1.本发明涉及一种光活化腺苷酸环化酶。


背景技术：

2.近年来，使用光遗传学通过光控制生物功能的方法在医学及生理学领域中被广泛利用。在该方法中，将通过光照射而在生物体内发挥生理功能的光学探针(例如，酶或离子信道)配置于生物体内的目标部位(例如，特定的组织中或细胞中)，对光学探针照射光而人为地控制生物功能。
3.作为光学探针，已知有光活化腺苷酸环化酶(pac)。光活化腺苷酸环化酶是通过光进行活化而产生环磷酸腺苷(camp)的蛋白质，具有bluf(sensor of blue light using fad，使用fad的蓝光传感器)区域及环化酶催化区域。bluf区域是fad或fmn结合的区域，参与利用了fad的蓝光的感知。环化酶催化区域是将atp转换为camp的区域。pac基因在各种生物中被发现(例如，非专利文献1)。来源于蓝藻的颤藻属的光活化腺苷酸环化酶(oapac)是可以在人细胞中容易地表达的同源二聚体，且已公开其结晶结构，另外与哺乳类细胞系的表达的兼容性良好，因此，是适合于医学应用的camp调节用光学探针。
4.现有技术文献
5.非专利文献
6.非专利文献1：iseki et al.,nature,vol.415,pp.1047-1051，2002年2月28日


技术实现要素：

7.发明所要解决的技术问题
8.野生型的oapac蛋白的光活化效率较低，oapac蛋白的光活化需要较强的光的照射。因此，表达野生型的oapac蛋白的生物体有可能因光照射而产生光损伤。
9.本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种具有与野生型的oapac蛋白相比更高的光活化效率的新型的光活化腺苷酸环化酶。
10.用于解决技术问题的手段
11.本发明人等经研究，其结果发现，通过自野生型oapac蛋白的c末端缺失特定数量的氨基酸残基，oapac蛋白的光活化效率提高，从而完成本发明。由于oapac蛋白的c末端是与一直以来被认为对于发挥pac活性而言重要的bluf区域及环化酶催化区域完全不同的部位，因此，本发明人等的oapac蛋白的c末端及其附近会对光活化效率产生影响的见解令人惊讶。
12.本发明涉及以下的[1]至[5]。
[0013]
[1]一种蛋白质，其中，所述蛋白质具有光活化腺苷酸环化酶活性，且由自c末端缺失1～18个氨基酸残基的序列编号1的氨基酸序列、或与其具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成。
[0014]
[2]如上述[1]所述的蛋白质，其中，序列编号1的氨基酸序列的自c末端所缺失的
氨基酸残基的数量为5～7。
[0015]
[3]一种核酸，其对上述[1]或[2]所述的蛋白质进行编码。
[0016]
[4]一种载体，其包含上述[3]所述的核酸。
[0017]
[5]一种转化体，其导入有上述[4]所述的载体。
[0018]
另外，本发明也涉及以下的[6]及[7]。
[0019]
[6]一种上述[1]或[2]所述的蛋白质的制造方法，其包括培养上述[5]所述的转化体。
[0020]
[7]一种提高腺苷酸环化酶的光活化效率的方法，其包括自光活化腺苷酸环化酶的c末端缺失1～18个氨基酸残基，上述光活化腺苷酸环化酶来源于颤藻属。
[0021]
发明的效果
[0022]
根据本发明，提供一种具有与野生型oapac蛋白相比更高的光活化效率的新型的光活化腺苷酸环化酶。
[0023]
另外，根据本发明，提供一种具有变化广泛的光活化效率的光活化腺苷酸环化酶。光活化所使用的照射光的理想的光强度根据光活化腺苷酸环化酶的利用方法而不同，因此，要求光活化效率有变化。例如，在通常的实验室中在培养皿上对导入有光活化腺苷酸环化酶的培养细胞进行处理的情况下，如果光活化腺苷酸环化酶的光活化效率过高，则有可能在利用规定光源进行光照射前，腺苷酸环化酶因室内的顶灯而被光活化。另一方面，在向光不易到达的生物体深部的细胞中导入光活化腺苷酸环化酶的情况下，如果光活化腺苷酸环化酶的光活化效率较低，则存在足以光活化的强度的光未到达细胞而无法使光活化腺苷酸环化酶活化的可能性。根据本发明，提供一种具有可以应对各种状况的广泛变化的光活化效率的光活化腺苷酸环化酶，因此，可以应对如上所述的各种状况。
附图说明
[0024]
图1是oapac(oa-366)蛋白、来源于贝氏硫细菌(beggiatoa sp)的光活化腺苷酸环化酶(bpac)及纤细裸藻(小眼虫(euglena gracilis))的光活化腺苷酸环化酶的α链的一部分(pacαc)的氨基酸序列的比对。红框所包围的白字的氨基酸残基是各种生物的光活化腺苷酸环化酶中所保存的氨基酸残基。
[0025]
图2是表示野生型及突变型oapac蛋白的光活化效率的图表。
具体实施方式
[0026]
本发明的一个实施方式的蛋白质具有光活化腺苷酸环化酶活性(以下，称为pac活性)，且由自c末端缺失1～18个氨基酸残基的序列编号1的氨基酸序列、或与其具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成。本说明书中的光活化腺苷酸环化酶活性是指通过光照射而发挥(即，被活化)的腺苷酸环化酶活性。序列编号1的氨基酸序列是蓝藻尖细颤藻(oscillatoria acuminata)的野生型oapac蛋白(oa-366蛋白)的氨基酸序列。在本说明书中，c末端是指蛋白质的两末端中以游离羧基封端一侧的最末端。例如，由366个氨基酸残基构成的序列编号1的氨基酸序列的c末端的氨基酸残基是作为第366个氨基酸残基的白氨酸残基。
[0027]
更具体而言，本实施方式的蛋白质可以由自序列编号1的氨基酸序列的c末端缺失
1～18个、2～18个、3～18个、5～18个、6～18个、8～18个、9～18个或5～7个氨基酸残基而获得的氨基酸序列或者与其具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成。序列编号1的氨基酸序列的自c末端所缺失的氨基酸残基的数量可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或其以上，也可以为18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或其以下。在自c末端所缺失的氨基酸残基的数量为8～18的情况下，蛋白质的光活化效率特别高。另一方面，在自c末端所缺失的氨基酸残基的数量为5～7的情况下，蛋白质的光活化效率与所缺失的氨基酸残基的数量为8～18或1～4的情况相比为中等程度。具有中等程度的光活化效率的光活化腺苷酸环化酶以前在其他生物中也未发现，因此，由自c末端缺失5～7个氨基酸残基的序列编号1的氨基酸序列、或与其具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的有用性极高。
[0028]
本实施方式的蛋白质也可以由序列编号2、序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6或序列编号7的氨基酸序列构成。这些氨基酸序列是自序列编号1的氨基酸序列分别缺失第364个～第366个、第361个～第366个、第358个～第366个、第355个～第366个、第352个～第366个及第349个～第366个氨基酸残基而获得的氨基酸序列。本实施方式的蛋白质也可以由与序列编号2～序列编号7中的任一个的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成。将序列编号1～序列编号7的氨基酸序列的详细情况示于表1。以下，也将由序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6及序列编号7的氨基酸序列构成的蛋白质分别称为oa-366蛋白、oa-363蛋白、oa-360蛋白、oa-357蛋白、oa-354蛋白、oa-351蛋白及oa-348蛋白。
[0029]
[表1]
[0030][0031]
上述序列同一性具体而言也可以为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其以上。本实施方式的上述自c末端缺失1～18个氨基酸残基的序列编号1的氨基酸序列在不损害与野生型oapac蛋白相比更高的光活化效率(即，较高的pac活性的
效率)的范围内，更具体而言，在不损害与来源于尖细颤藻(oscillatoria acuminate)的野生型光活化腺苷酸环化酶相比更高的光活化效率的范围内，可以进一步具有选自氨基酸残基的置换、缺失、插入及附加中的1种以上的突变。例如，将与序列编号1的氨基酸序列的自c末端所缺失的氨基酸残基相同的氨基酸残基附加于c末端的突变抵消因自c末端缺失氨基酸残基获得的光活化效率的提高，因此，这样的突变不优选。自c末端缺失1～18个氨基酸残基的序列编号1的氨基酸序列的第348个氨基酸残基之后的氨基酸残基的数量及与自c末端缺失1～18个氨基酸残基的序列编号1的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的上述第348个氨基酸残基所对应的氨基酸残基之后的氨基酸残基的数量可以一致，也可以不一致。
[0032]
图1是oapac(oa-366)蛋白、贝氏硫细菌(beggiatoa sp)的光活化腺苷酸环化酶(bpac)及纤细裸藻(euglena gracilis)的光活化腺苷酸环化酶的α链的一部分(pacαc)的氨基酸序列的比对。在图1中，红框所包围的白字的氨基酸残基是各种生物的光活化腺苷酸环化酶中所保存的氨基酸残基。保存氨基酸残基在发挥pac活性的方面较为重要，因此，在本实施方式中，这些氨基酸残基未突变。即，本实施方式的蛋白质在序列编号1的氨基酸序列的leu4、tyr6、ile7、ser8、ser15、ile22、asn30、asn34、thr36、gly37、leu39、leu40、gly44、phe46、gln48、leu50、glu51、gly52、tyr61、ile64、asp67、arg69、his70、arg85、glu99、pro107、leu112、ser118、leu122、glu123、tyr125、glu137、asn139、pro140、pro145、val148、glu149、asp156、ile157、phe160、glu165、lys166、glu171、val172、asn177、cys183、thr184、ile187、gly191、gly192、glu193、val194、lys196、ile198、gly199、asp200、cys201、val202、ala204、phe206、asp212、ala214、ile221、leu228、arg229、gly244、gly246、leu247、gly250、val252、ile253、gly258、ser259、gly269、glu279、ala280、leu281、thr282、arg283、ala288、val295、gly315、tyr323、leu337及leu347所对应的氨基酸残基不具有突变。
[0033]
在本实施方式的蛋白质中，序列编号1的氨基酸序列的第349个～第366个氨基酸残基中未缺失的氨基酸残基所对应的氨基酸残基可以置换为其他氨基酸残基，也可以不置换，置换的种类可以为保守性置换。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸残基可以置换为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸或异白氨酸残基，具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸残基可以置换为丝氨酸或苏氨酸残基，具有芳香族侧链的氨基酸残基可以置换为苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或组氨酸残基，具有碱性侧链的氨基酸残基可以置换为赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基，具有酸性侧链的氨基酸残基可以置换为天冬氨酸或谷氨酸残基，具有含有酰胺的侧链的氨基酸残基可以置换为天冬酰胺或谷酰胺残基，具有含硫侧链的氨基酸残基可以置换为半胱氨酸或蛋氨酸。
[0034]
本实施方式的蛋白质的光活化效率可以通过通常用于评价酶活性的方法，更具体而言，通过通常用于评价光活化腺苷酸环化酶的pac活性的方法进行评价。例如，本实施方式的蛋白质由于通过光活化产生camp，因此，可以基于通过光照射而产生的camp的量来评价光活化效率。基于camp的量评价光活化效率的方法并无特别限定，光活化效率例如可以通过如下方式进行评价：准备表达本实施方式的蛋白质与camp的报告蛋白的细胞，经由报告蛋白的发光量监测细胞内所产生的camp的量。camp的报告蛋白并无特别限定，可以根据细胞的种类适当地选择。报告蛋白例如可以是利用pglosensor 22f camp plasmid(promega corporation)等市售品而获得的蛋白质。pglosensor 22f camp是将camp结合区
域插入至萤火虫荧光素酶的内部而成的修饰型荧光素酶，如果camp结合于camp结合区域，则结构改变而与荧光素反应，发光量增加。
[0035]
本实施方式的蛋白质例如可以通过将包含对该蛋白质进行编码的核酸的载体导入至宿主细胞中，对所获得的转化体进行培养而获得。核酸、载体及转化体的详细情况如下所述。培养方法并无特别限定，培养基的种类及培养条件可以根据宿主细胞的种类适当地选择或调整。
[0036]
本发明的一个实施方式的核酸对上述实施方式的蛋白质进行编码。由序列编号8的碱基序列构成的核酸是通过将野生型oapac基因的密码子对于哺乳类而言进行优化而获得的，并且对野生型oapac蛋白(oa-366蛋白)进行编码。本实施方式的核酸例如可以为通过自野生型oapac基因的碱基序列或序列编号8的碱基序列缺失特定的核苷酸而获得的核酸，也可以为由与其具有90％以上的序列同一性的碱基序列构成的核酸。所缺失的核苷酸可以为对野生型oapac蛋白(oa-366蛋白)的自c末端的氨基酸残基起计数为1～18个的连续的氨基酸残基(其中，将c末端的氨基酸残基计数为1)进行编码的核苷酸。
[0037]
本发明的一个实施方式的载体包含上述实施方式的核酸。组入核酸的载体只要是可以使被核酸编码的蛋白质在宿主细胞内表达的载体，则也可以为任何载体。载体例如可以为临时载体或稳定表达载体，也可以为质粒载体或病毒载体。组入核酸的载体可以包含限制酶位点、用于所插入的基因的表达的控制序列、抗生素耐性基因、用于筛选转化体的序列等各种序列。作为组入核酸的载体，例如可以利用pebmulti-hygro载体(fujifilm wako pure chemical corporation)等市售品。
[0038]
本实施方式的转化体可以通过将上述实施方式的载体导入至宿主细胞而获得。在本说明书中，转化体不限于经转化的原核细胞，是指经导入外来基因的所有细胞。即，宿主细胞并无特别限定，可以为大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞，也可以为酵母、动物细胞等真核细胞。动物细胞例如可以为哺乳动物细胞，更具体而言，可以为小鼠细胞或人细胞。载体的导入方法并无限定，可以根据宿主细胞的种类适当地选择基因工程常用的临时性或稳定的转化或转染的方法。
[0039]
实施例
[0040]
(1)oapac表达构建体的制作
[0041]
合成具有对于哺乳类而言经优化的密码子的oapac基因(oa-366基因；序列编号8)。另外，利用通常的基因重组技术自oa-366的碱基序列缺失特定的核苷酸，获得作为突变型oapac基因的oa-363、oa-360、oa-357、oa-354、oa-351及oa-348。将所缺失的核苷酸的位置示于表2。
[0042]
[表2]
[0043][0044]
将oa-366基因与2a及rfp基因一同组入至pebmulti-hygro(fujifilm wako pure chemical corporation)中，获得oa-366基因及rfp基因的双顺反子表达构建体pebmulti-hygro-rfp-2a-oa-366。2a是用于使突变型oapac基因及rfp基因均等地表达的2a-肽，rfp基因是对红色荧光蛋白的突变体rudolph-rfp(atum公司)进行编码的基因。关于其他突变型oapac基因，也同样地制作表达构建体。
[0045]
(2)camp报告表达细胞株的建立
[0046]
将glosensor(商标)-22f camp基因(promega corporation)组入至哺乳类表达载体pebmulti-neo(fujifilm wako pure chemical corporation)中。通过使用fugene(注册商标)hd(promega corporation)的脂质转染将所获得的pebmulti-neo-glosensor-22f camp质粒导入至人胚胎肾脏细胞hek293(kac株式会社)，建立稳定表达glosensor-22f camp的细胞株。
[0047]
(3)oapac表达细胞的制备
[0048]
通过使用了ingenio(注册商标)带有0.4cm比色皿的电穿孔套件(electroporation kit with 0.4cm cuvettes)(mirus bio co.)及gene pulser电穿孔系统(bio-rad laboratories inc.，施加条件：260v、950μf)的电穿孔法将各oapac表达构建体导入至glosensor-22f camp表达hek293中，获得表达野生型或突变型oapac蛋白与glosensor-22f camp蛋白的hek293。再者，因2a-肽的作用，使得oapac蛋白的表达程度与rfp蛋白的表达程度相等，因此，oapac蛋白的表达程度通过rfp的荧光强度进行确认。
[0049]
(4)oapac的光活化
[0050]
将oapac表达hek293接种在35mm培养皿(biocoat(商标)胶原蛋白i，corning inc.)中，利用2ml的培养基(添加有10％fbs及4mm的l-谷酰胺的dmem高葡萄糖培养基(dmem high glucose with 10％fbs and 4mm l-glutamine)，thermo fisher scientific inc.)进行培养。在向细胞照射光的数小时前将培养基更换为co2非依赖性培养基(thermo fisher scientific inc.)，以最终浓度0.12mg/ml添加glosensor camp试剂(promega corporation)。数小时后，使用安装有em-ccd摄影机(imagem c9100-23b，浜松光子学株式会社)及蓝色led(lxml-pr01-0425，luxeon rebel，philips lumileds公司)的倒置荧光显微镜(eclipse te-300，nikon co.,ltd.)，在暗室中进行以下的照射实验。
[0051]
向oapac表达hek293分别照射20秒光强度1.5
×
10μmol/m2/s、6.1
×
10μmol/m2/s、1.1
×
102μmol/m2/s、4.5
×
102μmol/m2/s、1.5
×
103μmol/m2/s及5.7
×
103μmol/m2/s的蓝光。下一强度的光照射是等待至以当前的光照射所引起的活性上升完全镇静化后再实施。利用
em-ccd摄影机捕捉自hek293所发出的glosensor-22f camp的发光，根据所获得的图像，使用imagej software(http://imagej.nih.gov/ij)对发光强度进行定量。
[0052]
图2是表示野生型及突变型oapac蛋白的光活化效率的图表。纵轴的数值具体表示glosensor-22f camp的发光量，但其为仅依赖于通过经光活化的oapac蛋白而产生的camp的浓度的数值，因此，轴的标题记为经光活化的酶的活性(相对值)。如图2所示，分别通过自序列编号1的氨基酸序列的c末端缺失9个、12个、15个及18个氨基酸残基所获得的oa-357蛋白、oa-354蛋白、oa-351蛋白及oa-348蛋白与野生型oapac蛋白(oa-366蛋白)相比显示出特别高的光活化效率。另一方面，通过自c末端缺失3个氨基酸残基所获得的oa-363蛋白的光活化效率与野生型oapac蛋白相比明显改善，但与上述4个oapac相比较低。通过自序列编号1的氨基酸序列的c末端缺失6个氨基酸残基所获得的oa-360蛋白显示出在突变型oapac蛋白中为中等程度、但与野生型oapac蛋白相比较高的光活化效率。如上所述，光活化所使用的照射光的优选的光强度根据oapac蛋白的利用方法而不同，因此，要求光活化效率有变化。因此，可以认为上述突变型蛋白质均有用。