到人fr中的pcr方法将氨基酸序列突变引入fr中。更具体地，可以将部分核苷酸序列突变引入退火至fr的引物中。将核苷酸序列突变引入使用这些引物合成的fr中。可以通过上述方法通过测量和评价氨基酸置换的突变抗体结合抗原的活性来选择具有期望特征的突变fr序列(sato，k.等人，cancer res.(1993)53：851-856)
[0225]
产生人抗体的方法。
[0226]
备选地，可以通过dna免疫对具有完整人抗体基因库的转基因动物进行免疫来获得期望的人抗体(参见wo 1993/012227；wo 1992/003918；wo 1994/002602；wo 1994/025585；wo 1996/034096；wo 1996/033735)。
[0227]
此外，使用人抗体文库通过淘选制备人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的v区通过噬菌体展示方法在噬菌体表面表达为单链抗体(scfv)。可以选择表达结合抗原的scfv的噬菌体。可以通过分析所选噬菌体的基因来确定编码与抗原结合的人抗体v区的dna序列。确定与抗原结合的scfv的dna序列。通过将框内v区序列与期望的人抗体的c区序列融合，并将其插入合适的表达载体中来制备表达载体。将表达载体导入适于表达的细胞中，例如上述细胞。人抗体可以通过在细胞中表达人抗体编码基因产生。这些方法是已知的(参见wo 1992/001047；wo 1992/020791；wo 1993/006213；wo 1993/011236；wo 1993/019172；wo 1995/001438；wo 1995/015388)。
[0228]
载体
[0229]
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入已将其导入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
[0230]
宿主细胞
[0231]
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，包括转化的原代细胞和由其衍生的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与其亲代细胞不完全相同，并且可能包含突变。具有与最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代包括在本文中。
[0232]
表位
[0233]“表位”意指抗原中的抗原决定簇，并且是指与本文公开的抗原结合分子或抗体的抗原结合结构域结合的抗原位点。因此，例如，可以根据其结构定义表位。备选地，还可以根据识别该表位的抗原结合分子或抗体的抗原结合活性来定义表位。当抗原是肽或多肽时，表位可以由形成表位的氨基酸残基指定。备选地，当表位是糖链时，可以通过其特定的糖链结构来指定表位。
[0234]
线性表位是包含其一级氨基酸序列被识别的表位的表位。此类线性表位在其特定序列中通常包含至少三个且最常见至少五个，例如约8至10个或6至20个氨基酸。
[0235]
与线性表位相反，“构象表位”是其中包含表位的一级氨基酸序列不是识别表位的唯一决定因素(例如，构象表位的一级氨基酸序列不一定被表位定义抗体识别)的表位。与线性表位相比，构象表位可以包含更多数目的氨基酸。构象表位识别抗原结合结构域识别肽或蛋白质的三维结构。例如，当蛋白质分子折叠并形成三维结构时，形成构象表位的氨基酸和/或多肽主链被对齐，并且使得表位可被抗原结合结构域识别。确定表位构象的方法包括，例如，x射线晶体学、二维核磁共振、位点特异性自旋标记和电子顺磁共振，但不限于此。参见，例如，分子生物学方法中的表位作图方案(epitope mapping protocols in methods in molecular biology)(1996)，第66卷，morris(编辑)。
[0236]
以下描述用于评估通过包含抗pdgf-b或抗pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体结合的表位的方法的实例。根据以下实例，还可以适当地实施用于评估通过包含针对pdgf-b或pdgf-d以外的抗原的抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体结合的表位的方法。
[0237]
例如，包含抗pdgf-b或抗pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体是否识别pdgf-b或pdgf-d分子中的线性表位，例如可以如下确认。为了上述目的，合成包含pdgf-b或pdgf-d的氨基酸序列的线性肽。肽可以化学合成或使用编码氨基酸序列的pdgf-b或pdgf-dcdna区域通过基因工程技术获得。然后，评估含有抗pdgf-b或抗pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体对包含氨基酸序列的线性肽的结合活性。例如，固定的线性肽可用作elisa中的抗原，以评价多肽复合物对肽的结合活性。备选地，可以基于线性肽抑制抗原结合分子或抗体与pdgf-b或pdgf-d的结合的水平来评估对线性肽的结合活性。这些测试可以证明抗原结合分子或抗体对线性肽的结合活性。
[0238]
包含抗pdgf-b或抗pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体是否识别构象表位可以如下评估。包含抗pdgf-b或抗pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体在与pdgf-b或pdgf-d接触时与其强结合但基本上不结合包含pdgf-b或pdgf-d氨基酸序列的固定的线性肽时，可以确定其识别构象表位。在本文中，“基本上不结合”意指与对pdgf-b或pdgf-d的结合活性相比，结合活性为80％或更低，通常为50％或更低，优选为30％或更低，特别优选为15％或更低
[0239]
用于测定包含抗pdgf-b或抗pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体对pdgf-b或pdgf-d的结合活性的方法包括，例如，抗体：实验室手册(ed harlow，david lane，cold spring harbor laboratory(1988)359-420)中描述的方法。
[0240]
在elisa形式中，可以通过比较由酶促反应生成的信号水平来定量评估包含抗pdgf-b或抗pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体对pdgf-b或pdgf-d的结合活性。具体地，向其上固定有pdgf-b或pdgf-d的elisa板添加包含抗pdgf-b或抗pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体。然后，使用识别测试抗原结合分子或抗体的酶标抗体检测与pdgf-b或pdgf-d结合的测试抗原结合分子或抗体。备选地，当使用facs时，制备测试抗原结合分子或抗体的系列稀释，并且可以确定pdgf-b或pdgf-d的抗体结合效价以比较测试抗原结合分子或抗体对pdgf-b或pdgf-d的结合活性。
[0241]
包含抗pdgf-b或pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体是否与另一
抗原结合分子或抗体共享共同的表位，可以基于两个抗原结合分子或抗体之间对相同表位的竞争进行评估。抗原结合分子或抗体之间的竞争可以通过交叉阻断测定等进行检测。例如，竞争性elisa测定是优选的交叉阻断测定。
[0242]
具体地，在交叉阻断测定中，固定在微量滴定板孔中的pdgf-b或pdgf-d蛋白在存在或不存在候选竞争抗原结合分子或抗体的情况下进行预孵育，然后向其中添加测试抗原结合分子或抗体。孔中与pdgf-b或pdgf-d蛋白结合的测试抗原结合分子或抗体的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子或抗体的结合能力间接相关。即，竞争抗原结合分子或抗体对相同表位的亲和力越大，测试抗原结合分子或抗体对pdgf-b或pdgf-d蛋白包被的孔的结合活性越低。
[0243]
通过预先标记抗原结合分子或抗体，可以容易地确定经由pdgf-b或pdgf-d蛋白与孔结合的测试抗原结合分子或抗体的量。例如，使用抗生物素蛋白/过氧化物酶偶联物和合适的底物测量生物素标记的抗原结合分子或抗体。特别地，使用酶标记(例如过氧化物酶)的交叉阻断测定被称为“竞争性elisa测定”。抗原结合分子或抗体还可以用其他能够检测或测量的标记物质进行标记。具体地，放射性标记、荧光标记等是已知的。
[0244]
当与在不存在竞争抗原结合分子或抗体的情况下进行的对照实验中的结合活性相比，候选竞争抗原结合分子或抗体可以阻断包含抗pdgf-b或pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体的结合至少20％，优选至少20至50％，以及更优选至少50％时，测试抗原结合分子或抗体被确定为基本上与竞争抗原结合分子或抗体结合相同的表位，或竞争与相同表位的结合。
[0245]
当包含抗pdgf-b或pdgf-d抗原结合结构域的测试抗原结合分子或抗体所结合的表位结构已被确定时，测试和对照抗原结合分子或抗体是否共享共同的表位可以通过比较两种抗原结合分子或抗体对通过将氨基酸突变引入形成表位的肽而制备的肽的结合活性进行评估。
[0246]
为了测量上述结合活性，例如，以上述elisa形式比较测试和对照抗原结合分子或抗体对引入突变的线性肽的结合活性。除了elisa方法，对结合在柱上的突变肽的结合活性可以通过在柱中使测试和对照抗原结合分子或抗体流动，然后对洗脱液中洗脱的抗原结合分子或抗体进行定量来确定。将突变肽吸附至柱上(例如以gst融合肽的形式)的方法是已知的。
[0247]
特异性
[0248]“特异性”意指与一个或多个结合配偶体特异性结合的分子不显示与配偶体以外的分子的任何显著结合。此外，当抗原结合结构域对抗原中包含的多个表位中的特定表位具有特异性时，也使用“特异性”。当抗原结合结构域所结合的表位包含在多个不同的抗原中时，包含抗原结合结构域的抗原结合分子可以与具有该表位的各种抗原结合。
[0249]
单特异性抗原结合分子
[0250]
术语“单特异性抗原结合分子”用于指仅与一种类型的抗原特异性结合的抗原结合分子。单特异性抗原结合分子的有利实例是包含单一类型的抗原结合结构域的抗原结合分子。单特异性抗原结合分子可以包含单一抗原结合结构域或多个相同类型的抗原结合结构域。单特异性抗原结合分子的有利实例是单特异性抗体。当单特异性抗原结合分子为igg形式的单特异性抗体时，该单特异性抗体包含两个具有相同抗原结合特异性的抗体可变片
段。
[0251]
抗体片段
[0252]“抗体片段”是指完整抗体除外但包含完整抗体的一部分并与完整抗体所结合的抗原结合的分子。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab
′
、fab
′‑
sh、f(ab
′
)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0253]
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有包含本文定义的fc区的重链的抗体。
[0254]
可变片段(fv)
[0255]
在本文中，术语“可变片段(fv)”是指由一对抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)组成的抗体衍生的抗原结合结构域的最小单位。在1988年，skerra和pluckthun发现通过在细菌信号序列下游插入抗体基因并诱导该基因在大肠杆菌中表达，可以从大肠杆菌周质级分制备均质活性抗体(science(1988)240(4855)，1038-1041)。在由周质级分制备的fv中，vh以结合抗原的方式与vl缔合。
[0256]
scfv、单链抗体和sc(fv)2[0257]
在本文中，术语“scfv”、“单链抗体”和“sc(fv)
2”均指包含源自重链和轻链的可变区(但不包括恒定区)的单一多肽链的抗体片段。通常，单链抗体还在vh和vl结构域之间包含多肽接头，这能够形成被认为允许抗原结合的期望结构。pluckthun在“单克隆抗体药理学，第113卷，rosenburg和moore，编辑，springer-verlag，new york，269-315(1994)”中详细讨论了单链抗体。另见国际专利公开wo 1988/001649；美国专利号4,946,778和5,260,203。在特定的实施方案中，单链抗体可以是双特异性的和/或人源化的。
[0258]
scfv是抗原结合结构域，其中形成fv的vh和vl通过肽接头连接在一起(proc.natl.acad.sci.u.s.a.(1988)85(16)，5879-5883)。vh和vl可以通过肽接头保持紧密接近。
[0259]
sc(fv)2是单链抗体，其中四个可变区，即两个vl和两个vh，通过接头(例如肽接头)连接以形成单链(j immunol.methods(1999)231(1-2)，177-189)。两个vh和两个vl可以源自不同的单克隆抗体。此类sc(fv)2优选包括，例如，识别单一抗原中存在的两个表位的双特异性sc(fv)2，如journal of immunology(1994)152(11)，5368-5374中所公开的。sc(fv)2可以通过本领域技术人员已知的方法产生。例如，sc(fv)2可以通过接头(例如肽接头)连接scfv来产生。
[0260]
在本文中，形成sc(fv)2的抗原结合结构域的形式包括其中两个vh单元和两个vl单元从单链多肽的n末端开始以vh、vl、vh和vl的顺序([vh]-接头-[vl]-接头-[vh]-接头-[vl])排列的抗体。两个vh单元和两个vl单元的顺序不限于上述形式，它们可以以任何顺序排列。以下列出了形式的实例。
[0261]
[vl]-接头-[vh]-接头-[vh]-接头-[vl]
[0262]
[vh]-接头-[vl]-接头-[vl]-接头-[vh]
[0263]
[vh]-接头-[vh]-接头-[vl]-接头-[vl]
[0264]
[vl]-接头-[vl]-接头-[vh]-接头-[vh]
[0265]
[vl]-接头-[vh]-接头-[vl]-接头-[vh]
[0266]
sc(fv)2的分子形式还在wo 2006/132352中详细描述。根据这些描述，本领域技术
人员可以适当地制备期望的sc(fv)2以产生本文公开的多肽复合物。
[0267]
此外，本发明的抗原结合分子或抗体可以与运载体聚合物(例如peg)或有机化合物(例如抗癌剂)缀合。备选地，优选将糖链加成(addition)序列插入抗原结合分子或抗体，使得糖链产生期望效果。
[0268]
用于连接抗体可变区的接头包括可以通过基因工程引入的任意肽接头、合成接头和例如protein engineering，9(3)，299-305，1996中公开的接头。然而，在本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限制，并且可以根据目的由本领域技术人员合适地选择。长度优选为5个氨基酸或更多(没有特别限定，上限通常为30个氨基酸或更少，优选为20个氨基酸或更少)，特别优选为15个氨基酸。当sc(fv)2包含三个肽接头时，它们的长度可能相同或不同。
[0269]
例如，此类肽接头包括：
[0270]
ser
[0271]
gly ser
[0272]
gly gly ser
[0273]
ser gly gly
[0274]
gly gly gly ser(seq id no：33)
[0275]
ser gly gly gly(seq id no：34)
[0276]
gly gly gly gly ser(seq id no：35)
[0277]
ser gly gly gly gly(seq id no：36)
[0278]
gly gly gly gly gly ser(seq id no：37)
[0279]
ser gly gly gly gly gly(seq id no：38)
[0280]
gly gly gly gly gly gly ser(seq id no：39)
[0281]
ser gly gly gly gly gly gly(seq id no：40)
[0282]
(gly gly gly gly ser(seq id no：35))n
[0283]
(ser gly gly gly gly(seq id no：36))n
[0284]
其中n是1或更大的整数。本领域技术人员可以根据目的相应地选择肽接头的长度或序列。
[0285]
合成接头(化学交联剂)常规用于交联肽，并且实例包括：
[0286]
n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，
[0287]
二琥珀酰亚胺辛二酸酯(dss)，
[0288]
双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(bs3)，
[0289]
二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(dsp)，
[0290]
二硫代双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯)(dtssp)，
[0291]
乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(egs)，
[0292]
乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(磺基-egs)，
[0293]
酒石酸二琥珀酰亚胺酯(dst)，酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-dst)，
[0294]
双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(bsocoes)，和
[0295]
双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-bsocoes)。
[0296]
这些交联剂可商购获得。
640(1997)；hinton等人，j.biol.chem.279(8)：6213-6216(2004)；wo 2004/92219(hinton等人))。
[0307]
人fcrn高亲和力结合多肽与人fcrn的体内结合和血浆半衰期可以在，例如，转基因小鼠或表达人fcrn的转染人细胞系中，或在施用具有变体fc区的多肽的灵长类动物中进行测定。wo 2000/42072(presta)描述了与fcr结合增加或减少的抗体变体。另见，例如，shields等人j.biol.chem.9(2)：6591-6604(2001)。
[0308]
fcγ受体
[0309]
fcγ受体是指能够与单克隆igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc结构域结合的受体，并且包括属于基本上由fcγ受体基因编码的蛋白家族的所有成员。在人中，该家族包括fcγri(cd64)，包括同工型fcγria、fcγrib和fcγric；fcγrii(cd32)，包括同工型fcγriia(包括同种异型h131和r131)、fcγriib(包括fcγriib-1和fcγriib-2)和fcγriic；以及fcγriii(cd16)，包括同工型fcγriiia(包括同种异型v158和f158)和fcγriiib(包括同种异型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)；以及所有未鉴定的人fcγ受体、fcγ受体同工型及其同种异型。然而，fcγ受体不限于这些实例。不限于此，fcγ受体包括源自人、小鼠、大鼠、兔和猴的那些。fcγ受体可以源自任何生物体。小鼠fcγ受体包括但不限于fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)和fcγriii-2(cd16-2)，以及所有未鉴定的小鼠fcγ受体、fcγ受体同工型及其同种异型。这种优选的fcγ受体包括例如人fcγri(cd64)、fcγriia(cd32)、fcγriib(cd32)、fcγriiia(cd16)和/或fcγriiib(cd 16)。fcγri的多核苷酸序列和氨基酸序列分别见seq id no：28(nm_000566.3)和23(np_000557.1)；fcγriia的多核苷酸序列和氨基酸序列分别见seq id no：29(bc020823.1)和24(aah20823.1)；fcγriib的多核苷酸序列和氨基酸序列分别见seq id no：30(bc146678.1)和25(aai46679.1)；fcγriiia的多核苷酸序列和氨基酸序列分别见seq id no：31(bc033678.1)和26(aah33678.1)；以及fcγriiib的多核苷酸序列和氨基酸序列分别见seq id no：32(bc128562.1)和27(aai28563.1)(refseq登录号在各自括号中示出)。fcγ受体是否对单克隆igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc结构域具有结合活性可以通过alpha筛选(放大发光邻近均相测定)、基于表面等离子体共振(spr)的biacore方法，以及除了上述facs和elisa形式之外的其他方法(proc.natl.acad.sci.usa(2006)103(11)，4005-4010)进行评估。
[0310]
同时，“fc配体”或“效应配体”是指与抗体fc结构域结合形成fc/fc配体复合物的分子，优选多肽。该分子可以源自任何生物体。fc配体与fc的结合优选诱导一种或多种效应子功能。此类fc配体包括但不限于fc受体、fcγ受体、fcα受体、fcβ受体、fcrn、c1q和c3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白a、葡萄球菌蛋白g和病毒fcγ受体。fc配体还包括fc受体同源物(fcrh)(davis等人，(2002)immunologicalreviews190，123-136)，它们是与fcγ受体同源的fc受体家族。fc配体还包括与fc结合的未鉴定分子。
[0311]
fcγ受体结合活性
[0312]
fc结构域与任何fcγ受体fcγri、fcγriia、fcγriib、fcγriiia和/或fcγriiib的受损结合活性可以通过使用上述facs和elisa形式，以及alpha筛选(放大发光邻近均相测定)和基于表面等离子体共振(spr)的biacore方法(proc.natl.acad.sci.usa(2006)103(11)，4005-4010)进行评估。
[0313]
alpha筛选通过alpha技术基于下述原理使用两种类型的珠进行：供体珠和受体珠。只有当两种珠通过连接至供体珠和受体珠的分子之间的生物相互作用紧密接近时，才可检测到发光信号。在激光束的激发下，供体珠中的光敏剂将珠周围的氧转化为激发态的单线态氧。当单线态氧在供体珠周围扩散并到达紧密接近的受体珠时，在受体珠内诱导化学发光反应。该反应最终导致光发射。如果与供体珠连接的分子不与与受体珠连接的分子相互作用，则供体珠产生的单线态氧不会到达受体珠并且不会发生化学发光反应。
[0314]
例如，生物素标记的抗原结合分子或抗体被固定在供体珠上，并且谷胱甘肽s-转移酶(gst)标记的fcγ受体被固定在受体珠上。在不存在包含竞争性突变fc结构域的抗原结合分子或抗体的情况下，fcγ受体与包含野生型fc结构域的抗原结合分子或抗体相互作用，结果诱导520至620nm的信号。当具有未标记的突变fc结构域的抗原结合分子或抗体与包含野生型fc结构域的抗原结合分子或抗体竞争与fcγ受体的相互作用时，由于竞争，将观察到荧光减少，并且可以对减少进行定量，从而确定相对结合亲和力。使用磺基-nhs-生物素等将抗原结合分子或抗体(例如抗体)生物素化的方法是已知的。将gst标签添加至fcγ受体的合适方法包括涉及以下步骤的方法：将编码fcγ受体的基因与gst框内融合，使用导入携带融合基因的载体的细胞来表达融合基因，然后使用谷胱甘肽柱纯化融合蛋白。可以优选地，例如，通过使用软件(例如graphpad prism(graphpad；san diego))基于非线性回归分析拟合至单位点竞争模型来分析诱导信号。
[0315]
观察它们相互作用的物质中的一种作为配体固定在传感器芯片的金薄层上。当光线照射到传感器芯片的背面，从而在金薄层和玻璃之间的界面发生全反射时，反射光的强度在某个部位部分减弱(spr信号)。用于观察它们相互作用的另一种物质作为分析物注射至传感器芯片的表面。当分析物与配体结合时，固定的配体分子的质量增加。这改变传感器芯片表面上溶剂的折射率。折射率的变化导致spr信号发生位置偏移(相反，解离将信号移回原始位置)。在biacore系统中，上述偏移量(即传感器芯片表面上的质量变化)绘制在垂直轴上，因此质量随时间的变化显示为测量数据(传感图)。动力学参数(缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd))由传感图曲线确定，并且亲和力(kd)由这两个常数之间的比率确定。抑制测定优选用于biacore方法中。这种抑制测定的实例描述于proc.natl.acad.sci.usa(2006)103(11)，4005-4010中。
[0316]
具有降低的fcγ受体结合活性的fc区
[0317]
在本文中，“降低的fcγ受体结合活性”是指，例如，基于上述分析方法，与对照抗原结合分子或抗体的竞争活性相比，测试抗原结合分子或抗体的竞争活性为50％或更小，优选45％或更小、40％或更小、35％或更小、30％或更小、20％或更小、或15％或更小，特别优选10％或更小、9％或更小、8％或更小、7％或更小、6％或更小、5％或更小、4％或更小、3％或更小、2％或更小、或1％或更小。
[0318]
包含单克隆igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc结构域的抗原结合分子或抗体可以适当地用作对照抗原结合分子或抗体。fc结构域的结构见seq id no：19(将a添加至refseq登录号aac82527.1的n末端)、20(将a添加至refseq登录号aab59393.1的n末端)、21(refseq登录号caa27268.1)和22(将a添加至refseq登录号aab59394.1的n末端)。此外，当包含特定同种型抗体的fc结构域突变体的抗原结合分子或抗体用作测试物质时，使用包含相同同种型的fc结构域的抗原结合分子或抗体作为对照，评估突变体的突变对fcγ受体结合活性的
影响。如上所述，适当制备包含其fcγ受体结合活性已被判断为降低的fc结构域突变体的抗原结合分子或抗体。
[0319]
此类已知突变体包括，例如，具有氨基酸231a-238s(eu编号)缺失的突变体(wo 2009/011941)，以及突变体c226s、c229s、p238s、(c220s)(j.rheumatol(2007)34，11)；c226s和c229s(hum.antibod.hybridomas(1990)1(1)，47-54)；c226s、c229s、e233p、l234v和l235a(blood(2007)109，1185-1192)。
[0320]
具体地，优选的抗原结合分子或抗体包括含有fc结构域的那些，其中所述fc结构域在形成特定同种型抗体的fc结构域的氨基酸中具有选自以下氨基酸位置的至少一个氨基酸突变(例如置换)：220，226，229，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，264，265，266，267，269，270，295，296，297，298，299，300，325，327，328，329，330，331或332(eu编号)。fc结构域来源的抗体的同种型没有特别限制，可以使用源自单克隆igg1、igg2、igg3或igg4抗体的适当的fc结构域。优选使用源自igg1抗体的fc结构域。
[0321]
优选的抗原结合分子或抗体包括例如含有fc结构域的那些，其中所述fc结构域在形成igg1抗体fc结构域的氨基酸中具有以下所示的任一置换，其位置根据eu编号指定(每个编号代表eu编号中氨基酸残基的位置；并且数字前的单字母氨基酸符号代表置换前的氨基酸残基，而数字后的单字母氨基酸符号代表置换后的氨基酸残基)：
[0322]
(a)l234f、l235e、p331s；
[0323]
(b)c226s、c229s、p238s；
[0324]
(c)c226s、c229s；或
[0325]
(d)c226s、c229s、e233p、l234v、l235a；
[0326]
以及具有fc结构域的那些，其中所述fc结构域在第231至238位处具有氨基酸序列缺失。
[0327]
此外，优选的抗原结合分子或抗体还包括包含具有如下所示的任一置换的fc结构域的那些，其位置根据形成igg2抗体的fc结构域的氨基酸中的eu编号进行指定：
[0328]
(e)h268q、v309l、a330s和p331s；
[0329]
(f)v234a；
[0330]
(g)g237a；
[0331]
(h)v234a和g237a；
[0332]
(i)a235e和g237a；或
[0333]
(j)v234a、a235e和g237a。每个数字代表氨基酸残基在eu编号中的位置；并且数字前的单字母氨基酸符号代表置换前的氨基酸残基，而数字后的单字母氨基酸符号代表置换后的氨基酸残基。
[0334]
此外，优选的抗原结合分子或抗体还包括包含具有如下所示的任一置换的fc结构域的那些，其位置根据形成igg3抗体的fc结构域的氨基酸中的eu编号进行指定：
[0335]
(k)f241a；
[0336]
(l)d265a；或
[0337]
(m)v264a。每个数字代表氨基酸残基在eu编号中的位置；并且数字前的单字母氨基酸符号代表置换前的氨基酸残基，而数字后的单字母氨基酸符号代表置换后的氨基酸残基。
[0338]
此外，优选的抗原结合分子或抗体还包括包含具有如下所示的任一置换的fc结构域的那些，其位置根据形成igg4抗体的fc结构域的氨基酸中的eu编号进行指定：
[0339]
(n)l235a、g237a和e318a；
[0340]
(o)l235e；或
[0341]
(p)f234a和l235a。每个数字代表氨基酸残基在eu编号中的位置；并且数字前的单字母氨基酸符号代表置换前的氨基酸残基，而数字后的单字母氨基酸符号代表置换后的氨基酸残基。
[0342]
其他优选的抗原结合分子或抗体包括，例如，包含fc结构域的那些，其中在形成iggl抗体fc结构域的氨基酸中第233、234、235、236、237、327、330或331位(eu编号)的任何氨基酸被相应igg2或igg4中eu编号中相应位置的氨基酸置换。
[0343]
优选的抗原结合分子或抗体还包括，例如，包含fc结构域的那些，其中在形成iggl抗体fc结构域的氨基酸中第234、235和297位(eu编号)的任一个或多个氨基酸被其他氨基酸置换。置换后的氨基酸类型没有特别限制；然而，特别优选包含其中第234、235和297位的任一个或多个氨基酸被丙氨酸置换的fc结构域的抗原结合分子或抗体。
[0344]
优选的抗原结合分子或抗体还包括，例如，包含fc结构域的那些，其中在形成igg1抗体fc结构域的氨基酸中第265位(eu编号)的氨基酸被另一氨基酸置换。置换后的氨基酸类型没有特别限制；然而，特别优选包含其中第265位的氨基酸被丙氨酸置换的fc结构域的抗原结合分子或抗体。
[0345]
与pdgf-b结合的抗原结合结构域
[0346]
如本文所用，短语“与pdgf-b结合的抗原结合结构域”或“抗pdgf-b抗原结合结构域”是指特异性结合上述pdgf-b蛋白或者pdgf-b蛋白的部分肽的全部或部分的抗原结合结构域。
[0347]
在某些实施方案中，与pdgf-b结合的抗原结合结构域包含抗体可变区(抗体轻链和重链可变区(vl和vh))。包含抗体轻链和重链可变区的结构域的合适实例包括“单链fv(scfv)”、“单链抗体”、“fv”、“单链fv2(scfv2)”、“fab”、“f(ab
′
)
2”等。在具体实施方案中，与pdgf-b结合的抗原结合结构域包含抗体可变片段。包含抗体可变片段的结构域可以由一种或多种抗体的可变结构域提供。
[0348]
在某些实施方案中，与pdgf-b结合的抗原结合结构域包含抗pdgf-b抗体的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，与pdgf-b结合的抗原结合结构域包含fab结构。
[0349]
优选地，抗pdgf-b抗体包含：包含如表a中所述的(h链可变区的)氨基酸序列的h链和包含如表a中所述的(l链可变区的)氨基酸序列的l链。
[0350]
在具体实施方案中，与pdgf-b结合的抗原结合结构域包含下表a中所示的抗体可变片段中的任一种。
[0351]
(表a)与pdgf-b结合的抗原结合结构域中的hvr(cdr)或vh、vl的序列
[0352][0353]
在具体实施方案中，与pdgf-b结合的抗原结合结构域包含与表a中所示的任一抗体可变片段竞争结合人pdgf-b的抗体可变片段。
[0354]
备选地，与pdgf-b结合的抗原结合结构域包含与上述抗体可变片段中的任一种竞争结合人pdgf-b的抗体可变片段。备选地，与pdgf-b结合的抗原结合结构域包含结合任一上述抗体可变片段所结合的人pdgf-b上相同表位的抗体可变片段。
[0355]
与pdgf-d结合的抗原结合结构域
[0356]
如本文所用，短语“与pdgf-d结合的抗原结合结构域”或“抗pdgf-d抗原结合结构域”是指特异性结合上述pdgf-d蛋白或者pdgf-d蛋白的部分肽的全部或部分的抗原结合结构域。
[0357]
在某些实施方案中，与pdgf-d结合的抗原结合结构域包含抗体可变区(抗体轻链和重链可变区(vl和vh))。包含抗体轻链和重链可变区的结构域的合适实例包括“单链fv(scfv)”、“单链抗体”、“fv”、“单链fv2(scfv2)”、“fab”、“f(ab
′
)
2”等。在具体实施方案中，与pdgf-d结合的抗原结合结构域包含抗体可变片段。包含抗体可变片段的结构域可以由一种或多种抗体的可变结构域提供。
[0358]
在某些实施方案中，与pdgf-d结合的抗原结合结构域包含抗pdgf-d抗体的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，与pdgf-d结合的抗原结合结构域包含fab结构。
[0359]
优选地，抗pdgf-d抗体包含：包含如表b中所述的(h链可变区的)氨基酸序列的h链和包含如表b中所述的(l链可变区的)氨基酸序列的l链。
[0360]
在具体实施方案中，与pdgf-d结合的抗原结合结构域包含下表b中所示的抗体可变片段中的任一种。
[0361]
(表b)与pdgf-d结合的抗原结合结构域中的hvr(cdr)或vh、vl的序列
[0362][0363]
在具体实施方案中，与pdgf-d结合的抗原结合结构域包含与表b中所示的任一抗体可变片段结合人pdgf-d内相同表位的抗体可变片段。
[0364]
备选地，与pdgf-d结合的抗原结合结构域包含与上述抗体可变片段中的任一种竞争结合人pdgf-d的抗体可变片段。备选地，与pdgf-d结合的抗原结合结构域包含结合任一上述抗体可变片段所结合的人pdgf-d上相同表位的抗体可变片段。
[0365]
另一方面，本发明进一步涉及特异性结合pdgf-d并阻断其与神经纤毛蛋白1(nrp1)相互作用的抗原结合分子。nrp1与pdgf-d结合并且是pdgf-d-pdgfr-β信号传导中的共同受体(muhl，lars，等人，j cell sci130.8(2017)：1365-1378)。在一个实施方案中，抗原结合分子是一种抗体，其特异性结合pdgf-d并阻断/抑制其与神经纤毛蛋白1(nrp1)的相互作用并且还阻断/抑制pdgf-d与pdgfr的结合，从而抑制pdgf-d诱导的信号传导。与不能阻断nrp1-pdgf-d相互作用的抗pdgf-d抗体相比，预期此类抗体对pdgf-d介导的信号传导的抑制作用增强，用作用于治疗/预防pdgf-d介导的疾病/病况的更有效的抗pdgf-d抗体。获得与pdgf-d特异性结合并阻断/抑制其与nrp1相互作用以及阻断/抑制pdgf-d与pdgfr结合的抗体的方法是通过已知的抗体免疫随后使用公知的方法例如elisa、octet、biacore和/或ecl等评估和筛选nrp1-pdgf-d相互作用的抑制而获得的。
[0366]
多特导性抗原结合分子
[0367]“多特异性抗原结合分子”是指与多于一种抗原特异性结合的抗原结合分子。在有利的实施方案中，本发明的多特异性抗原结合分子包含两个或更多个抗原结合结构域，并且不同的抗原结合结构域与不同的抗原特异性结合。
[0368]
本发明的多特异性抗原结合分子包含与pdgf-b结合的第一抗原结合结构域和与pdgf-b结合的第二抗原结合结构域。可以使用选自上文“与pdgf-b结合的抗原结合结构域”中所述的那些的与pdgf-b结合的抗原结合结构域和选自上文“与pdgf-d结合的抗原结合结构域”中所述的那些的与pdgf-d结合的抗原结合结构域的组合。
[0369]
例如，第一抗原结合结构域包含抗体重链和轻链可变区，和/或第二抗原结合结构域包含抗体重链和轻链可变区。备选地，第一抗原结合结构域包含抗体可变片段，和/或第二抗原结合结构域包含抗体可变片段。备选地，第一抗原结合结构域包含fab结构，和/或第二抗原结合结构域包含fab结构。
[0370]
在某些实施方案中，本发明提供了多特异性抗原结合分子，其包含：包含与pdgf-b结合的抗体可变片段的第一抗原结合结构域，和包含与pdgf-d结合的抗体可变片段的第二抗原结合结构域。在某些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包含与pdgf-b结合的第一抗原结合结构域、与pdgf-d结合的第二抗原结合结构域和包含fc区的第三结构域，该fc区具有降低的fcγ受体结合活性。与igg1、igg2、igg3或igg4抗体的fc结构域相比，fc区可以具有降低的fcγ受体结合活性。
[0371]
在某些实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其包含与人pdgf-b结合的第一抗体可变片段和与人pdgf-d结合的第二抗体可变片段。在某些实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其包含与人pdgf-b结合的第一抗体可变片段、与人pdgf-d结合的第二抗体可变片段和具有降低的fcγ受体结合活性的fc区。在某些实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其包含与人pdgf-b结合的第一抗体可变片段、与人pdgf-d结合的第二抗体可变片段和fc区，与天然存在的igg fc区相比，该fc区具有降低的fcγ受体结合活性。
[0372]
本发明的“多特异性抗原结合分子”的优选实施方案的实例包括多特异性抗体。当具有降低的fcγ受体结合活性的fc区用作多特异性抗体fc区时，可以适当地使用源自多特异性抗体的fc区。双特异性抗体特别优选作为本发明的多特异性抗体。在这种情况下，双特异性抗体是具有两种不同特异性的抗体。igg型双特异性抗体可以从杂交杂交瘤(细胞杂交瘤)分泌，其中所述杂交瘤是通过将产生igg抗体的两种类型杂交瘤融合而产生的(milstein等人，nature(1983)305，537-540)。
[0373]
此外，igg型双特异性抗体是通过将构成两种类型的目标igg的l链和h链的基因，即，总共四种基因导入细胞并使其共表达而分泌的。然而，通过这些方法可以产生的igg的h链和l链的组合数理论上是十种组合。因此，难以从十种类型的igg中纯化包含期望h链和l链组合的igg。此外，理论上，具有期望组合的igg的分泌量将显著减少，因此需要大规模培养，生产成本将进一步增加。
[0374]
因此，促进h链间以及具有期望组合的l链与h链间缔合的技术可以应用于本发明的多特异性抗原结合分子。
[0375]
例如，通过在抗体h链的第二恒定区或第三恒定区(ch2或ch3)的界面处引入静电排斥来抑制非期望h链缔合的技术可应用于多特异性抗体缔合(wo2006/106905)。
[0376]
在通过在ch2或ch3的界面处引入静电排斥来抑制非期望h链缔合的技术中，在h链
的另一个恒定区的界面处接触的氨基酸残基的实例包括对应于ch3区中eu编号第356、439、357、370、399和409位的残基的区域。
[0377]
更具体地，实例包括包含两种类型的h链ch3区的抗体，其中第一h链ch3区中的1至3对氨基酸残基(选自以下(1)至(3)中所示的氨基酸残基对)携带相同类型的电荷：(1)包含在h链ch3区中eu编号第356和439位的氨基酸残基；(2)包含在h链ch3区中eu编号第357和370位的氨基酸残基；以及(3)包含在h链ch3区中eu编号第399和409位的氨基酸残基。
[0378]
此外，抗体可以是其中与上述第一h链ch3区不同的第二h链ch3区中的氨基酸残基对选自上述(1)至(3)的氨基酸残基对的抗体，其中对应于上述第一h链ch3区中携带相同类型的电荷的上述(1)至(3)的氨基酸残基对的1至3对氨基酸残基携带与上述第一h链ch3区中相应氨基酸残基相反的电荷。
[0379]
上述(1)至(3)中所示的每个氨基酸残基在缔合过程中彼此接近。本领域技术人员可以使用可商购获得的软件通过同源建模等找出在期望h链ch3区或h链恒定区中对应于上述(1)至(3)的氨基酸残基的位置，并且这些位置的氨基酸残基可经适当修饰。
[0380]
在上述抗体中，“带电荷的氨基酸残基”优选选自，例如，包括在以下任一组中的氨基酸残基：
[0381]
(a)谷氨酸(e)和天冬氨酸(d)；以及
[0382]
(b)赖氨酸(k)、精氨酸(r)和组氨酸(h)。
[0383]
在上述抗体中，短语“携带相同电荷”是指，例如，所有两个或更多个氨基酸残基均选自上述(a)和(b)组中任一组中包括的氨基酸残基。短语“携带相反电荷”是指，例如，当两个或更多个氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基选自上述(a)和(b)组中任一组中包括的氨基酸残基时，其余氨基酸残基选自包括在另一组中的氨基酸残基。
[0384]
在优选的实施方案中，上述抗体可以使其第一h链ch3区和第二h链ch3区通过二硫键交联。
[0385]
在本发明中，经修饰的氨基酸残基不限于上述抗体可变区或抗体恒定区的氨基酸残基。本领域技术人员可以通过同源建模等使用可商购获得的软件鉴定在突变多肽或异源多聚体中形成界面的氨基酸残基；并且然后可以对这些位置的氨基酸残基进行修饰以调节缔合。
[0386]
其他已知技术也可用于本发明的多特异性抗体的缔合。包含不同氨基酸的含fc区多肽可以通过以下而彼此有效缔合：用较大侧链(杵)置换存在于抗体h链fc区之一中的氨基酸侧链，并用较小侧链(臼)置换存在于另一条h链相应fc区的氨基酸侧链以允许在臼中置入杵(wo1996/027011；ridgway jb等人，protein engineering(1996)9，617-621；merchant a.m.等人nature biotechnology(1998)16，677-681；和us20130336973)。
[0387]
此外，其他已知技术也可用于形成本发明的多特异性抗体。具有不同序列的多肽的缔合可以通过ch3的互补缔合使用链交换工程化结构域ch3而有效诱导，其中所述链交换工程化结构域ch3是通过将抗体的h链ch3之一的一部分交换为相应的iga衍生序列并将相应的iga衍生序列引入另一条h链ch3的互补部分而产生的(蛋白质工程设计与选择，23；195-202，2010)。该已知技术还可用于有效地形成目标多特异性抗体。
[0388]
此外，如wo 201i/028952、wo2014/018572和nat biotechnol.2014feb；32(2)：191-8中所述的使用抗体ch1和cl的缔合以及vh和vl的缔合的抗体产生技术；如wo2008/
119353、wo2011/131746、wo2015/046467和wo2016159213中所述的组合使用单独制备的单克隆抗体产生双特异性抗体的技术(fab臂交换)；如wo2012/058768和wo2013/063702中所述的用于调节抗体重链ch3之间缔合的技术；如wo2012/023053中所述的用于产生由两种类型轻链和一种类型重链组成的双特异性抗体的技术；如christoph等人(nature biotechnology vol.31，p753-758(2013))所述的使用单独表达包含单一h链和单一l链的抗体链之一的两种细菌细胞株产生双特异性抗体的技术等均可以用于形成多特异性抗体。
[0389]
备选地，即使当不能有效地形成目标多特异性抗体时，也可以通过从产生的抗体中分离和纯化目标多特异性抗体来获得本发明的多特异性抗体。例如，已报道通过将氨基酸置换引入两种类型的h链的可变区来赋予等电点差异，从而能够通过离子交换色谱纯化两种类型的同聚体(homomeric)形式和目标异聚体(heteromeric)抗体的方法(wo2007114325)。迄今为止，作为纯化异聚体抗体的方法，已报道使用蛋白a以纯化包含与蛋白a结合的小鼠igg2a h链和不与蛋白a结合的大鼠igg2b h链的异二聚抗体的方法(wo98050431和wo95033844)。此外，异二聚抗体可以通过以下而有效地纯化：通过使用包含氨基酸残基置换的h链，其中所述置换是用产生不同的蛋白a亲和力的氨基酸tyr、his等置换在eu编号第435和436位处(其是igg-蛋白a结合位点)的氨基酸残基；通过使用具有不同蛋白a亲和力的h链，以改变每个h链与蛋白a的相互作用，然后使用蛋白a柱。
[0390]
此外，fc区c末端异质性已得到改善的fc区可以适当地用作本发明的fc区。更具体地，本发明提供了通过从构成源自igg1、igg2、igg3或igg4的fc区的两个多肽的氨基酸序列缺失eu编号指定的第446位甘氨酸和第447位赖氨酸而产生的fc区。
[0391]
可以组合使用多种，例如两种或更多种这些技术。此外，这些技术可以适当地和单独地应用于待缔合的两条h链。此外，这些技术可以与上述对fcγ受体的结合活性降低的fc区组合使用。此外，本发明的抗原结合分子可以是基于进行上述修饰的抗原结合分子而单独产生以具有相同氨基酸序列的分子。
[0392]
优选地，本发明的抗原结合分子是包含与pdgf-b结合的第一抗原结合结构域和与pdgf-d结合的第二抗原结合结构域的多特异性抗原结合分子。更优选地，本发明的抗原结合分子与pdgf-b(即，pdgf-b、pdgf-ab和pdgf-bb)和pdgf-d(即，pdgf-d和pdgf-dd)特异性结合，并且抑制它们与pdgfr的相互作用，从而抑制pdgf-b活性和pdgf-d活性。
[0393]
术语“pdgf-b介导的活性”、“pdgf-b介导的效应”、“pdgf-b活性”、“pdgf-b生物活性”或“pdgf-b功能”在本文中可互换使用，意指由pdgf-b与同源受体相互作用介导的任何活性，该活性包括但不限于pdgf-b与pdgfr的结合、pdgfr的磷酸化、细胞迁移的增加、细胞增殖的增加、细胞外基质沉积的增加，以及本领域已知的或待将来阐明的pdgf-b的任何其他活性。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子是与pdgf-b特异性结合的抗体。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子/抗体与无关的非pdgf-b蛋白的结合程度小于抗体与pdgf-b结合的约10％，例如，如通过放射免疫测定(ria)所测量的。在一个实施方案中，所述非pdgf-b是pdgf-a、pdgf-c或pdgf-d。在某些实施方案中，与pdgf-b结合的抗体具有1μm或更小、100nm或更小、10nm或更小、1nm或更小、0.1nm或更小、0.01nm或更小、或0.001nm或更小(例如10-8
m或更小，例如10-8
m至10-13
m，例如10-9
m至10-13
m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗pdgf-b抗体与在来自不同物种的pdgf-b之间保守的pdgf-b表位结合。
[0394]
术语“pdgf-d介导的活性”、“pdgf-d介导的效应”、“pdgf-d活性”、“pdgf-d生物活
性”或“pdgf-d功能”在本文中可互换使用，意指由pdgf-d与同源受体相互作用介导的任何活性，该活性包括但不限于pdgf-d与pdgfr的结合、pdgfr的磷酸化、细胞迁移的增加、细胞增殖的增加、细胞外基质沉积的增加，以及本领域已知的或待将来阐明的pdgf-d的任何其他活性。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子是与pdgf-d特异性结合的抗体。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子/抗体与无关的非pdgf-d蛋白的结合程度小于抗体与pdgf-d结合的约10％，例如，如通过放射免疫测定(ria)所测量的。在一个实施方案中，所述非pdgf-d是pdgf-a、pdgf-b或pdgf-c。在某些实施方案中，与pdgf-d结合的抗体具有1μm或更小、100nm或更小、10nm或更小、1nm或更小、0.1nm或更小、0.01nm或更小、或0.001nm或更小(例如10-8
m或更小，例如10-8
m至10-13
m，例如10-9
m至10-13
m)的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗pdgf-d抗体与在来自不同物种的pdgf-d之间保守的pdgf-d表位结合。
[0395]
因此，本发明的方法使用本发明的多特异性抗原结合分子或抗体，其阻断、抑制或降低(包括显著降低)pdgf-b和/或pdgf-d活性，包括由pdgf-b和/或pdgf-d介导的下游事件。本发明的多特异性抗原结合分子或抗体表现出以下特征中的任一种或多种：(a)与pdgf-b和/或pdgf-d特异性结合；(b)阻断pdgf-b和/或pdgf-d与细胞表面受体的相互作用和下游信号传导事件；(c)阻断pdgfr的磷酸化；(d)阻断pdgf-b和/或pdgf-d介导的细胞增殖诱导；(e)阻断pdgf-b和/或pdgf-d介导的细胞迁移诱导；以及(f)阻断或减少pdgf-b和/或pdgf-d介导的细胞外基质沉积。在一个优选的实施方案中，本发明的抗原结合分子或抗体优选以阻断pdgf-b和/或pdgf-d与细胞表面受体(例如，pdgfr)相互作用的方式与pdgf-b和/或pdgf-d反应。
[0396]
在一个优选的实施方案中，本发明的多特异性抗原结合分子包含表1和表2列出的一条或多条多肽链。
[0397]
药物制剂
[0398]
通过将具有期望纯度的此类抗原结合分子(例如抗体)与一种或多种任选的药学上可接受的运载体混合以冻干制剂或水溶液的形式制备如本文所述的与pdgf-b和/或pdgf-d结合的抗原结合分子(例如抗体)的药物制剂(remington制药科学第16版，osol，a.编辑(1980))。药学上可接受的运载体在采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，包括但不限于：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖类，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。本文的示例性药学上可接受的运载体进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如，人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，例如rhuph20(hylenex(注册商标)，baxter international，inc.)。某些示例性shasegp和使用方法(包括rhuph20)如美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中所述。一方面，shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(例如软骨素酶)组合。
[0399]
示例性冻干抗体制剂如美国专利号6,267,958中所述。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和wo2006/044908中描述的那些，后者包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
[0400]
如待治疗的特定适应症所需，本文的制剂还可包含多于一种活性成分，优选具有互补活性且不会相互产生不利影响的活性成分。
[0401]
活性成分可以被包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于remington制药科学第16版，osol，a.编辑(1980)。
[0402]
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。
[0403]
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地实现，例如通过无菌过滤膜过滤。
[0404]
治疗方法和组合物
[0405]
本文提供的与pdgf-b和/或pdgf-d结合的任何抗原结合分子(例如抗体)均可用于治疗方法。一方面，提供了单独或联合用作药物的与pdgf-b结合的抗原结合分子(例如抗体)、与pdgf-d结合的抗原结合分子(例如抗体)。在另一方面，提供了用作药物的多特异性抗原结合分子，其包含与pdgf-b结合的第一抗原结合结构域和与pdgf-d结合的第二抗原结合结构域。
[0406]
一方面，提供了与pdgf-b结合的抗原结合分子(例如抗体)、与pdgf-d结合的抗原结合分子(例如抗体)，其单独或联合用于治疗纤维化(例如心肌纤维化、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化和骨髓纤维化)，或肾炎和人相关疾病，包括但不限于肾炎、进行性肾病和相关疾病，例如iga肾病，系膜增生性肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、肾间质纤维化、肾功能衰竭、糖尿病肾病、多囊性肾病、奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病。另一方面，提供了包含与pdgf-b结合的第一抗原结合结构域和与pdgf-d结合的第二抗原结合结构域的多特异性抗原结合分子，其用于治疗上述疾病/病况。
[0407]
在某些实施方案中，本发明提供了与pdgf-b结合的抗原结合分子(例如抗体)、与pdgf-d结合的抗原结合分子(例如抗体)，其单独或联合用于治疗患有纤维化(例如心肌纤维化、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化和骨髓纤维化)，或肾炎和人相关疾病，包括但不限于肾炎、进行性肾病和相关疾病，例如iga肾病、系膜增生性肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、肾间质纤维化、肾功能衰竭、糖尿病肾病、多囊性肾病、奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病的个体的方法中；其中所述方法包括向个体施用有效量的本发明的抗原结合分子。根据任何上述实施方案的“个体”优选是人。另一方面，本发明提供了包含与pdgf-b结合的第一抗原结合结构域和与pdgf-d结合的第二抗原结合结构域的多特异性抗原结合分子，其用于任何上述治疗方法中。
[0408]
还一方面，本发明提供了与pdgf-b和/或pdgf-d结合的抗原结合分子(例如抗体)在生产或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗纤维化(例如心肌纤维化、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化和骨髓纤维化)，或肾炎和人相关
疾病，包括但不限于肾炎、进行性肾病和相关疾病，例如iga肾病、系膜增生性肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、肾间质纤维化、肾功能衰竭、糖尿病肾病、多囊性肾病、奥尔波特综合征、局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病。另一方面，本发明提供了包含与pdgf-b结合的第一抗原结合结构域和与pdgf-d结合的第二抗原结合结构域的多特异性抗原结合分子，其用于生产或制备用于治疗任何上述疾病/病况的药物。
[0409]
还一方面，本发明提供了一种药物制剂，其包含本文提供的与pdgf-b结合的抗原结合分子和与pdgf-d结合的抗原结合分子，例如，用于任何上述治疗方法。在一个实施方案中，本发明提供了包含与pdgf-b结合的抗原结合分子的药物组合物与包含与pdgf-d结合的抗原结合分子的药物组合物联合。在一些实施方案中，对于本文提供的药物组合物，向受试者同时、单独或序贯施用与pdgf-b结合的抗原结合分子和与pdgf-d结合的抗原结合分子。还一方面，本发明提供了包含多特异性抗原结合分子的药物制剂，该多特异性抗原结合分子包含与pdgf-b结合的第一抗原结合结构域和与pdgf-d结合的第二抗原结合结构域，所述药物制剂用于任何以上治疗方法。
[0410]
在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的与pdgf-b和/或pdgf-d结合的任何抗原结合分子(例如抗体)和至少一种另外的治疗剂。上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或单独的制剂中)和单独施用，在这种情况下，本发明的抗体的施用可以在施用另外的一种或更多种治疗剂之前、同时和/或之后发生。在一个实施方案中，本文提供的与pdgf-b和/或pdgf-d结合的抗原结合分子(例如抗体)的施用和另外的治疗剂的施用发生在彼此约一个月内，或约一、二或三周内，或约一、二、三、四、五或六天内。
[0411]
本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如有需要局部治疗的话，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹腔或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径，例如，通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于短暂施用或长期施用。本文设想了各种给药方案，包括但不限于在各种时间点单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
[0412]
本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这方面考虑的因素包括待治疗的特定疾病、待治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间安排以及医生已知的其他因素。抗体不需要，但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的病症的药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体量、病症或治疗的类型以及上述其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或本文所述剂量的约1至99％，或以经验/临床确定合适的任何剂量和任何途径使用。
[0413]
对于疾病的预防或治疗，本发明抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂联合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体是出于预防目的或治疗目的、既往治疗、患者的临床病史和对抗体的应答，以及主治医师的判断。将抗体一次性或在一系列治疗中适当地施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是向患者施用的初始候选剂量，例如，通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。根据上述因素，一种典型
的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于数天或更长时间的重复施用，根据病况，治疗通常将持续至发生期望的疾病症状抑制。抗体的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)中的一个或多个剂量。这种剂量可以间隔施用，例如每周一次或每三周一次(例如使患者接受约两剂至约二十剂，或例如约六剂抗体)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展很容易通过常规技术和测定进行监测。
[0414]
制品
[0415]
在本发明的另一方面，提供了含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。制品包括容器和在容器上的标签或与容器相关的包装插页。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、iv溶液袋等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器装有组合物，该组合物本身或与另一种有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物联合使用，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺破的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性成分是本发明的抗原结合分子或抗体。标签或包装插页表明该组合物用于治疗所选择的病况。此外，制品可以包含(a)其中包含组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗原结合分子或抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的该实施方案中的制品可以进一步包括包装插页，说明该组合物可用于治疗特定病况。备选地，或另外地，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户的角度，它可以进一步包括其他期望的材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
[0416]
实施例
[0417]
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于以上提供的一般描述，可以实践各种其他实施方案。
[0418]
实施例1
[0419]
抗体制备
[0420]
针对pdgf-b的单特异性抗体(cpr001；表1和2)、针对pdgf-d的单特异性抗体(cr002；表1和2)以及针对pdgf-b和pdgf-d的双特异性抗体(包含cpr001的抗pdgf-b臂和cr002的抗pdgf-d臂)使用expi293表达系统(thermo fisher scientific)通过对其编码的基因的瞬时转染进行表达。收获培养物上清液，并使用mabselect sure亲和层析(ge healthcare)从上清液纯化抗体，然后使用superdex200(ge healthcare)进行凝胶过滤层析。使用cpr001的抗pdgf-b臂和cr002的抗pdgf-d臂通过常规方法(例如wo2015046467a1或sci rep.2017apr 3；7：45839中公开的)制备针对pdgf-b和pdgf-d的双特异性抗体(即cpr//cr)。
[0421]
(表1)针对pdgf-b的单特异性抗体(cpr001)和针对pdgf-d的单特异性抗体(cr002)的可变区(包括vh、vl和hvr/cdr)的名称和sed id no。
[0422][0423]
(表2)针对pdgf-b的单特异性抗体(cpr001)和针对pdgf-d的单特异性抗体(cr002)的可变区(包括vh、vl和hvr/cdr)的名称和氨基酸序列。
[0424][0425]
实施例2
[0426]
抗pdgf抗体的表征
[0427]
2.1抗pdgf抗体抑制小鼠成纤维细胞中pdgf-b和pdgf-d诱导的pdgfrβ磷酸化
[0428]
通过测量pdgfrβ磷酸化，检测小鼠成纤维细胞系nih3t3中抗pdgf抗体(cpr001、cr002或cpr//cr双特异性抗体)对重组小鼠pdgf-b和pdgf-d的中和作用。
[0429]
培养nih3t3细胞并接种到12孔板上，并在0.1％fbs条件下血清饥饿过夜。细胞用抗体和配体(重组小鼠pdgf-bb(thermo)和/或重组小鼠pdgf-d(r&d systems)在37℃下处理5分钟。在对细胞进行处理之前，将不同浓度的抗体与10ng/ml的每种配体在室温下预孵
育30分钟。根据生产商的程序，使用pathscan(注册商标)磷酸pdgf受体β(tyr751)elisa试剂盒(cell signaling technology)测量pdgfrβ的磷酸化。
[0430]
如图1所示，在nih3t3细胞中，cpr(即cpr001)和cpr//cr抑制pdgf-b诱导的pdgfrβ磷酸化，并且cr(即cr002)和cpr//cr抑制pdgf-d诱导的pdgfrβ磷酸化。另一方面，在存在pdgf-b和pdgf-d的情况下，仅cpr//cr抑制pdgfrβ磷酸化。
[0431]
2.2抗pdgf抗体抑制人成纤维细胞中pdgf-b和pdgf-d诱导的pdgfrα和pdgfrβ磷酸化
[0432]
通过测量pdgfrα和β磷酸化，检测人肺成纤维细胞系imr90中抗pdgf抗体(cpr001、cr002或cpr//cr双特异性抗体)对重组人pdgf-b和pdgf-d的中和作用。
[0433]
培养imr90细胞并接种到12孔板上，并在0.1％fbs条件下血清饥饿过夜。细胞用抗体和配体(重组人pdgf-bb和/或重组人pdgf-dd(r&dsystems))在37℃下处理5分钟。在对细胞进行处理之前，将不同浓度的抗体与10ng/ml的每种配体在室温下预孵育30分钟。根据生产商的程序，使用pathscan(注册商标)磷酸pdgf受体α(tyr849)或磷酸pdgf受体β(tyr751)elisa试剂盒(cell signaling technology)测量pdgfrα和β的磷酸化。
[0434]
如图2所示，在imr90细胞中，cpr(即cpr001)和cpr//cr抑制pdgf-b诱导的pdgfrβ磷酸化，并且cr(即cr002)和cpr//cr抑制pdgf-d诱导的pdgfrβ磷酸化。另一方面，在存在pdgf-b和-d的情况下，仅cpr//cr抑制pdgfrβ磷酸化。
[0435]
如图3所示，在imr90细胞中，cpr(即cpr001)和cpr//cr抑制pdgf-b诱导的pdgfr
α
磷酸化，并且cr(即cr002)和cpr//cr抑制pdgf-d诱导的pdgfrα磷酸化。另一方面，在存在pdgf-b和pdgf-d的情况下，仅cpr//cr抑制pdgfrα磷酸化。
[0436]
2.3抗pdgf抗体抑制pdgf-b和pdgf-d诱导的小鼠成纤维细胞增殖
[0437]
通过brdu掺入，检测小鼠成纤维细胞系nih3t3中抗pdgf抗体(cpr001、cr002或cpr//cr双特异性抗体)对重组小鼠pdgf-b和pdgf-d的中和作用。
[0438]
培养nih3t3细胞并接种到96孔板上，并在0.1％fbs条件下血清饥饿过夜。细胞用抗体和配体(重组小鼠pdgf-bb(thermo)和/或重组小鼠pdgf-d(r&d systems)在37℃下处理16-24小时。在对细胞进行处理之前，将不同浓度的抗体与每种配体(10ng/ml小鼠pdgf-bb和100ng/ml小鼠pdgf-d)在室温下预孵育30分钟。根据生产商的程序，使用细胞增殖elisa brdu试剂盒(roche applied science)基于5-溴-2
′‑
脱氧尿苷(brdu)掺入确定培养的最后3小时期间的dna合成。
[0439]
如图4所示，cpr(即cpr001)和cpr//cr抑制pdgf-b诱导的细胞增殖，并且cr(即cr002)和cpr//cr抑制pdgf-d诱导的nih3t3细胞增殖。
[0440]
2.4nrp1-fc抑制人成纤维细胞中pdgf-d诱导的pdgfrβ磷酸化
[0441]
通过测量pdgfrβ磷酸化，检测人肺成纤维细胞系imr90中nrp1-fc对重组人pdgf-d的中和作用。
[0442]
培养imr90细胞并接种到12孔板上，并在0.1％fbs条件下血清饥饿过夜。细胞用nrp1-fc或抗体和重组人pdgf-d(r&d systems)在37℃下处理5分钟。在对细胞进行处理之前，将10g/ml的nrp1-fc(sino biological)或抗体与10ng/ml的pdgf-d在室温下预孵育30分钟。根据生产商的程序，使用pathscan(注册商标)磷酸pdgf受体β(tyr751)elisa试剂盒(cell signaling technology)测量pdgfrβ的磷酸化。
[0443]
如图5所示，nrp1-fc抑制imr90细胞中pdgf-d诱导的pdgfrβ磷酸化。ic17用作阴性对照，cr(即cr002)用作测定的阳性对照。结果表明，抑制剂(例如诱饵nrp1分子(nrp1-fc))或阻断/抑制pdgf-d与nrp1结合的抗体，可以抑制pdgf-d诱导的pdgfr-β信号传导。
[0444]
2.5nrp1-fc与抗pdgf-d抗体的联合处理抑制pdgf-d诱导的人成纤维细胞增殖
[0445]
通过brdu掺入，检测人肺成纤维细胞系imr90中nrp1-fc和抗pdgf-d抗体(cr002)对重组人pdgf-d的中和作用。
[0446]
培养imr90细胞并接种到96孔板上，并在0.1％fbs条件下血清饥饿过夜。细胞用nrp1-fc(sino biological)和/或抗体和重组人pdgf-d(r&dsystems)在37℃下处理16-24小时。在对细胞进行处理之前，将10μg/ml的nrp1-fc和/或抗体与10ng/ml的pdgf-d在室温下预孵育30分钟。根据生产商的程序，使用细胞增殖elisa brdu试剂盒(roche applied science)基于5-溴-2
′‑
脱氧尿苷(brdu)掺入确定培养的最后3小时期间的dna合成。
[0447]
如图6所示，nrp1-fc和cr(即cr002)的联合处理显示了imr90中细胞增殖的协同抑制。结果表明，可以开发与pdgf-d特异性结合并阻断其与神经纤毛蛋白1(nrp1)相互作用并且还阻断/抑制pdgf-d与pdgfr结合的抗原结合分子(例如抗体)，以有效抑制nrp1-pdgf-d诱导的信号传导。与特异性结合pdgf-d但不阻断其与nrp1相互作用的抗原结合分子(例如抗体)相比，预期此类抗原结合分子对pdgf-d介导的信号传导的抑制作用增强。
[0448]
获得特异性结合pdgf-d并阻断/抑制其与nrp1相互作用并且还阻断/抑制pdgf-d与pdgfr结合的抗体的方法包括已知的抗原免疫，然后使用elisa、octet、biacore和/或ecl等公知的方法评价和筛选nrp1-pdgf-d相互作用的抑制。
[0449]
实施例3
[0450]
在体内模型中评估抗pdgf抗体
[0451]
3.1抗pdgf抗体预防uuo小鼠模型中的肾纤维化
[0452]
在发生进行性肾纤维化的uuo(单侧输尿管梗阻)小鼠模型中评估单克隆抗体cpr001和cr002的体内有效性。
[0453]
5周龄的无特定病原体c57bl/6j雄性小鼠购自cleajapan inc.(shiga，japan)，并在处理开始前适应环境2周。将动物保持在20-26℃下，12:12小时光/暗循环，并饲喂市售标准饲料(#ce-2；clea japan inc.，shizuoka，japan)和自由饮水。
[0454]
uuo手术在异氟醚麻醉条件下进行。腹部左侧剃毛，并在皮肤上行垂直切口。在腹膜上行第二个切口，并且还拉伸皮肤以露出肾脏。使用镊子，将肾脏牵至表面，在肾脏下方，左输尿管用手术线绑扎两次。将结扎的肾脏轻轻放回其正确的解剖位置，然后缝合腹膜和皮肤。给予镇痛剂以减少动物痛苦。假手术组仅切开腹膜和皮肤并缝合。
[0455]
所有单克隆抗体均在手术前通过静脉内注射施用一次。对于假手术组，施用抗klh抗体ic17。抗体以50mg/kg施用。施用抗pdgf-b抗体cpr001、抗pdgf-d抗体cr002(如wo2007059234中所述)及其组合。抗klh抗体ic17在本研究中用作阴性对照(50mg/kg)。联合处理组接受cpr001(50mg/kg)和cr002(50mg/kg)处理。将动物称重，然后在第7天在异氟醚麻醉下放血处死。从心腔或后腔静脉采集血液样品并保持在-80℃下直至测定。迅速取出肾脏。部分肾脏组织在液氮或干冰中速冻用于分子分析。
[0456]
使用rneasy mini kit(qiagen)从肾脏组织提取总rna。小鼠线粒体核糖体蛋白l19(mrpl19)用作每个样品的内源性参考。使用双δct分析计算相对mrna表达值。
[0457]
如图7a所示，通过测量肾脏中的1型胶原蛋白α1 mrna水平评估抗体对肾纤维化的抑制活性。uuo小鼠的胶原蛋白mrna水平显著增加，cpr001单独处理导致胶原蛋白mrna水平降低。与cpr001单独处理相比，联合处理组显示出显著更大的降低。
[0458]
测量肾脏中羟脯氨酸(其是胶原蛋白中包含的氨基酸之一)的量，以评价细胞外基质向组织的沉积。湿肾脏组织在110℃下干燥3小时并称重。然后，将6n hcl(100μl/1mg干组织)加入干组织中，并将它们煮沸过夜。通过过滤净化样品，并将每个样品10μl接种到96孔板上。将装有样品的板在室温下干燥过夜，并使用羟脯氨酸测定试剂盒(biovision)测量羟脯氨酸。
[0459]
如图7b所示，在疾病诱导的肾脏中观察到羟脯氨酸含量显著增加。cpr001单独处理和与cr002的联合处理抑制肾脏纤维化。数据表示为平均值+/-平均值的标准误差(sem)。使用学生t检验或dunnett多重比较检验进行统计分析。当p值＜0.05时，认为差异具有显著性。
[0460]
3.2抗pdgf抗体改善alport小鼠模型中的肾功能并预防肾纤维化
[0461]
在col4a3基因缺陷小鼠(所谓的alport小鼠模型，其发展为进行性肾小球和间质纤维化)中评价单克隆抗体cpr001和cr002的体内有效性。
[0462]
7周龄的无特定病原体col4a3敲除雄性小鼠和c57bl/6j雄性小鼠购自clea japan inc.(shizuoka，japan)，并在处理开始前适应环境3周。将动物保持在20-26℃下，12：12小时光/暗循环，并饲喂市售标准饲料(#ce-2；clea japan inc.，shizuoka，japan)和自由饮水。
[0463]
在研究期间每2周从颈静脉或后腔静脉采集血液样品。制备血浆样品并保持在-80℃下直至测定。在研究期间每2周采集20小时尿液。通过自动分析仪tba-120fr(canon medical systems，tochigi，japan)测量血浆和尿液生化，包括肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂c。根据12周龄生化指标(尿白蛋白/肌酸酐比、血浆肌酸酐、血浆尿素氮)和体重，将alport小鼠分为患病对照组、cpr001组、cr002组和联合处理组。
[0464]
从14周龄至22周龄，每周两次皮下施用所有单克隆抗体。向野生型(c57bl/6j)和患病对照组施用抗klh抗体ic17。抗体以50mg/kg施用。施用抗pdgf-b抗体cpr001、抗pdgf-d抗体cr002(如wo2007059234中所述)及其组合。抗klh抗体ic17在本研究中用作阴性对照。联合组接受cpr001(50mg/kg)和cr002(50mg/kg)处理。在22周龄时在异氟醚麻醉下通过放血处死动物。迅速取出肾脏。部分肾脏组织在液氮或干冰中速冻用于分子分析。
[0465]
如图8a所示，alport小鼠的血浆肌酸酐浓度显著增加。cpr001处理组和联合处理组显示血浆肌酸酐浓度降低。
[0466]
如图8b所示，alport小鼠的血浆半胱氨酸蛋白酶抑制剂c浓度显著增加。联合处理组显示血浆半胱氨酸蛋白酶抑制剂c浓度降低。
[0467]
使用rneasy mini kit(qiagen)从肾脏组织提取总rna。小鼠线粒体核糖体蛋白l19(mrpl19)用作每个样品的内源性参考。使用双δct分析计算相对mrna表达值。
[0468]
如图8c所示，基于肾脏中1型胶原蛋白α1 mrna水平，评估抗体对肾纤维化的抑制活性。alport小鼠的胶原蛋白mrna水平显著增加，而cpr001处理组和联合处理组显示降低。
[0469]
测量肾脏中羟脯氨酸(其是胶原蛋白中包含的氨基酸之一)的量，以评价细胞外基质向组织的沉积。湿肾脏组织在110℃下干燥3小时并称重。然后，将6n hcl(100μl/1mg干组
织)加入干组织中，并将它们煮沸过夜。通过过滤净化样品，并将每个样品10μl接种到96孔板上。将装有样品的板在室温下干燥过夜，并使用羟脯氨酸测定试剂盒(biovision)测量羟脯氨酸。
[0470]
如图8d所示，在疾病诱导的肾脏中观察到羟脯氨酸含量显著增加。在cpr001处理组和联合处理组中，肾纤维化被抑制。与cpr001单独处理相比，联合处理组显示羟脯氨酸含量显著降低。数据表示为平均值+/-平均值的标准误差(sem)。使用学生t检验或dunnett多重比较检验进行统计分析。当p值＜0.05时，认为差异具有显著性。
[0471]
3.3抗pdgf抗体预防cdahfd模型的肝纤维化
[0472]
单克隆抗体cpr001和cr002的体内有效性在cdahfd(胆碱缺乏l-氨基酸定义的高脂饲料)诱导的小鼠nash/肝纤维化模型中进行评价。
[0473]
所有实验动物护理和处理均按照chugai pharmabody research pte.ltd的实验室动物护理和使用指南中的建议进行。
[0474]
6周龄的无特定病原体c57bl/6ntac雄性小鼠购自invivos pte ltd(新加坡)，并在处理开始前适应环境1周。将动物保持在20-26℃下，12:12小时光/暗循环，并饲喂市售标准饲料(5p75；pminutrition int
′
l(labdiet)，美国密苏里)和自由饮水。
[0475]
试验饲料胆碱缺乏l-氨基酸定义的高脂饲料(cdahfd；#a06071302)购自research diets(new brunswick，nj，usa)。研究期间，4组喂食cdahfd(n＝8)，1组喂食5p75作为正常对照组。
[0476]
所有单克隆抗体均在疾病诱导后1周至3周通过静脉内注射施用，每周一次。抗体以50mg/kg施用。施用抗pdgf-b抗体cpr001、抗pdgf-d抗体cr002(如wo2007059234中所述)及其组合。抗klh抗体ic17在本研究中用作阴性对照。联合处理组接受cpr001(50mg/kg)和cr002(50mg/kg)处理。将动物称重，然后在第21天在异氟醚麻醉下放血处死。从心腔或后腔静脉采集血液样品并保持在-80℃下直至测定。迅速取出肝脏并称重。部分肝脏组织在液氮或干冰中速冻用于分子分析。
[0477]
使用rneasy mini kit(qiagen)从肝脏组织中提取总rna，使用taqman(注册商标)gene expression cells-to-ct kit(life technologies)合成cdna。使用quantstudio
tm 12k flex实时pcr系统(thermofisher)测量基因表达。基因的引物和taq-man探针购自applied biosystems。小鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)用作每个样品的内源性参考。使用双act分析计算相对mrna表达值。
[0478]
如图9a所示，抗体对肝纤维化的抑制活性基于肝脏中1型胶原蛋白α1 mrna的量进行评估。cdahfd小鼠的胶原蛋白mrna水平显著增加，所有三个处理组均显示出降低。与cpr001单独处理相比，联合处理组显示出显著降低。
[0479]
测量肝脏中羟脯氨酸(其是胶原蛋白中包含的氨基酸之一)的量，以评价细胞外基质向组织的沉积。湿肝脏组织在蒸馏水(50μl/10mg湿组织)中匀浆。然后，将等量的12n hcl添加至均质组织中，并将这些在110℃下煮沸过夜。通过过滤净化样品，并将10μl的每个样品接种到96孔板上。将装有样品的板在室温下干燥，并使用羟脯氨酸测定试剂盒(biovision)测量羟脯氨酸。
[0480]
如图9b所示，在疾病诱导的肝脏中观察到羟脯氨酸含量增加，并且所有三个处理组均显示出减少。与cr002单独处理相比，联合处理组(cpr001和cr002)显示出显著减少。数
据表示为平均值+/-平均值的标准误差(sem)。使用学生t检验或dunnett多重比较检验进行统计分析。当p值＜0.05时，认为差异具有显著性。
[0481]
实施例4
[0482]
在体内模型中评估抗pdgf-b/d双特异性抗体
[0483]
4.1cpr//cr双特异性抗体预防uuo小鼠模型中的肾纤维化
[0484]
在发展进行性肾纤维化的单侧输尿管梗阻(uuo)小鼠模型中评估单克隆抗体cpr//cr的体内有效性。
[0485]
7周龄的无特定病原体c57bl/6j雄性小鼠购自cleajapan inc.(shiga，japan)，并在处理开始前适应环境1周。将动物保持在20至26℃下，12：12小时光/暗循环，并饲喂市售标准饲料(#ce-2；clea japan inc.，shizuoka，japan)和自由饮水。
[0486]
uuo手术在异氟醚麻醉条件下进行。腹部左侧剃毛，并在皮肤上行垂直切口。在腹膜上行第二个切口，并且还拉伸皮肤以露出肾脏。使用镊子，将肾脏牵至表面，在肾脏下方，左输尿管用手术线绑扎两次。将结扎的肾脏轻轻放回其正确的解剖位置，然后缝合腹膜和皮肤。给予镇痛剂以减少动物痛苦。假手术组仅切开腹膜和皮肤并缝合。
[0487]
所有单克隆抗体均在手术前通过静脉内注射施用一次。假手术组施用抗klh抗体ic17。施用针对pdgf-b和pdgf-d的cpr//cr双特异性抗体。抗klh抗体ic17在本研究中用作阴性对照。抗体以50mg/kg施用。将动物称重，然后在第7天在异氟醚麻醉下放血处死。从心腔或后腔静脉采集血液样品并保持在-80℃下直至测定。迅速取出肾脏。部分肾脏组织在液氮或干冰中速冻用于分子分析。
[0488]
使用rneasy mini kit(qiagen)从肾脏组织提取总rna。小鼠线粒体核糖体蛋白l19(mrpl19)用作每个样品的内源性参考。使用双δct分析计算相对mrna表达值。
[0489]
如图10所示，通过肾脏中的1型胶原蛋白α1 mrna评估针对肾纤维化的抗体抑制活性。uuo小鼠的胶原蛋白mrna水平显著增加。与患病对照组(uuo ic17)相比，cpr//cr组显示出显著降低。
[0490]
测量肾脏中羟脯氨酸(其是胶原蛋白中包含的氨基酸之一)的量，以评价细胞外基质向组织的沉积。湿肾脏组织在110℃下干燥3小时并称重。然后，将6n hcl(100μl/1mg干组织)加入干组织中，并将它们煮沸过夜。通过过滤净化样品，并将每个样品10μl接种到96孔板上。将装有样品的板在室温下干燥过夜，并使用羟脯氨酸测定试剂盒(biovision)测量羟脯氨酸。
[0491]
如图11所示，在疾病诱导的肾脏中观察到羟脯氨酸含量显著增加。cpr//cr处理抑制肾纤维化。
[0492]
数据表示为平均值+/-平均值的标准误差(sem)。使用学生t检验或dunnett多重比较检验进行统计分析。当p值＜0.05时，认为差异具有显著性。
[0493]
4.2cpr//cr双特异性抗体改善aldort小鼠模型中的肾功能并预防肾纤维化
[0494]
在col4a3基因缺陷小鼠(所谓的alport小鼠模型，其发展为进行性肾小球和间质纤维化)中评价单克隆抗体cpr//cr的体内有效性。
[0495]
7周龄的无特定病原体col4a3敲除雄性小鼠和c57bl/6j雄性小鼠由clea japan inc.(shizuoka，japan)供应，并在处理开始前适应环境3周。将动物保持在20至26℃下，12：12小时光/暗循环，并饲喂市售标准饲料(#ce-2；clea japan inc.，shizuoka，japan)和自
由饮水。
[0496]
在研究期间每2周从颈静脉或后腔静脉采集血液样品。制备血浆样品并保持在-80℃下直至测定。在研究期间每2周采集20小时尿液。通过自动分析仪tba-120fr(canon medical systems，tochigi，japan)测量血浆和尿液生化，包括肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂c。根据12周龄生化指标(尿白蛋白/肌酸酐比、血浆肌酸酐、血浆尿素氮)和体重，将alport小鼠分为患病对照组、cpr001组、cr002组和联合处理组。
[0497]
从14周龄至22周龄，每周两次皮下施用所有单克隆抗体。向野生型(c57bl/6n)和患病对照组施用抗klh抗体ic17。抗体，包括针对pdgf-b和pdgf-d的双特异性抗体cpr//cr，以50mg/kg施用。抗klh抗体ic17在本研究中用作阴性对照。在20周龄时在异氟醚麻醉下通过放血处死动物。迅速取出肾脏。部分肾脏组织在液氮或干冰中速冻用于分子分析。
[0498]
如图12所示，alport小鼠显示血浆肌酸酐浓度显著增加，而cpr//cr处理组显示血浆肌酸酐浓度降低。
[0499]
以与实施例4.1中相同的方式从肾脏组织提取总rna。小鼠线粒体核糖体蛋白l19(mrpl19)用作每个样品的内源性参考。使用双δct分析计算相对mrna表达值。
[0500]
如图13所示，基于肾脏中1型胶原蛋白α1 mrna水平，评估抗体对肾纤维化的抑制活性。alport小鼠的胶原蛋白mrna水平显著增加，而cpr//cr显示显著降低。
[0501]
测量肾脏中羟脯氨酸(其是胶原蛋白中包含的氨基酸之一)的量，以评价细胞外基质向组织的沉积。湿肾脏组织在110℃下干燥3小时并称重。然后，将6n hcl(100μl/1mg干组织)加入干组织中，并将它们煮沸过夜。通过过滤净化样品，并将每个样品10μl接种到96孔板上。将装有样品的板在室温下干燥过夜，并使用羟脯氨酸测定试剂盒(biovision)测量羟脯氨酸。
[0502]
如图14所示，在疾病诱导的肾脏中观察到羟脯氨酸含量显著增加，并且cpr//cr抑制肾纤维化。
[0503]
数据表示为平均值+/-平均值的标准误差(sem)。使用学生t检验或dunnett多重比较检验进行统计分析。当p值＜0.05时，认为差异具有显著性。
[0504]
4.3cpr//cr双特异性抗体预防cdahfd模型中的肝纤维化
[0505]
单克隆抗体cpr//cr的体内有效性在cdahfd(胆碱缺乏l-氨基酸定义的高脂饲料)诱导的小鼠nash/肝纤维化模型中进行评价。
[0506]
所有实验动物护理和处理均按照chugai pharmabody research pte.ltd的实验室动物护理和使用指南中的建议进行。
[0507]
6周龄的无特定病原体c57bl/6ntac雄性小鼠购自invivospte ltd(新加坡)，并在处理开始前适应环境1周。将动物保持在20至26℃下，12:12小时光/暗循环，并饲喂市售标准饲料(5p75；pmi nutrition int
′
l(labdiet)，美国密苏里)和自由饮水。
[0508]
试验饲料胆碱缺乏l-氨基酸定义的高脂饲料(cdahfd；#a06071302)购自researchdiets(new brunswick，nj，usa)。研究期间，4组喂食cdahfd(n＝8)，1组喂食5p75作为正常对照组。
[0509]
所有单克隆抗体均在研究期间的第0天和第7天通过静脉内注射施用，每周一次。针对pdgf-b和pdgf-d的cpr//cr双特异性抗体以不同剂量施用。抗klh抗体ic17在本研究中用作阴性对照。将动物称重，然后在第14天在异氟醚麻醉下放血处死。从心腔或后腔静脉采
集血液样品并保持在-80℃下直至测定。迅速取出肝脏并称重。部分肝脏组织在液氮或干冰中速冻用于分子分析。
[0510]
使用rneasy mini kit(qiagen)从肝脏组织提取总rna，使用taqman(注册商标)gene expression cells-to-ct kit(life technologies)合成cdna。使用quantstudio
tm 12kflex实时pcr系统(thermofisher)测量基因表达。基因的引物和taq-man探针购自applied biosystems。小鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)用作每个样品的内源性参考。使用双δct分析计算相对mrna表达值。
[0511]
如图15所示，针对肝纤维化的抗体抑制活性基于肝脏中1型胶原蛋白α1 mrna的量进行评估。cdahfd小鼠的胶原蛋白mrna水平显著增加，而cpr//cr处理组显示降低。
[0512]
测量血浆天冬氨酸转氨酶(ast)和丙氨酸转氨酶(alt)(它们是肝酶)以评价肝脏疾病和损伤。根据试剂盒说明(biovision#k752和#k753)测量血浆ast和alt。
[0513]
如图16所示，在疾病诱导组中观察到血浆alt和ast升高，而cpr//cr处理组显示降低。
[0514]
数据表示为平均值+/-平均值的标准误差(sem)。使用学生t检验或dunnett多重比较检验进行统计分析。当p值＜0.05时，认为差异具有显著性。
[0515]
参考实施例1
[0516]
抗pdgf抗体的结合活件评估
[0517]
1.1用于抗pdgf-b/d双特异性抗体结合亲和力评价的biacore分析
[0518]
使用biacore t200仪器(ge healthcare)在25℃下测定抗pdgf抗体(cpr001、cr002或cpr//cr双特异性抗体)在ph 7.4下与人pdgf-b或pdgf-d结合的结合亲和力(kd)(表3)。使用胺偶联试剂盒(ge healthcare)将抗人fc(ge healthcare)固定在cm4传感器芯片的所有流动池上。所有抗体和分析物均在pbs-net(10mm磷酸盐、287mm nacl、2.7mm kcl、3.2mm edta、0.01％p20、0.005％nan3，ph7.4)中制备。每种抗体均被抗人fc捕获至传感器表面上。抗体捕获水平的目标是100共振单位(ru)。重组人pdgf-b或pdgf-d以1和5nm进样，通过五倍连续稀释制备，然后解离。传感器表面在每个循环均使用3m mgcl2进行再生。通过使用biacore t200评价软件2.0版(ge healthcare)处理数据并将其拟合至1∶1结合模型来确定结合亲和力。
[0519]
(表3)抗pdgf-b或抗pdgf-d抗体与人pdgf-b或人pdgf-d结合的结合亲和力(kd)。
[0520][0521]
注：
[0522]
n.d.由于低结合反应，无法确定kd。
[0523]
*强结合剂，解离速率慢《1e-05，kd不能唯一确定。
[0524]“e-n”表示“10的-n次方”或“10-n”(例如，1.0e-6表示1.0
×
10-6
)。
[0525]
1.2用于hpdgf-d/hpdgfrβ/抗pdgf-d抗体的biacore预混竞争测定
[0526]
抗pdgf-d抗体(cr002)和hpdgfrβ针对hpdgf-d的竞争结合通过预混竞争测定进行评价。具有小鼠fc的抗pdgf-d抗体(cr002)(终浓度为200nm至1.6nm，两倍系列稀释)与人pdgf-d(终浓度：10nm)在pbs-net中混合并在25℃下孵育1小时达到平衡。然后将每种抗pdgf-d抗体(cr002)和人pdgf-d稀释混合物注射至cm4芯片的表面上方，该芯片覆盖有被抗人fc(ge healthcare)捕获的人pdgfrβ-higg1。传感器表面在每个循环均使用3mmgcl2进行再生。记录第95秒的结合反应，并绘制结合反应与抗pdgf-d抗体(cr002)浓度的关系图。pdgf-d与pdgfrβ的结合被浓度增加的抗pdgf-d抗体(cr002)阻断，如图17所示。
[0527]
1.3hpdgf-d/hnrp1-fc/抗pdgf-d抗体的biacore竞争测定
[0528]
进行biacore串联阻断测定以表征抗pdgf-d抗体(cr002)和hnrp1-fc针对hpdgf-d的结合表位。该测定在biacore t200仪器(ge healthcare)上于37℃下在hbs-ep+缓冲液10mm hepes ph 7.4、150mm nacl、3mm edta、0.005％v/v p20中进行。使用胺偶联试剂盒(gehealthcare)将人pdgf-d固定在cm4传感器芯片的流动池4上。在流通池3上进行空白固定，并将其用作参考流通池。然后注射饱和浓度的100nm nrp1-fc 3分钟，然后类似地注射1000nm抗pdgf-d抗体(cr002)作为竞争配偶体。传感器表面在每个循环均使用3m mgcl2进行再生。如图18所示，cr002注射的结合反应大于缓冲液注射所观察到的反应，表明cr002和hnrp-1结合hpdgf-d上的不同表位。
[0529]
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对上述发明进行了一些详细的描述，但这些描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。上面引用的所有专利和科学文献的公开内容均通过引用以其全文并入本文。