微小杆菌zb21及其在三甲胺废气降解中的应用
技术领域
1.本技术属于环境污染治理领域，涉及一株微小杆菌属(exiguobacterium sp.)真菌zb21及其在三甲胺废气生物降解中的应用。


背景技术：

2.大气污染是当前人们比较关心的话题，也是环境污染的主要问题之一。伴随着社会经济的发展，工业发展也越来越快。随之而来的则是，由于工业尾气排放造成大气污染的情况也越来越严重，在实际工业生产过程，会产生大量的三甲胺等恶臭废气。三甲胺是有机胺类废气污染物的主要代表之一，因其排放量大、嗅域值低，对大气环境造成了非常严重的恶臭污染。三甲胺类恶臭废气的排放已使得居民的身体健康和生态环境造成了极其严重的危害。因此，三甲胺废气的治理已经成为一个非常紧迫的大气污染控制问题。
3.传统的处理三甲胺等恶臭废气的方法是物理和化学方法，但是这些方法具有运行费用高、且容易产生二次污染等缺点。与传统的物理化学法相比，生物法具有耗能少、费用低，以及不易产生二次污染等优点，目前已逐渐成为国内外处理恶臭废气的主要方法。目前，生物法处理氨气和硫化氢等无机恶臭的研究报道较多，而生物法处理三甲胺等有机恶臭的研究报道非常少。
4.采用生物滴滤塔是一种目前比较热门的处理工业恶臭废气的生物学方法。生物滴滤塔反应器内安装固体填料床，培养微生物，并使微生物在固体填料表面附着生长形成牢固的生物膜，废气流经生物反应器，有害物质吸附到生物膜上进而被微生物所降解。为减少生物滴滤塔调试时间，在该类恶臭废气去除反应器的启动阶段，需要往底泥中接种特别的微生物。从生物滴滤塔底泥中筛选具有吸收降解三甲胺的高效真菌，经过人工方式培养后，再将其加入生物滴滤塔反应器中，进而达到改良生物滴滤反应器的效果。此外，筛选得到的高效细菌，为研究含三甲胺废气的生物降解机制奠定了重要基础。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种微小杆菌属(exiguobacterium sp.)真菌zb21。
6.本发明的通过下述技术方案实现：
7.本发明提供的微小杆菌属(exiguobacterium sp.)真菌zb21保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：cctcc no:m 2021370，保藏日期：2021年4月21日。
8.该菌株的生物学特征如下：该菌为革兰氏阳性杆状菌，菌落呈圆形、直径为1.8-3.6mm，黄白色、表面光滑。
9.真菌zb21菌株是从工业企业的生物滴滤塔反应器活性污泥中筛选获得。
10.本发明的第二个目的是提供上述真菌zb21在含三甲胺废气降解中的应用。
11.作为优选，微小杆菌属真菌zb21在生物滴滤塔反应器降解净化三甲胺废气中的应
用。
12.作为优选，所述生物滴滤塔反应器中的填料采用基质和真菌zb21，其中每克基质中含有不低于4.0
×
107cfu的真菌zb21，基质为活性炭、陶粒和木屑按照1：1：2的质量比的混合物。
13.作为优选，所述生物滴滴滤塔反应器的工作设置参数如下：塔高8000mm，塔直径1500mm，填料高度1200mm，废气流量3000m3/h；喷淋密度为12m3/(m2·
h)，停留时间为10s。
14.本发明的第三个目的是提供一种发酵制品，为微小杆菌属真菌zb21的发酵液或液体菌剂。
15.作为优选，所述微小杆菌属真菌zb21的发酵液的制备方法具体如下：
16.将经过pda固体培养基培养纯化后的微小杆菌属真菌zb21接种于发酵培养基，按照种子液和发酵培养基的体积比为1:9进行放大培养；其中发酵培养的温度为32-37℃，溶解氧大于1.8mg/l，压强为0.08mpa，培养时间60h。
17.上述发酵培养基为酵母粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl 8.0g/l，琼脂15.0g/l。
18.作为优选，所述微小杆菌属真菌zb21的液体菌剂的制备方法具体如下：
19.将上述发酵液放于4℃超低温离心机，4000rpm，离心15min，弃去上清液后收集沉淀菌体，以新鲜无菌培养液重悬菌体，得到真菌终浓度为0.5-0.8g/l的液体菌剂。发酵培养的温度为32-37℃，溶解氧大于1.8mg/l，压强为0.08mpa，培养时间60h。
20.上述发酵培养基为酵母粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl 8.0g/l，琼脂15.0g/l。
21.保藏说明：
22.本发明微小杆菌属(exiguobacterium sp.)真菌菌株zb21保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：cctcc no:m 2021370，保藏日期：2021年4月21日。
23.本发明具有的有益效果是：
24.(1)利用筛选得到的微小杆菌属真菌菌株zb21能显著降低恶臭废气中的三甲胺浓度，并且处理效果优异；
25.(2)添加微小杆菌属真菌菌株zb21后的活性填料，其驯化时间明显缩短，可快速启动生物滴滤塔反应器；
26.(3)本发明提供的微小杆菌属真菌菌株zb21在三甲胺废气降解中的应用方法，操作简单；
27.(4)利用筛选得到的微小杆菌属真菌zb21菌种可长期保存，-80℃超低温冰箱中保存一年后，经活化可继续使用，对含三甲胺废气的清除效率没有显著下降，具有较好的可保存性。
附图说明
28.图1为生物反应器结构示意图；
29.图2为菌株的菌落形态图；
30.图3为系统发育树图。
具体实施方式
31.为了使本发明的目的、技术和特点更加清楚，以下通过具体实施例进一步来为本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利，并不用于限定本发明。
32.实施例1：微小杆菌属真菌zb21的分离培养
33.微小杆菌属真菌zb21分离所用涉及到的生物滴滤反应器如图1所示。
34.其分离方法如下：取驯化后的生物反应器污泥15g，用双蒸水稀释至5倍、50倍和500倍三个不同的浓度梯度，分别涂布于pda真菌固体培养基上。每个培养皿涂布2ml稀释后的污泥溶液，在32℃下恒温箱培养3天，从菌落边缘挑取菌丝体，转移到新鲜的pda平板划线分离培养，重复至获得纯培养物，转入pda斜面保存。
35.实施例2：微小杆菌属真菌zb21的形态学及分子生物学鉴定
36.根据《真菌鉴定手册》手册，在显微镜下，观察微小杆菌属真菌zb21的形态特征，具体方式是采用点种法将筛选到的菌株接种于pda平板上，放于32℃恒温培养，肉眼观察菌株的形态特征，包括菌落形态、颜色、大小、边缘特征、菌丝性状、生长速度等特征。
37.本发明的微小杆菌属真菌zb21的形态特征如下：
38.如图2所示，微小杆菌属真菌zb21菌株在pda培养基上，该菌为革兰氏阳性杆状菌，菌落呈圆形、直径为1.8-3.6mm，黄白色、表面光滑。
39.实施例3：微小杆菌属真菌zb21的分子生物学鉴定
40.1、基因组dna提取
41.基因组dna提取方法如下：(1)选取菌液2ml，在4℃、12000rpm条件下，离心3分钟，进而收集获得菌体；(2)加入600μl2
×
ctab(包含2％β-巯基乙醇)，液氮中速冻1分钟，再转至64℃水浴1分钟，重复上述过程3次，然后，高速震荡2min，64℃水浴30分钟；(3)加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24:1)，上下颠倒混匀，冰上静止3分钟，然后，4℃，12000rpm，离心15分钟，取上清至新的离心管；(4)在上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，在冰上静止放置30分钟，然后，4℃，12000rpm，离心5分钟；(5)弃上清，利用75％无水乙醇进行沉淀物洗涤，然后，在室温下风干得到真菌dna，然后用ddh2o溶解dna沉淀物，冰箱保存备用。
42.2、微小杆菌属真菌zb21 its-pcr扩增及分子鉴定
43.利用真菌通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag
–3’
，如seq id no.2)、1492r(5
’‑
tacggctaccttgttacgactt-3’，如seq id no.3)，经pcr技术，扩增出真菌基因组的rrna基因内部转录间隔区(its)。
44.pcr反应体系(20μl)：2
×
taq pcr mastermix 10μl，上游引物(10μmol/l)1μl，下游引物(10μmol/l)1μl，dna模板(50ng/l)1μl，利用ddh2o补齐至20μl体积。
45.在pcr仪上进行pcr扩增的扩增条件：94℃预变性5分钟；32个循环：94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸1分钟30s秒；72℃进一步延伸10分钟。最后，将pcr产物纯化后送样测序；将测序获得核苷酸序列，在ncbi中进行blast比对，比对结果显示其与微小杆菌属真菌(genbank登录号mh845736)的同源性最高，为99.86％，故鉴定该菌株为微小杆菌属真菌。所述微小杆菌属(exiguobacterium sp.)真菌zb21的16s rdna序列如下，seq id no.1。
46.实施例4：微小杆菌属真菌zb21的系统进化分析
47.将上述获得的微小杆菌属真菌zb21序列在ncbi中进行的blast检索，下载与之相近的已知菌种its序列，用于构建系统发育树。采用clustalx1.83进行多序列比对，比对结果利用mega7.0软件并采用neighbor joining统计学方法，bootstrap值设置为1000，使用tamura-nei model碱基替换模式，构建基于rdna its序列的系统发育树。具体的系统进化树如图3所示。
48.实施例5：微小杆菌属真菌zb21发酵及填料制备
49.在经过pda固体培养基培养纯化之后，将微小杆菌属真菌zb21接种于发酵培养基，按照种子液和发酵培养基的体积比为1:9进行放大培养。发酵培养基为酵母粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl 8.0g/l，琼脂15.0g/l。发酵培养的温度为32-37℃，溶解氧大于1.8mg/l，压强为0.08mpa，培养时间60h。将发酵液放于冷冻离心机，4℃，4000rpm，离心30分钟，去上清液后，收集沉淀菌体，以新鲜无菌培养液重悬菌体，得到终浓度为0.8-1.0g/l的真菌悬液。将zb21悬液吸附于填料上，完成富含zb21真菌的填料制备。
50.实施例6：微小杆菌属真菌zb21提升生物滴滤反应器对含三甲胺废气的吸收清除效率
51.设计两套平行生物滴滤塔反应器(对照组和处理组)，分别采用不含zb21真菌的原始填料基质和人工添加上述实施例所得真菌接种后的活性污泥混合于填料基质，检测一个工作日周期内，两组设备对含三甲胺废气吸收清除效率的差异。选取两套设备启动7天后，取样测定所需参数。生物滴滤塔反应器输入口的废气含三甲胺浓度分别为200mg/m3、400mg/m3、600mg/m3、800mg/m3和1000mg/m3，测定三甲胺降解率。测定结果如表1所示。从表1数据结果可以看出，处理组生物滴滤塔反应器对含三甲胺废气的清除效率为99.3％～99.9％之间，显著高于对照组。
[0052][0053]
实施例7：微小杆菌属真菌zb21缩短生物滴滤塔反应器启动时间
[0054]
设计对照组和处理组两套平行生物滴滤塔反应器，分别采用不含zb21真菌的原始填料基质和人工添加上述实施例所得真菌接种后的活性污泥混合于填料基质，检测从开始第一天到启动后第8天的含三甲胺废气清除效率。取样时间固定为每天上午8点，提取输入口和输出口的废气样本，测量三甲苯气含量，单位为mg/m3。所测得的数据见表格2。
[0055][0056]
表2的结果表明，处理组的生物滴滤塔反应器从4天开始已经达到95.4％的效率，
到第7天就可以达到99.9％的效率；而对照组的生物滴滤塔反应器从第6天开始才达到87.6％的效率，并且之后逐渐趋于稳定。表2数据统计结果表明，微小杆菌属真菌zb21真菌可以大幅度缩短生物滴滤塔反应器启动时间。
[0057]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。