一种降解
α-茄碱的谷氨酸杆菌gh202103菌株及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种降解α-茄碱的谷氨酸杆菌gh202103菌株及其制备方法和应用。
背景技术：
2.α-茄碱是一种存在于茄科作物中有毒的糖苷生物碱，又名龙葵素、龙葵碱、马铃薯毒素等，α-茄碱在马铃薯中含量较高，在马铃薯中α-茄碱含量占马铃薯糖苷生物碱总量的95％以上，不同组织α-茄碱含量存在一定差异。α-茄碱具有抗微生物、抗虫和抗真菌等作用，马铃薯中的α-茄碱都具有杀虫活性。此外，α-茄碱对人畜具有较高的毒性，对人类正常肝细胞表现出显著的细胞毒性，还能抑制人类中枢神经系统胆碱酯酶的活性，破坏肠胃细胞膜，误食茄碱可引起恶心、呕吐、腹泻、丧失知觉、麻痹、休克等症状，若抢救不及时会造成死亡。此外，茄碱还有较强的致畸和生殖毒性。
3.马铃薯块茎蛾是一种危害马铃薯等茄科植物的寡食性鳞翅目害虫，其中肠中存在丰富多样的微生物，这些肠道微生物在马铃薯块茎蛾寄主的适应性调控中发挥着生要作用。有研究发现，马铃薯块茎蛾中肠中节杆菌属和沙雷氏菌属细菌对马铃薯中的糖苷生物碱α-茄碱具有高效降解作用。而本研究发现马铃薯块茎蛾中肠中的谷氨酸杆菌具有降解α-茄碱的作用。
技术实现要素：
4.针对现有技术的上述缺陷，本发明提供一种降解α-茄碱的谷氨酸杆菌gh202103菌株及其制备方法和应用。
5.为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种降解α-茄碱的谷氨酸杆菌gh202103菌株，该菌株为谷氨酸杆菌，保藏名称为谷氨酸杆菌glutamicibacter halophytocola；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：cgmcc no.22638。
6.进一步地，所述的降解α-茄碱的谷氨酸杆菌gh202103菌株经形态及16srdna为seq id no.1所示的核苷酸序列。经测序鉴定，为谷氨酸杆菌。
7.该菌株经lb平板划线纯化培养发现，菌株s菌落不规则形，边缘扇形，淡黄色，表面褶皱，湿润，高凸面。经革兰氏染色为紫色，革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状。
8.本发明所述的谷氨酸杆菌gh202103菌株制备的谷氨酸杆菌gh202103菌株菌剂。
9.进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
10.(a)所述的谷氨酸杆菌gh202103菌株的培养物的发酵液初提物；
11.(b)所得谷氨酸杆菌gh202103菌株细胞的超声裂解上清；
12.(c)所得谷氨酸杆菌gh202103菌株细胞的超声裂解沉淀。
13.本发明所述的谷氨酸杆菌gh202103菌株菌剂的制备方法，包括如下步骤：
14.(1)从采集到的马铃薯块茎蛾幼虫中肠中分离获得野生谷氨酸杆菌gh202103菌株，在lb培养基上培养，将菌体转接到新配制的lb培养基上进行纯化；
15.(2)然后纯化培养获得纯化的谷氨酸杆菌gh202103；
16.(3)采用高效降解菌株胞外酶进行α-茄碱降解能力测定，菌株的胞外酶对α-茄碱的降解率达99.55％。
17.本发明所述的谷氨酸杆菌gh202103菌株在α-茄碱降解制剂中的应用。
18.有益效果：本发明提供的谷氨酸杆菌gh202103是一种能用于降解茄科植物有毒的α-茄碱的降解菌，具有降解能力强、环境安全的特点，可以用于生物降解α-茄碱。
19.与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)分离获得的谷氨酸杆菌gh202103菌株是对谷氨酸杆菌gh202103具有强降解作用的细菌菌株。
20.(2)谷氨酸杆菌gh202103菌株培养简单，生长快速，易于在室内大量培养繁殖。
21.(3)本发明提供的谷氨酸杆菌gh202103是一种能用于绿色降解α-茄碱的害虫肠道细菌，能提高马铃薯块茎蛾对茄科植物的适应性，还能高效降解α-茄碱，具有降解作用强、环境无污染的特点，可以广泛用于生物降解α-茄碱。
附图说明
22.图1为本发明的谷氨酸杆菌gh202103的细胞形态图。
具体实施方式
23.以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
24.实施例1
25.本发明的一种降解α-茄碱的谷氨酸杆菌gh202103菌株，该菌株为谷氨酸杆菌，保藏名称为谷氨酸杆菌glutamicibacter halophytocola；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：cgmcc no.22638。
26.所述的降解α-茄碱的谷氨酸杆菌gh202103菌株的16s rdna的基因序列为seq id no.1所示的核苷酸序列。
27.该菌株经lb平板划线纯化培养发现，菌株s菌落不规则形，边缘扇形，淡黄色，表面褶皱，湿润，高凸面。经革兰氏染色为紫色，革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状。
28.本发明所述的谷氨酸杆菌gh202103菌株制备的谷氨酸杆菌gh202103菌株菌剂。
29.其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
30.(a)所述的谷氨酸杆菌gh202103菌株的培养物的发酵液初提物；
31.(b)所得谷氨酸杆菌gh202103菌株细胞的超声裂解上清；
32.(c)所得谷氨酸杆菌gh202103菌株细胞的超声裂解沉淀。
33.本发明所述的谷氨酸杆菌gh202103菌剂的制备方法，包括如下步骤：
34.(1)从采集到的马铃薯块茎蛾幼虫中肠中分离获得野生谷氨酸杆菌gh202103菌株，在lb培养基上培养，将菌体转接到新配制的lb培养基上进行纯化；
35.(2)然后纯化培养获得纯化的谷氨酸杆菌gh202103；
36.(3)采用高效降解菌株胞外酶进行α-茄碱降解能力测定，菌株的胞外酶对α-茄碱的降解率达99.55％。
37.本发明所述的谷氨酸杆菌gh202103菌剂在α-茄碱降解方面的应用。
38.试验例1
39.谷氨酸杆菌gh202103的分离及鉴定
40.本发明发明人于2020年10月20日从马铃薯块茎蛾幼虫中肠中分离到谷氨酸杆菌gh202103菌株。本发明发明人发现该菌对α-茄碱具有较强降解作用。
41.下面给出的是本发明提供的谷氨酸杆菌gh202103及其在α-茄碱降解方面的应用的试验例。
42.1.1材料
43.1.1.1供试菌株
44.菌株于2020年10月20日分离自云南省昆明市黑龙潭云南农业大学草地贪夜蛾幼虫中肠。
45.1.1.2菌株的分离培养
46.剥取健康的马铃薯块茎蛾3龄幼虫50头，重复3次，共150头，置于无菌培养皿中饥饿处理8h。在超净工作台中进行解剖，解剖前先将超净工作台台面清洗干净，所有解剖器具用75％酒精消毒，再用紫外灯照射处理30min以上。解剖前将马铃薯块茎蛾幼虫于-20℃冷冻2-3min，待其麻痹后，用无菌水冲洗2次，每次1min，75％酒精消毒90s，最后用无菌水冲洗2次，每次1min(zheng et al.,2020)。取出后放置于无菌洁净的培养皿中，用无菌镊子从虫体尾部取出肠道，将内容物溶于装有1ml无菌pbs缓冲液的离心管中，充分匀浆。纯化的菌株采用sday斜面培养基保存于4℃冰箱。
47.1.1.3菌落形态观察
48.挑取上述筛选获得的高效降解菌株单菌落在lb培养基上进行划线，于25℃下培养72h，参照按《常用细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》的鉴定方法，观察并记录单菌落的形态、颜色、隆起度、边缘形状、干湿等特征。并用革兰氏染色法对菌株进行染色，观察细胞形态和颜色，紫色代表阳性菌，红色代表阴性菌。
49.分子鉴定：采用冻溶法提取细菌dna(冯广达等，2013；郑亚强等，2017)，具体操作如下：将菌株分别接种于lb液体培养基中，然后放置于25℃、180r/min的摇床，振荡培养48h。每个菌株分别取2ml菌液于离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。在上述沉淀中加入500μl无菌水，涡旋振荡1min，使其菌体完全悬浮混匀。然后液氮冰冻10min，沸水浴5min，12000r/min离心2min，取上清液作为pcr模板dna备用。运用细菌通用引物27f和1492r扩增16s rrna基因。反应体系为25μl：引物各1μl，模板dna 1μl，taq pcr master mix 12.5μl，dd h2o 9.5μl。反应条件:94℃热变性5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，32个循环，72℃延伸10min。取3μl pcr产物进行凝胶电泳检测。鉴定好的pcr产物送生工生物工程(昆明)股份有限公司测序。运用contigexpress软件对测序结果进行拼接，将拼接好的16s rdna序列，通过ncbi blast程序与ncbi数据库中的数据进行比对，查找相似性最高的典型菌株并下载序列(如下)。运用mega7软件，采用国际通用的邻接法(neighbor-joining)和kimura双参数矫正模型构建系统进化树。以重复抽样1000次进行bootstrap验
证，分析评估系统进化树的拓扑结构的稳定性。
50.谷氨酸杆菌gh202103菌株的16s rdna的基因序列：tgctaccatgcaagtcgaacgatgaagcccagcttgctgggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccccgactttgggataagcccgggaaactgggtctaataccggatatgacttcctgccgcatggtgggttgttgaaagatttatcggtgggggatggactcgcggcctatcagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcggaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagtagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtctgccgtgaaagtccgaggctcaacctcggatctgcggtgggtacgggcagactagagtgatgtaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggcaggtctctgggcatttactgacgctgaggagcgaaagcatggggagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgggcactaggtgtgggggacattccacgttttccgcgccgtagctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatgtgccagaccgctccagagatggggtttcccttcggggctggttcacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgttccatgttgccagcacgtagtggtggggactcatgggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcttgggcttcacgcatgctacaatggccggtacaatgggttgcgatactgtgaggtggagctaatccctaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagtcacgaaagttggtaacacccgaagccgatggcctaaccaccttgtgtggggggagtcgtcgaaggtg。
51.1.2结果
52.经lb平板划线纯化培养发现，菌株s2菌落不规则形，边缘扇形，淡黄色，表面褶皱，湿润，高凸面。经革兰氏染色为紫色，革兰氏阳性菌，谷氨酸杆菌gh202103的细胞形态为杆状(图1)。
53.试验例2
54.谷氨酸杆菌gh202103对α-茄碱的降解作用测定
55.1材料
56.谷氨酸杆菌gh202103菌株。挑取单克隆菌落接入5ml lb液体培养基中，25℃，180rpm振荡培养，使od
600nm
＝1.0。诱导：在100ml三角瓶中，取1ml细菌培养液添加到9ml lb培养基中(最终od
600nm
＝0.1)，补充酸性磷酸盐缓冲液(对照)或5μg/mlα-茄碱，180rpm，25℃，震荡培养20h。将菌液在25℃4000
×
g离心20min取上清，获得胞外酶粗提液，每个菌株重复3次。
57.胞外酶降解体系：100μlph 5.550mm的醋酸钠缓冲液，400μlph 5.0100mm醋酸钠缓冲液(0.2mmα-茄碱)底物，450μl胞外粗提液，共950μl，25℃孵育35h。90℃加热10min终止酶反应，然后在17000
×
g离心10min，转移上清液。用于lc-ms分析降解过程中产生的中间代谢物。
58.2.结果
59.采用高效降解菌株胞外酶进行α-茄碱降解能力测定，结果表明，谷氨酸杆菌
gh202103菌株对降解率达99.55％。谷氨酸杆菌gh202103菌株对α-茄碱的降解作用如表1所示：
60.表1
[0061][0062]
根据谷氨酸杆菌gh202103菌株胞外酶对α-茄碱降解能力测定，获得谷氨酸杆菌gh202103菌株胞外酶对α-茄碱降解率达99.55％。由此表明，谷氨酸杆菌gh202103菌株对α-茄碱具有很强的降解能力。
[0063]
综上所述，本发明的谷氨酸杆菌gh202103菌株是一种能用于降解α-茄碱的昆虫肠道共生菌，具有降解作用强、无环境污染的特点，可以广泛用于生物降解α-茄碱。
[0064]
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。