1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种促生复合菌剂及其筛选方法与应用。
背景技术：
：：2.公开该
背景技术：
：部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。3.以微生物为核心研制的微生物菌肥是最具潜力的一类低能耗和环境友好型的肥料，具有促进植物根系发育、增强植物矿物质养分吸收和提高耐受逆境胁迫的能力。微生物菌剂分为单菌剂和复合菌剂，单菌剂是由一种功能微生物制成；复合菌剂是由两种或以上的有益微生物组成。单菌剂功能单一、效果不稳定，不能满足多种功能和根际复杂环境的生态稳定。复合菌剂具有协同作用，可以解决单一菌剂作用机制单一，效果不稳定等问题，复合的菌株可以通过分泌不同生理活性物质，影响植株的生理代谢活动，促进植物的生长，具有种类更多样、功能更齐全、促生效果更好的优点。然而，也有不少报道指出复合菌剂并未使促生效果提高，在研制复合菌剂过程中，菌种的选择是制备高效复合微生物菌剂的关键。目前不同功能微生物组装的方法主要有不拮抗组合法、复合系法。(1)不拮抗组合法是目前采用的比较多的一种方法，但该方法存在很多弊端，例如菌株功能减弱或难以发挥等；(2)复合系法也是一种常用的菌种选择方法，但是该方法也存在一些缺点，如不稳定、难以保存和难以实现发酵；另外，使用的“天然”微生物群落很受关注，因为它们在相对明确的条件下运行，目标物质的产生或降解可以作为性能的衡量标准。例如，在厌氧消化和废水处理厂中，生产沼气或减少有毒有机化合物可被视为群落功能，功能稳定性、性能和群落组成相关性等参数可以长期被测量。这种方法虽然很有前景，但需要在复杂微生物群落中准确测量物种多样性，这限制了它的应用。技术实现要素：4.为了克服上述问题，本发明提供了一种促生复合菌剂及其筛选方法与应用，创新地提出复合菌系组合技术，并制备成复合菌剂，应用于盆栽试验中证实该复配组合技术的有效性。5.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：6.本发明的第一个方面，提供了一种促生复合菌剂的筛选方法，包括：7.从核桃根际土壤中分离功能菌株(产iaa能力)，作为供试菌株；8.将所述供试菌株活化后，进行平板对峙试验，筛选出不存在拮抗或拮抗较弱的菌株组合；9.将不存在拮抗或拮抗较弱的菌株分别进行组合，进行共培养筛选具有协同作用的菌株组合。在相同菌数时(同一od值)，若组合的产iaa能力高于组合中每一个单菌，说明组合中各个菌之间具有协同性。该方法具有明确的可操作性、重复性和便于规模化生产运用，不需要明晰菌群之间复杂的代谢关系。10.本发明的第二个方面，提供了一种促生复合菌剂的制备方法，包括：11.根据上述方法筛选出的复合菌系选择相应的单一菌株进行组合，并将各单一菌株按相同接种量接种至同一三角瓶中，共同培养至稳定期，即得。12.本发明的第三个方面，提供了上述的促生复合菌剂在改善核桃幼苗的农艺性状和生理指标，以及土壤酶活中的应用。13.本发明的第四个方面，提供了上述的促生复合菌剂在核桃幼苗促生或制备微生物肥料中的应用。14.本发明的有益效果在于：15.(1)本发明开发了一种复合菌系的复配方法，较以往的方法，不仅可操作性强，而且通过以产iaa能力为指标筛选得到的复合菌系(5-49+5-54+6-30)较对照组及其他组合和单一菌株能明显改善核桃幼苗的农艺性状和生理指标，以及土壤酶活。因此，本发明可为微生物肥料的菌种复配提供有效的参考，和对核桃幼苗促生提供一种有效的复合菌剂。16.(2)本技术的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。附图说明17.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。18.图1是本发明中菌株拮抗试验代表图；19.图2是本发明中核桃盆栽处理60d生长情况；20.图3是本发明中30天和60天核桃幼苗株高增长值；21.图4是本发明中30天和60天核桃幼苗茎粗增长值；22.图5是本发明中30天和60天核桃幼苗分枝数增长值；23.图6是本发明中核桃苗鲜重图；24.图7是本发明中核桃苗干重图；25.图8是本发明中核桃苗主根长图；26.图9是本发明中核桃苗主根粗图；27.图10是本发明中核桃叶片超氧化物歧化酶活性图28.图11是本发明中核桃叶片过氧化物酶活性图；29.图12是本发明中核桃叶片过氧化氢酶活性图；30.图13是本发明中核桃叶片可溶性蛋白含量图；31.图14是本发明中核桃叶片游离脯氨酸含量图；32.图15是本发明中核桃叶片净光合速率图；33.图16是本发明中核桃叶片蒸腾速率图；34.图17是本发明中核桃叶片气孔导度；35.图18是本发明中核桃叶片胞间co2浓度；36.图19是本发明中30天和60天核桃叶片叶绿素相对含量；37.图20是本发明中核桃叶片叶绿素相对含量(spad)动力学曲线；38.图21是本发明中与核桃叶片spad相关性较强的叶绿素荧光参数；39.图22是本发明中核桃根际土壤蔗糖酶活性；40.图23是本发明中核桃根际土壤脲酶活性；41.图24是本发明中核桃根际土壤酸性磷酸酶活性；42.图25是本发明中核桃根际土壤脱氢酶活性；43.图26是本发明中核桃根际土壤过氧化氢酶活性；44.注：同一暴露时间不同小写字母表示不同处理经anovasummary在p《0.05水平差异显著；*表示经onewayanovasummary在p《0.05水平差异显著；ns表示经onewayanovasummary在p》0.05水平差异不显著；具体实施方式45.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员通常理解的相同含义。46.一种促生复合菌剂的筛选方法，包括：47.从核桃根际土壤中分离功能菌株(产iaa能力)；48.将所述供试菌株活化后，进行平板对峙试验，筛选出不存在拮抗或拮抗较弱的菌株组合；49.将不存在拮抗或拮抗较弱的菌株分别进行组合，进行共培养筛选具有协同作用的菌株组合。在相同菌数时(同一od值)，若组合的产iaa能力高于组合中每一个单菌，说明组合中各个菌之间具有协同性。该方法具有明确的可操作性、重复性和便于规模化生产运用，不需要明晰菌群之间复杂的代谢关系。50.在一些实施例中，所述供试培养基为lb培养基，包括：lb液体培养基、lb固体培养。51.在一些实施例中，所述lb液体培养基的由如下重量份的原料组成：蛋白胨10～15份，酵母粉5～10份，nacl10～15份、水960～975份；52.在一些实施例中，所述固体培养基还包括：1.6％～2％琼脂。53.在一些实施例中，iaa培养基由如下重量份的原料组成：蛋白胨10～15份，酵母粉5～10份，nacl10～15份，色氨酸0.2～0.3份、水960～975份。54.在一些实施例中，所述单菌iaa产量测定的具体方法为：将初筛菌株接种到与初筛相同的液体培养基中，摇床培养；取发酵液、固液分离，收集上清液，加入比色剂，使其显色，测od530处的吸光度，以od600＝1时，根据iaa标准曲线计算单位体积的iaa浓度。55.在一些实施例中，所述共培养的具体步骤为：将菌种接种lb液体培养基中，37～37.5℃，180～200rpm培养12～14h；56.将不同菌株的菌悬液浓度调至一致，单一菌种的按2～4％接种量接种到iaa培养基中，菌种组合的每种菌按0.8～1.2％接种量接种到同一iaa培养基中(需要保证两者接种量一致)，于28～28.5℃，180～200rpm培养4～5d；57.取培养4～5d的菌悬液固液分离，加入比色剂，使其显色，吸取上清液测定其od530值，以od600＝1时，根据iaa标准曲线计算单位体积的iaa浓度。58.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。59.实施例1：60.一、实验材料的准备61.1)供试品种62.香玲核桃幼苗。63.2)供试菌株64.供试菌株均为实验室前期分离自山东省济南市港沟镇香玲核桃根际土壤优良菌株，详见表1。65.表1供试菌株66.table1strainsusedinthisstudy[0067][0068]3)供试培养基[0069]lb培养基[0070]lb液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl10g，加水定容至1l。121℃高压灭菌20min。[0071]lb固体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl10g，加水定容至1l，琼脂1.6％。121℃高压灭菌20min。[0072]4)iaa选择性培养基[0073]蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl10g，色氨酸200mg，加水定容至1l。121℃高压灭菌20min。[0074]二、菌株协同组合筛选[0075]1)平板对峙试验[0076]从保存试管斜面/平板上取单菌落划线接种至新鲜的lb平板中，37℃培养12h进行活化。将活化后的菌株两两在培养基平板上相互垂直划线置于37℃生化培养箱内培养24h，观察细菌的生长和相互抑制情况。[0077]2)单菌iaa产量测定[0078]将上述不拮抗的初筛功能菌株接种到产iaa选择性培养基中，置于28℃，180rpm的摇床中培养4d。取2ml发酵液，10000rpm离心10min，收集上清液加入等体积salkowski比色液，避光静置30min，测od530处的吸光度，以od600＝1时，根据iaa标准曲线计算单位体积的iaa浓度。[0079]3)协同组合筛选[0080]将菌种接种到iaa选择性培养基中，37℃，180rpm培养12h。不同菌株的菌悬液浓度调至一致，单一菌种的按3％接种量接种到iaa选择性培养基中，菌种组合的每种菌按1％接种量接种到iaa选择性培养基中(保证两者接种量一致)，28℃，180rpm培养4d。取培养4d的菌悬液2ml，10000rpm离心10min，吸取上清液加入等体积salkowski比色液，避光静置30min，测定其od530值，以od600＝1时，根据iaa标准曲线计算单位体积的iaa浓度。[0081]实施例2[0082]1)复合菌剂制备[0083]1筛选复合菌系[0084]1.1互不拮抗的菌株组合[0085]将13株优良菌株进行三三交叉划线进行拮抗试验，结果表明：1-31+2-40+3-60、1-31+2-40+5-49、1-31+266+5-54、1-31+2-40+5-54、1-31+3-3+5-54、1-31+5-49+5-54、3-3+4-27+6-30、3-3+5-54+6-19、3-3+5-54+6-25、3-3+6-8+6-19、3-3+6-25+6-30、5-49+5-54+6-8和5-49+5-54+6-30这13组菌株组合不存在拮抗或拮抗较弱。菌株拮抗试验代表图如图1所示。[0086]1.2复合菌系产iaa能力分析[0087]将拮抗试验筛选得到的13组互不拮抗的菌株组合进行产iaa能力分析，其中产iaa能力提高且功能互补的菌株组合见表2(为了更好的展示结果，该表同时列出了单菌的iaa产量)。结果表明：菌株组合1-31+3-3+5-54(假蕈状芽孢杆菌+蒙氏假单胞菌+同温层芽孢杆菌)、1-31+2-40+5-49(假蕈状芽孢杆菌+阿耶波多氏芽孢杆菌+沙福芽孢杆菌)和5-49+5-54+6-30(沙福芽孢杆菌+同温层芽孢杆菌+耐盐芽孢杆菌)产出的iaa浓度显著高于其它组合，且高于组合内的单一菌株。[0088]表2细菌发酵液产iaa的浓度[0089]table2concentrationofiaaproducedbybacterialfermentationbroth[0090][0091]1.3菌剂制备[0092]单一菌剂制备，分别活化菌株，在lb培养基中培养菌体浓度达到1×108cfu·ml-1备用；复合菌剂制备，将上述筛选到的组合中单一菌株按相同接种量(分别按照1％的接种量)接种至同一三角瓶lb培养基中，共同培养至稳定期，用无菌水调节至1×108cfu·ml-1备用。[0093]2)盆栽试验设计[0094]试验选择6种单一菌剂、3种复合菌剂和lb对照组，共设计10个处理组(表3)。将上述菌剂对核桃幼苗根部进行浇灌(10ml/棵)，后期管理过程保持相同浇水量，用液体lb培养基作为对照组，每隔3d浇1次水，培养60d。[0095]表3盆栽试验设计[0096]table3potexperimentdesign[0097][0098]实验例1[0099]对实施例2的盆栽试验进行测试，包括：[0100]1)核桃幼苗农艺性状测定[0101]每个处理随机选取5株核桃幼苗，测定其株高增长值、茎粗增长值、分支增长数及核桃苗鲜重和干重。[0102]2)核桃幼苗叶片生理特性及根际土壤酶活测定[0103]叶绿素相对含量测定参考便携式叶绿素仪；游离脯氨酸含量测定参考磺基水杨酸法，可溶性蛋白含量测定参考考马斯亮蓝染色法；核桃叶片酶活：氧化物岐化酶(sod)、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)活性测定参照张志良主编的《植物生理学实验指导》；核桃土壤酶活：蔗糖酶活性参考魏元(2016)方法，脲酶活性测定参考关松荫(1986)方法，酸性磷酸酶活性测定借鉴索莱宝试剂盒使用方法，脱氢酶活性测定借鉴科铭试剂盒使用方法。[0104]3)数据分析[0105]采用spss19.0软件进行数据的统计分析，并采用邓肯新复极差法进行差异显著性检验(p≤0.05)。利用软件graphpadprism9、excel2020、origin2021进行数据的整理、分析和绘图。[0106]实验例2[0107]对实验例1的测试结果进行分析，具体如下：[0108]2.2复合菌剂对核桃幼苗生长的影响[0109]核桃盆栽正常促生组处理60d生长情况如图2所示。[0110]2.1农艺性状[0111]2.1.1株高[0112]盆栽30d株高增长值情况如图3所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的株高增长值显著优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的株高增长值分别提高了45.2％、38.7％、71.0％、38.7％、38.7％和58.1％，t3和t6处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的株高增长值分别提高了64.5％、54.8％和91.4％，均达到显著性差异(p《0.05)。复合菌剂t7、t8和t9处理组分别较组合内单一菌剂处理组株高增长值均未达到显著性差异。[0113]盆栽60d株高增长值情况如图3所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的株高增长值持续优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的株高增长值分别提高了13.8％、13.8％、17.8％、22.3％、30.0％和29.2％；复合菌剂t7、t8和t9处理组的株高增长值分别提高了20.0％、20.0％和31.3％，复合菌剂t9处理组达到显著性差异(p《0.05)。复合菌剂t7、t8和t9处理组分别较组合内单一菌剂处理组株高增长值均未达到显著性差异。[0114]2.1.2茎粗[0115]盆栽30d茎粗增长值情况如图4所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的茎粗增长值显著优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的茎粗增长值分别提高了34.5％、30.5％、48.5％、74.1％、101.5％和86.4％，t5和t6处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的茎粗增长值分别提高了78.2％、71.5％和91.4％，t9处理组达到显著性差异(p《0.05)。复合菌剂t7、t8和t9处理组分别较组合内单一菌剂处理组茎粗增长值均未达到显著性差异。[0116]盆栽60d茎粗增长值情况如图4所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的茎粗增长值优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的茎粗增长值分别提高了9.3％、11.1％、23.7％、33.8％、35.7％和31.4％，t5处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的茎粗增长值分别提高了18.3％、26.3％和36.1％，t9处理组达到显著性差异(p《0.05)。复合菌剂t7、t8和t9处理组分别较组合内单一菌剂处理组茎粗增长值均未达到显著性差异。[0117]2.1.3分枝数[0118]盆栽30d分枝增长值情况如图5所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的分枝增长值高于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的分枝增长值分别提高了94.1％、47.1％、64.7％、70.6％、88.2％和94.1％，t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组均达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的分枝增长值均达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了100.0％、129.4％和141.2％。复合菌剂t9较组合内单一菌剂t4、t5和t6处理幼苗分枝增长情况达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了41.4％、28.1％和24.2％。[0119]盆栽60d分枝增长值情况如图5所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的分枝增长值高于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的分枝增长值分别提高了29.4％、26.5％、14.3％、19.1％、20.6％和34.5％，t1、t2、t4、t5和t6处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的分枝增长值均达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了32.5％、37.2％和62.7％。复合菌剂t7较组合内单一菌剂t3处理幼苗分枝增长情况达到显著性差异(p《0.05)，提高了15.8％；复合菌剂t8较组合内单一菌剂t4处理幼苗分枝增长情况达到显著性差异(p《0.05)，提高了15.2％；复合菌剂t9较组合内单一菌剂t4、t5和t6处理幼苗分枝增长情况达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了36.6％、35.0％和21.0％。[0120]2.1.4鲜重[0121]盆栽60d核桃苗鲜重情况如图6所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的鲜重优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的鲜重分别提高了39.1％、44.1％、31.2％、50.0％、77.1％和56.2％，t2、t4、t5和t6处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的鲜重分别提高了81.5％、43.5％和79.6％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0122]2.1.5干重[0123]盆栽60d核桃苗干重情况如图7所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的干重优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的干重分别提高了21.7％、72.6％、40.0％、73.9％、67.2％和76.4％，t2、t4、t5和t6处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的干重分别提高了60.6％、50.3％和78.6％，复合菌剂t7和t9处理组达到显著性差异(p《0.05)。[0124]2.1.6主根长[0125]盆栽60d核桃苗主根长情况如图8所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的主根长优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4和t5处理组的主根长分别提高了6.5％、12.1％、23.6％、13.1％和89.4％，t2、t3、t4和t5处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的主根长分别提高了87.9％、82.4％和107.0％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0126]2.1.7主根粗[0127]盆栽60d核桃苗主根粗情况如图9所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的主根粗优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t2、t3、t4、t5和t6处理组的主根粗分别提高了37.3％、23.9％、41.8％、37.3％和2.9％，t2、t3、t4和t5处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的主根粗分别提高了44.8％、46.3％和49.3％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0128]2.2叶片酶活[0129]2.2.1超氧化物歧化酶[0130]盆栽60d超氧化物歧化酶(sod)情况如图10所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的sod优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的sod分别提高了7.8％、0.3％、8.9％、-2.6％、8.1％和0.2％，t1、t3和t5处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的sod分别提高了2.0％、3.5％和13.5％，复合菌剂t9处理组达到显著性差异(p《0.05)。[0131]2.2.2过氧化物酶[0132]盆栽60d过氧化物酶(pod)情况如图11所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的pod优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的pod分别提高了333.3％、706.7％、146.7％、486.7％、33.3％和620.0％，t1和t3处理组达到显著性差异(p《0.05)，t2、t4和t6处理组达到极显著性差异(p《0.01)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的pod有所提高，分别为573.3％、360.0％和173.3％，复合菌剂t8、t9处理组达到显著性差异(p《0.05)，复合菌剂t7处理组达到极显著性差异(p《0.01)。[0133]2.2.3过氧化氢酶[0134]盆栽60d过氧化氢酶(cat)情况如图12所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的cat优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的cat分别提高了44.4％、588.9％、22.2％、77.8％、11.1％和11.2％，t2处理组达到极显著性差异(p《0.01)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的cat分别提高了33.3％、33.4％和133.4％。[0135]2.3叶片生理特性[0136]2.3.1可溶性蛋白含量[0137]盆栽60d可溶性蛋白含量情况如图13所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的可溶性蛋白含量优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的可溶性蛋白含量分别提高了73.5％、78.0％、32.0％、44.5％、61.0％和83.5％，t1、t2、t4、t5和t6处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的可溶性蛋白含量分别提高了88.5％、90.5％和94.5％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0138]2.3.2游离脯氨酸[0139]盆栽60d游离脯氨酸含量情况如图14所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的游离脯氨酸含量优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的游离脯氨酸含量分别提高了21.2％、18.9％、19.7％、16.7％、62.1％和34.8％，t5处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的游离脯氨酸量分别提高了47.7％、50.8％和69.7％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0140]2.4叶片光合参数[0141]2.4.1净光合速率[0142]盆栽60d净光合速率情况如图15所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的净光合速率优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的净光合速率分别提高了5.6％、6.0％、5.2％、2.2％、18.7％和6.3％，t5处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的净光合速率分别提高了22.8％、13.5％和26.2％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0143]2.4.2蒸腾速率[0144]盆栽60d蒸腾速率情况如图16所示，与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组分别提高了-5.4％、27.9％、40.8％、4.3％、-19.3％和-23.6％；复合菌剂t7、t8和t9处理组分别提高了5.4％、10.8％和-25.8％。[0145]2.4.3气孔导度[0146]盆栽60d气孔导度情况如图17所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的气孔导度高于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的气孔导度分别提高了36.0％、65.8％、51.8％、15.8％、64.9％和8.3％，均达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的气孔导度分别提高了47.8％、63.1％和82.9％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0147]2.4.4胞间co2浓度[0148]盆栽60d胞间co2浓度情况如图18所示，与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组分别降低了17.6％、9.6％、4.5％、18.0％、30.2％和25.8％；复合菌剂t7、t8和t9处理组分别降低了20.6％、25.5％和33.0％。[0149]2.5叶片叶绿素相对含量及荧光参数[0150]2.5.1叶绿素相对含量[0151]盆栽30d叶绿素相对含量情况如图19所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的叶绿素相对含量显著提高。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的叶绿素相对含量明显提升，均达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了14.6％、13.5％、18.3％、21.2％、21.9％和27.1％；复合菌剂t7处理组的叶绿素相对含量达到极显著性差异(p《0.01)，提高了32.3％，复合菌剂t8和t9处理组的叶绿素相对含量均达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了25.0％和24.7％。复合菌剂t7较组合内单一菌剂t2、t3和t5处理植株叶绿素相对含量增长情况达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了16.6％、11.8％和8.5％；复合菌剂t8较组合内单一菌剂t1和t2处理幼苗叶绿素相对含量增长情况达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了9.1％和10.1％；复合菌剂t9较组合内单一菌剂t4、t5和t6处理幼苗叶绿素相对含量增长情况未达到显著性差异。[0152]盆栽60d叶绿素相对含量情况如图19所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的叶绿素相对含量显著提高。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的叶绿素相对含量明显提升，均达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了7.2％、8.7％、10.2％、8.6％、8.6％和10.1％。复合菌剂t7、t8和t9处理组的叶绿素相对含量均达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了14.2％、10.9％和15.5％。复合菌剂t7较组合内单一菌剂t2、t3和t5处理幼苗叶绿素相对含量增长情况达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了5.1％、3.6％和5.2％；复合菌剂t9较组合内单一菌剂t4、t5和t6处理幼苗叶绿素相对含量增长情况达到显著性差异(p《0.05)，分别提高了6.3％、6.3％和4.8％。[0153]2.5.2叶绿素动力学曲线(ojip)及叶绿素荧光参数[0154]盆栽60d叶绿素动力学曲线(ojip)如图20所示，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5、t6处理组和复合菌剂t7、t8、t9处理组测定绘制的叶绿素动力学曲线显著高于对照组，均达到显著性差异(p《0.05)。与核桃幼苗叶片叶绿素相对含量相关性较强的叶绿素荧光参数(fo、fm、fv/fo、sm、vi、rc/csm、eto/csm、fv/fm、dio/rc)如图21所示，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5、t6处理组和复合菌剂t7、t8、t9处理组测定绘制的叶绿素荧光参数雷达图较对照组有明显提高，均达到显著性差异(p《0.05)，复合菌剂t9处理组较对照组，分别提高了16.98％、12.39％、0.04％、9.8％、2.9％、8.5％、28.2％、1.1％和11.4％。[0155]2.6土壤酶活[0156]2.6.1蔗糖酶[0157]盆栽60d蔗糖酶活性情况如图22所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的蔗糖酶活性优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的蔗糖酶活性分别提高了9.3％、11.6％、18.6％、11.6％、48.8％和16.3％，t3、t5和t6处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的蔗糖酶活性分别提高了39.5％、37.2％和62.8％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0158]2.6.2脲酶[0159]盆栽60d脲酶活性情况如23所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的脲酶活性优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的脲酶活性分别提高了25.0％、23.4％、23.3％、53.1％、109.4％和35.9％，均达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的脲酶活性分别提高了93.8％、101.6％和117.2％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0160]2.6.3酸性磷酸酶[0161]盆栽60d酸性磷酸酶活性情况如图24所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的酸性磷酸酶活性优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的酸性磷酸酶活性分别提高了19.1％、31.2％、11.8％、23.9％、43.4％和22.1％，均达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的酸性磷酸酶活性分别提高了38.1％、42.5％和47.1％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0162]2.6.4脱氢酶[0163]盆栽60d脱氢酶活性情况如图25所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的脱氢酶活性优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的脱氢酶活性分别提高了6.1％、3.7％、12.8％、16.5％、50.0％和17.1％，t3、t4、t5和t6处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的过氧化氢酶活性分别提高了35.4％、43.3％和56.1％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0164]2.6.5过氧化氢酶[0165]盆栽60d过氧化氢酶活性情况如图26所示，单一菌剂和复合菌剂处理组幼苗的过氧化氢酶活性优于对照组。与对照组相比，单一菌剂t1、t2、t3、t4、t5和t6处理组的过氧化氢酶活性分别提高了8.7％、63.0％、47.8％、77.2％、105.4％和80.4％，t2、t3、t4、t5和t6处理组达到显著性差异(p《0.05)；复合菌剂t7、t8和t9处理组的过氧化氢酶活性分别提高了55.4％、47.8％和86.9％，均达到显著性差异(p《0.05)。[0166]实验例3[0167]将单一菌剂和复合菌剂处理下的20个促生指标进行主成分分析，由表4可知，前4个主成分特征值都大于1，且累计方差贡献率达90.255％，包含了绝大部分原始数据信息，说明提取的4个主成分能够代替原始的20个指标。[0168]表4核桃幼苗主成分在各促生指标上旋转后的成分矩阵及特征值和累计方差贡献率[0169]table4rotatedcomponentmatrixandeigenvaluesandcumulativevariancecontributionsoftheprincipalcomponentsofwalnutseedlingsoneachprogenitor[0170][0171][0172]结合核桃幼苗各指标与不同处理间的联系，通过主成分分析计算单一菌剂和复合菌剂的综合得分，由表5可知，不同单一菌剂和复合菌剂对核桃的促生增效顺序为t9》t5》t7》t8》t6》t2》t4》t3》t1》control。说明施加单一菌剂和促生菌剂均可促进核桃幼苗生长，且复合菌剂t9处理组促生效果最佳。[0173]表5不同处理下核桃幼苗生长指标综合评价结果[0174]table5comprehensiveevaluationresultsofgrowthindexesofwalnutseedlingsunderdifferenttreatments[0175][0176][0177]1)微生物菌剂组合方法[0178]本发明简化成本和过程，提出协同组合技术，具有容易操作、普适性和容易推广使用等优点。首先通过拮抗试验，筛选出了13组不存在拮抗作用或拮抗作用较弱的组合。通常来说，不拮抗即可组合是目前采用的比较多的一种方法，但该方法存在很多弊端，例如菌株功能减弱或难以发挥等。本发明选择iaa产生能力作为指标，分别检测单一菌株的产iaa能力和不同菌株组合后的产iaa能力。结果发现三个组合(5-49+5-54+6-30)、(1-31+3-3+5-54)、和(1-31+2-40+5-49)的iaa产量显著高于其它组合且高于组合内的任一单菌。虽然这3种组合iaa产量增加，但并不意味着应用于田间试验一定增效，复合菌剂的促生效果更不仅是简单的加成效应。因此，本发明还研究了其在田间盆栽条件下对核桃苗的促生作用，结果表明：协同组合筛选得到的复合菌剂(5-49+5-54+6-30)较对照组及组合内单一菌剂具有更优异的促生效果，更加符合客观实际情况，在微生物肥料生产上具有明显的可操作性。[0179]2)复合菌剂促进作物生长[0180]促生菌复配时应该考虑作物的生存环境，有助于实现促生菌增效的目的，因此，本发明采用实验室前期从核桃根际土壤中筛选的菌株来进行研究，以匹配复合菌剂使用的环境。选择复合菌剂(5-49+5-54+6-30)、(1-31+3-3+5-54)、和(1-31+2-40+5-49)进行盆栽试验研究其对核桃幼苗的促生作用。现本发明中，3种复合菌剂均明显改善了核桃的农艺性状，提高了核桃苗叶绿素含量，促进了光合作用，这可能是复合菌剂通过调节土壤的物理化学性质和生物学环境，使其利于植物对养分和水分的吸收，直接或间接的促进植物生长，从而达到健株的目的。同时，复合菌剂提高了核桃幼苗叶片中保护性酶sod、pod和cat的活性，可以增强核桃幼苗的抗逆性，诱发对叶片病害的系统抗性，在一定程度上控制叶部病害的发生。本发明发现，3种复合菌剂处理下的核桃苗体内的游离脯氨酸和可溶性蛋白含量均较对照组有提高，表明复合菌剂可以促进植株产生有效的抗氧化酶类，促进脯氨酸等调节物质的积累，减少干旱胁迫对幼苗的危害，提高了核桃苗的抗旱能力，促进生长。同时，与对照组相比，复合菌剂处理组的土壤脲酶、磷酸酶、脱氢酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性有所升高。综合来看，通过协同组合法筛选出产iaa能力较高的复合菌株(5-49+5-54+6-30)其各指标的促生作用普遍优于其他复合菌株和组合内单一菌株，进一步体现了协同组合法的可行性。[0181]最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12