1.本发明属于活性肽应用技术领域，具体涉及一种具有肠道屏障保护功能的玉米谷氨酰胺肽的制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，由肠道引发的各种慢性疾病呈现多发、高发趋势，而引起肠道疾病的因素是多方面的，但究其根本是因为肠道屏障功能出现了问题。肠道屏障功能出现异常会导致营养物质的消化吸收功能紊乱、生长缓慢、抗病能力下降、对病原微生物的易感性增强，进而引起如结肠炎、易激性肠炎、腹泻和便秘等各种疾病的发生。
3.临床上经常采用谷氨酰胺(gln)作为肠内营养物质来保护肠道屏障，但由于gln单体溶解度低且易分解，严重限制了其应用。近年来，研究发现谷氨酰胺结合肽不仅保留了gln多种生理功能和营养，还具有水溶性好、致敏性低、吸收性好、稳定性强等优点，可以作为gln稳定化的替代品。
4.关于谷氨酰胺肽的制备主要有两种途径：一是通过化学法合成，目前已经上市的主要是二肽，有丙氨酰谷氨酰胺(ala-gln)和甘氨酰谷氨酰胺(gly-gln)两种，这两种肽主要以注射类液体药剂的形式存在；二是通过蛋白酶控制酶解植物蛋白如小麦面筋蛋白获得富含谷氨酰胺的肽段。但是化学合成法存在价格高和有机试剂难以完全去除等潜在安全隐患；蛋白酶酶解谷朊粉制备谷氨酰胺肽反应条件虽然温和，无有毒有害成分生成，但酶解产物中谷氨酰胺含量相对低。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种具有肠道屏障保护功能的玉米谷氨酰胺肽的制备方法。利用本发明的制备方法制备得到的玉米谷氨酰胺肽中谷氨酰胺含量高，能够高效释放玉米蛋白中的谷氨酰胺，谷氨酰胺释放量占原玉米蛋白中谷氨酰胺的75.00％～97.50％，且具有肠道屏障保护功能。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种具有肠道屏障保护功能的玉米谷氨酰胺肽的制备方法，包括如下制备步骤：
8.利用碱性蛋白酶对玉米蛋白进行第一酶解，得第一酶解液；
9.利用复合蛋白酶对所述第一酶解液进行第二酶解，得第二酶解液后干燥，得玉米谷氨酰胺肽。
10.优选的，进行所述第一酶解时，碱性蛋白酶的用量为1000～1500u/g玉米蛋白。
11.优选的，所述第一酶解的温度为60℃～70℃，第一酶解的时间为2h～3h，第一酶解的ph值为7.5～8.5。
12.优选的，进行所述第二酶解时，复合蛋白酶的用量为100～300u/g玉米蛋白。
13.优选的，所述第二酶解的温度为45℃～55℃，第二酶解的时间为2h～3h，第二酶解的ph值为6.5～7.5。
14.优选的，所述玉米蛋白包括去淀粉处理后的玉米蛋白粉；所述去淀粉处理包括：将待处理玉米蛋白粉与α-淀粉酶混合后进行去淀粉酶解，得玉米蛋白；所述α-淀粉酶的质量为待处理玉米蛋白粉质量的0.8％～1.2％。
15.优选的，所述去淀粉酶解的温度为60℃～70℃，去淀粉酶解的时间为1.5h～2.5h。
16.优选的，干燥前，还包括对所述第二酶解液进行纳滤处理；所述纳滤的压力为15～25bar，温度为15～25℃。
17.本发明还提供了上述制备方法得到的具有肠道屏障保护功能的玉米谷氨酰胺肽，其特征在于，所述玉米谷氨酰胺肽中谷氨酰胺含量为总蛋白的10％～13％，能够高效释放玉米蛋白中的谷氨酰胺，谷氨酰胺释放量占原玉米蛋白中谷氨酰胺的75.00％～97.50％(本发明具体实施过程中得到的谷氨酰胺肽中所含蛋白的质量百分含量为83％)。
18.本发明还提供了上述玉米谷氨酰胺肽在制备具有肠道屏障保护功能的食品、药品或保健品中的应用。
19.本发明提供了一种具有肠道屏障保护功能的玉米谷氨酰胺肽的制备方法。本发明采用碱性蛋白酶和复合蛋白酶对玉米蛋白进行顺次酶解，获得了玉米谷氨酰胺肽，实现了对玉米蛋白的有效利用。利用本发明提供的制备方法制备得到的玉米谷氨酰胺肽能够高效释放玉米蛋白中的谷氨酰胺，其中谷氨酰胺含量为玉米谷氨酰胺肽中总蛋白质量的10％～13％，占原玉米蛋白中谷氨酰胺的75.00％～97.50％。可以显著降低结肠组织中的促炎因子il-1β、il-6和tnf-α的含量，增加抗炎因子il-10的含量，改善由溃疡性结肠炎引起的小鼠体重下降，有效缓解结肠缩短，降低疾病活动指数，减轻结肠组织中炎症细胞的浸润，降低结肠粘膜通透性，缓解小鼠结肠炎。
附图说明
20.图1是玉米谷氨酰胺肽对dss诱导结肠炎小鼠体重变化的影响；
21.图2是玉米谷氨酰胺肽对dss诱导结肠炎小鼠疾病活动指数的影响；
22.图3是玉米谷氨酰胺肽对dss诱导结肠炎小鼠结肠长度的影响；
23.图4是玉米谷氨酰胺肽对dss诱导结肠炎小鼠抗炎因子il-10的影响；
24.图5是玉米谷氨酰胺肽对dss诱导结肠炎小鼠促炎因子tnf-α的影响；
25.图6是玉米谷氨酰胺肽对dss诱导结肠炎小鼠促炎因子il-6的影响；
26.图7是玉米谷氨酰胺肽对dss诱导结肠炎小鼠促炎因子il-1β的影响。
具体实施方式
27.本发明提供了一种具有肠道屏障保护功能的玉米谷氨酰胺肽的制备方法，包括如下制备方法：
28.利用碱性蛋白酶对玉米蛋白进行第一酶解，得第一酶解液；
29.利用复合蛋白酶对所述第一酶解液进行第二酶解，得第二酶解液后干燥，得玉米谷氨酰胺肽。
30.本发明利用碱性蛋白酶对玉米蛋白进行第一酶解，得第一酶解液。本发明进行所
述第一酶解时，所述碱性蛋白酶的用量优选为1000～1500u/g玉米蛋白，进一步优选为1200～1450u/g玉米蛋白，更优选为1200～1300u/g玉米蛋白。本发明所述第一酶解的温度优选为60℃～70℃，进一步优选为60～65℃；所述第一酶解的时间优选为2h～3h，进一步优选为2.2～2.8h；所述第一酶解的ph优选为7.5～8.5，进一步优选为7.6～8.2。本发明优选酶解过程中，实时监控ph和温度，保证第二酶解过程中温度和ph不变。本发明对调节ph值使用的试剂没有严格要求，可使用1mol/l的naoh和/或1mol/l的hcl。本发明对所述碱性蛋白酶的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可，在本发明具体实施过程中，所述碱性蛋白酶为诺维信碱性蛋白酶alcalase 2.4l，购买自丹麦诺维信公司。
31.在本发明中，所述玉米蛋白可通过购买获得，也可自行制备。当本发明自行制备玉米蛋白时，优选以玉米蛋白粉为原料。本发明所述玉米蛋白粉是玉米籽粒经湿法生产玉米淀粉后的主要副产物，其蛋白质含量约为60％，其中谷氨酰胺含量约占玉米总蛋白的8.3％。本发明对所述玉米蛋白粉的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可，在本发明具体实施例中，所述玉米蛋白粉购自齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司。
32.本发明优选对玉米蛋白粉进行挤压处理，得挤压玉米蛋白粉。本发明所述挤压的温度优选为160～180℃，进一步优选为165～175℃，更优选为170℃。本发明对所述挤压的时间没有严格要求，保证挤压处理后的玉米蛋白粉的含水量在10～20wt％即可。本发明对挤压的方式没有严格要求，优选使用双螺杆挤压机。
33.本发明优选对挤压玉米蛋白粉进行去淀粉处理，灭酶处理后，分离得玉米蛋白。本发明所述去淀粉处理包括：将所述挤压玉米蛋白与α-淀粉酶混合后进行酶解。本发明所述α-淀粉酶的质量优选为挤压玉米蛋白粉质量的0.8％～1.2％，进一步优选为0.9％～1.0％。本发明所述酶解的温度优选为60℃～70℃，进一步优选为60～65℃；所述酶解的时间优选为1.5h～2.5h，进一步优选为1.8～2.0h。本发明所述灭酶处理的温度优选为90～110℃，进一步优选为95～100℃；所述灭酶处理的时间优选为15～25min，进一步优选为18～20min。本发明所述分离的方式优选为离心，所述离心的转速优选为7500r/min～8500r/min，进一步优选为7800r/min～8200r/min；所述离心的时间优选为5min～15min，进一步优选为8～10min。本发明优选对离心处理所得沉淀进行干燥处理，即得所述玉米蛋白。本发明所述干燥的温度优选为60～70℃，进一步优选为62～65℃。本发明对所述干燥的方式没有严格要求，优选使用烘箱。
34.本发明利用α-淀粉酶酶解挤压玉米蛋白粉能够去除玉米蛋白粉中的淀粉，得到的玉米蛋白纯度高，空间结构暴露更充分，易于酶解。
35.得第一酶解液后，本发明利用复合蛋白酶对所述第一酶解产物进行第二酶解，得第二酶解液。本发明进行所述第二酶解时，所述复合蛋白酶的用量优选为100～300u/g玉米蛋白，进一步优选为150～250u/g玉米蛋白，更优选为200～220u/g玉米蛋白。本发明所述第二酶解的温度优选为45℃～55℃，进一步优选为48～52℃；所述第二酶解的时间优选为2h～3h，进一步优选为2.2～2.8h；所述第二酶解的ph优选为6.5～7.5，进一步优选为6.8～7.2。本发明对调节ph值使用的试剂没有严格要求，可使用1mol/l的naoh和/或1mol/l的hcl。本发明对所述复合蛋白酶的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可，在本发明具体实施过程中，所述复合蛋白酶为诺维信复合蛋白酶protamex，购买自丹麦诺维信公司。
36.本发明优选利用复合蛋白酶对所述第一酶解液进行第二酶解前，对第一酶解液进
行预处理，将第一酶解液的温度和ph调节至第二酶解所需温度和ph。本发明优选酶解过程中，实时监控ph和温度，保证第二酶解过程中温度和ph不变。
37.得第二酶解液后，本发明优选对第二酶解液进行灭酶处理，离心得上清液。本发明所述灭酶处理的温度优选为90～110℃，进一步优选为95～100℃；所述灭酶处理的时间优选为15～25min，进一步优选为18～20min。本发明所述分离的方式优选为离心，所述离心的转速优选为3000r/min～5000r/min，进一步优选为3200r/min～4800r/min，更优选为3500～4000r/min；所述离心的时间优选为15min～25min，进一步优选为18～20min。
38.本发明优选对上清液进行纳滤处理和干燥处理，得玉米谷氨酰胺肽。本发明所述纳滤的压力优选为15～25bar，进一步优选为18～20bar；所述纳滤的温度优选为15～25℃，进一步优选为18～20℃。本发明对纳滤的时间没有严格要求，保证纳滤后所得溶液的体积为上清液体积的1/3～2/3即可。
39.本发明采用碱性蛋白酶和复合蛋白酶对玉米蛋白进行顺次酶解，获得了玉米谷氨酰胺肽，实现了对玉米蛋白的有效利用，得到的玉米谷氨酰胺肽中谷氨酰胺含量为总蛋白质量的6％～7.8％，谷氨酰胺释放量占原玉米蛋白中谷氨酰胺的75.00％～97.50％，实现了原料中谷氨酰胺的高效释放。
40.本发明还提供了所述玉米谷氨酰胺肽在制备具有肠道屏障保护功能的食品、药品或保健品中的应用。本发明制备得到的玉米谷氨酰胺肽能够高效释放玉米蛋白中的谷氨酰胺，谷氨酰胺释放量占原玉米蛋白中谷氨酰胺的75.00％～97.50％，可以显著降低结肠组织中的促炎因子il-1β、il-6和tnf-α的含量，增加抗炎因子il-10的含量，改善结肠炎小鼠体重下降，缓解结肠缩短，降低疾病活动指数，减轻结肠组织中炎症细胞的浸润，降低结肠粘膜通透性，缓解小鼠结肠炎，具有缓解急慢性肠炎、保护肠道屏障功能的作用。
41.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.实施例1
43.玉米谷氨酰胺肽的制备，由如下步骤组成：
44.(1)原料预处理：调节200g玉米蛋白粉(其蛋白质含量约为60％，其中谷氨酰胺含量约占玉米总蛋白的8.3％)含水量至15％，利用双螺杆挤压机，在170℃条件下进行挤压膨化；膨化后在室温下干燥，粉碎、过60目筛，得到200g挤压玉米蛋白粉。
45.(2)对挤压玉米蛋白粉进行去淀粉预处理：用ph 6.0的0.02mol/l磷酸盐缓冲将步骤(1)挤压玉米蛋白粉配制成浓度为10％(m/v)的悬浮液，加入挤压玉米蛋白粉质量1％的α-淀粉酶，65℃水解2h去除淀粉。反应结束后酶解液在100℃下灭酶20min，8000r/min离心10min，取沉淀在60～70℃的烘箱中烘干，粉碎过60目筛，得到150g预处理玉米蛋白粉(即玉米蛋白)。
46.(3)蛋白酶水解：将步骤(2)预处理玉米蛋白粉配置成底物浓度10％(m/v)的悬液，加入195000u(即1300u/g蛋白)碱性蛋白酶，调节溶液ph值8.0，在60℃下水解2.5h，得第一酶解液；
47.(4)调节第一酶解液ph值7.0，加入30000u(即200u/g蛋白)复合蛋白酶，在50℃下
水解2.5h，得第二酶解液；
48.(5)将第二酶解液放入100℃沸水浴中灭酶20min，4000r/min离心15min后取上清液；
49.(6)将上清液用截留分子质量为300da的纳滤膜进行脱盐处理，纳滤的参数为：溶液体积3l、操作压力20bar、温度20℃，纳滤结束后将体积浓缩至1/2，冷冻干燥得90g玉米谷氨酰胺肽。
50.实施例2
51.同实施例1，区别在于步骤(3)碱性蛋白酶酶解2h。
52.实施例3
53.同实施例1，区别在于步骤(3)碱性蛋白酶酶解3h。
54.实施例4
55.同实施例1，区别在于步骤(4)复合蛋白酶酶解2h。
56.实施例5
57.同实施例1，区别在于步骤(4)复合蛋白酶酶解3h。
58.对比例1
59.同实施例1，区别在于不利用复合蛋白酶酶解。
60.对比例2
61.同实施例1，区别在于不利用碱性蛋白酶酶解。
62.对比例3
63.同实施例1，区别在于先进行复合蛋白酶解，后利用碱性蛋白酶酶解。
64.测试例1
65.分别测定实施例1、对比例1～3得到的玉米谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量。具体的：分别将实施例1、对比例1～3得到的玉米谷氨酰胺肽平均分为两份等质量的待测样品，其中一份经双－(三氟乙酰氧基)－碘苯(bti)保护两小时后进行酸水解，另一份直接进行酸水解，水解后测定谷氨酸的含量，两份等质量样品的差值即对应处理方式下谷氨酰胺的含量。
66.检测结果表明，实施例1得到的玉米谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量为总蛋白质量的12％，对比例1得到的玉米谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量为总蛋白质量的8.79％，对比例2得到的玉米谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量为总蛋白质量的8.29％，对比例3得到的玉米谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量为总蛋白质量的9.99％。对比例1～3得到的玉米谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量均低于本发明，说明本发明碱性蛋白酶和复合蛋白酶顺次水解玉米蛋白的方案得到的谷氨酰胺的含量高。
67.测试例2
68.玉米谷氨酰胺肽对dss诱导肠道屏障损伤小鼠症状的缓解作用。
69.1.取6-8周龄的健康雄性昆明小鼠(购买于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司)60只，随机分为6组，每组10只，分别为：对照组、模型组、玉米谷氨酰胺肽(aph)低(100mg/kg
·
d)、中(300mg/kg
·
d)、高(500mg/kg
·
d)剂量组和谷氨酰胺(gln)组。
70.2.模型建立：小鼠灌胃14天，其中玉米谷氨酰胺肽低、中、高剂量组灌实施例1玉米谷氨酰胺肽玉米肽，对照组和模型组灌胃等量的生理盐水，谷氨酰胺组灌胃谷氨酰胺(购买
自生工生物工程(上海)股份有限公司)，6组均正常摄食摄水。第8天时开始实验，具体的：模型组和玉米谷氨酰胺肽组自由饮用3％的葡聚糖硫酸钠(dss)水溶液(购买自生工生物工程(上海)股份有限公司)，对照组正常摄食摄水。具体分组和给药方式如表1所示。
71.表1动物实验分组及给药方式
[0072][0073]
3.造模期间，监测各组小鼠体重变化情况及各组小鼠疾病活动指数(dai)变化情况，dai评分细则如下表2。
[0074]
表2dai评分细则
[0075][0076]
各组小鼠体重变化结果如表3和图1所示，各组小鼠疾病活动指数(dai)变化情况表4和图2所示，其中图2纵坐标显示的评分为体重下降、粪便粘稠度和粪便潜血的评分和，例如，图2中的7分可以表示，体重下降10％得2分，粪便粘稠度为黏液样便得3分，粪便潜血为肛周有血得2分，累计为7分。
[0077]
表3造模期间各组小鼠体重变化率
[0078]
[0079][0080]
表4造模期间各组小鼠疾病活动指数(dai)
[0081][0082][0083]
由表3～4和图1～2可以看出，与模型组相比，不同剂量的玉米谷氨酰胺肽可以显著的改善小鼠体重减轻，降低疾病活动指数。
[0084]
按照表1方式灌胃各组小鼠14天，在末次采食12h后，处死小鼠，量取各组小鼠结肠
长度，取结肠组织检测tnf-α、il-1β、il-6和il-10等细胞炎症因子，检测结果如表5和图3～7所述。
[0085]
表5灌胃14天后小鼠结肠长度和炎症因子的含量
[0086][0087]
由表5和图3～7可以看出，与模型组相比，不同剂量的玉米谷氨酰胺肽可以缓解结肠缩短。dss处理后增加了结肠组织中促炎细胞因子il-1β、il-6和tnf-α的含量，使之分别达到了1.30ng/g结肠组织、1.13ng/g结肠组织和6.32ng/g结肠组织，降低了抗炎细胞因子il-10的含量，达到2.25ng/g结肠组织。相比于模型组，经不同剂量的玉米谷氨酰胺肽处理后，可显著降低结肠中的促炎因子il-1β、il-6和tnf-α的含量，增加抗炎细胞因子il-10的含量。特别是玉米谷氨酰胺肽高剂量组，其使促炎细胞因子il-1β、il-6和tnf-α分别下降了19.23％、27.88％和33.76％，使抗炎细胞因子il-10增加了66.81％，与正常组水平相当，优于gln组，表明一定剂量的玉米谷氨酰胺肽能够有效缓解dss诱导的肠道屏障损伤，对肠道屏障具有一定的保护作用，使其恢复至正常水平，且效果优于单品gln。
[0088]
由以上实施例可知，本发明制备方法得到的玉米谷氨酰胺肽可以高效释放玉米蛋白中的谷氨酰胺，有效改善小鼠体重减轻，降低疾病活动指数、缓解结肠缩短，降低结肠中的促炎因子il-1β、il-6和tnf-α的含量，增加抗炎细胞因子il-10的含量，有效缓解dss诱导的肠道屏障损伤，且对肠道屏障具有一定的保护作用。
[0089]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。