一株ppc降解菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株塑料降解菌及其应用。
背景技术：
2.地膜残留物密布土壤整个耕作层，破坏了农田生态环境和土壤结构，造成农作物烂种、烂芽、缺苗断垅及根系坏死，对作物生长发育造成了不良的“负面效应”，棉花、小麦、玉米等十多种作物减产达10％～22％，地膜残留量越多对农作物产量的影响就越大；因此可降解地膜应运而生。可降解地膜这项技术的原料主要来自发电厂、水泥厂和化肥厂等工厂作为废弃物排出去的二氧化碳，如ppc(poly propylene carbonate)地膜，其产品在废弃后能够被自然降解，最终完全被分解成二氧化碳和水，被植物吸收，为植物生长提供养分，能从根本上解决地膜造成的环境污染问题。
3.但完全依靠自然降解ppc地膜，降解速度还是不能令人满意。
技术实现要素：
4.本发明提供了一株ppc降解菌及其应用，可通过在农田生态下施加加速分解ppc地膜。
5.本发明枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.23106。
6.上述ppc降解菌在ppc降解中的用途。
7.本发明枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16可以利用ppc地膜作为唯一碳源进行生长，且对ppc地膜具有理想的降解效果。
8.本发明对ppc资源的大面积推广使用，以及提高农作物产量、保护环境资源都具有重要意义。
9.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16为枯草芽孢杆菌，属于芽孢杆菌属(bacillus)；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.23106，保藏日期为2021年8月2日。
附图说明
10.图1是lb培养基上枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16的菌落形态；
11.图2是枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16在改良的sm培养基中的生长曲线图；
12.图3是枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16降解对比实验，ppc地膜对比图，其中图3a为对照组，图3b为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16实验组；
13.图4是枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16降解对比实验，ppc地膜微观形态对比图，其中图4a为对照组，图4b为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16实验组；
14.图5是枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16降解对比实验，ppc地膜傅里叶红外光谱对比图；
15.图6是具体实施方式二田间ppc地膜分解实验结果，其中图6a为对照组，图6b为喷洒枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16实验组；
16.图7是用mega 5.1构建的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16系统进化树。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
19.具体实施方式一：本实施方式枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.23106。
20.本实施方式枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16于2021年3月从吉林省长春市玉米非根际土中筛选获得。
21.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16分离及纯化过程：
22.a、取吉林省长春市玉米非根际土壤样品1.0g，风干研磨分散均匀，以1∶10质量比溶入无菌水中，过滤取滤液作为10-1
初始液，依次获得10-2
和10-3
土壤梯度稀释液。分别在固体改良的sm培养基上进行稀释涂布并覆盖ppc地膜，28℃培养5～7d，直至有单个菌落长出，挑取单菌落在lb培养基上纯化，至最终获得单一菌株。
23.b、并将ppc地膜统一剪成5.0cm
×
4.0cm大小的膜片，用3％kcl溶液浸泡1h，再用100％无水乙醇清洗3～4次，最后无菌水润洗，放入干燥无菌的培养皿中烘干后在紫外灯下照射灭菌4h，放入改良的sm培养基(液体培养基)中，然后接种步骤a获得的单菌株，每组3个重复，置于28℃震荡培养箱中培养，观察菌落长势，分别在第10d、20d、30d记录菌液的od
600nm
。
24.其中，改良的sm培养基(无碳源)：nh4no
3 1.0g/l、mgso4·
7h2o 0.2g/l、k2hpo
4 1.0g/l、cacl2·
2h2o 0.1g/l、kcl 0.15g/l、feso4·
6h2o 0.001g/l、znso4·
7h2o 0.001g/l、mnso
4 0.001g/l，ph调至7.8
±
0.2，121℃灭菌20min；固体改良的sm培养基中添加琼脂粉15～20g/l。
25.选出具有ppc地膜降解效果的菌株，并反复复筛，其中菌株j16的ppc地膜降解效果最佳(菌株j16在改良的sm培养基中的生长曲线如图2所示)。菌株j16的its srrna序列及系统发育分析：获得菌株its s rrna基因序列(菌株j16的16s rrna基因序列如seq id no：1所示)与genbank数据库中的已知序列进行blast比对分析，与(kp696781.1)bacillus subtilis isolate f8138相似度到达99.82％，采用mega 5.1构建系统进化树j16菌株为bacillus subtilis属于同一分支，其相似度达到100％(如图7所示)。通过形态特征学鉴定结果(菌株j16在lb培养基上的菌落形态如图1所示)，最终命名为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16。
26.ppc地膜降解实验室模拟：在无菌操作台上，并将ppc地膜统一剪成5.0cm
×
4.0cm大小的膜片，用3％kcl溶液浸泡1h，再用100％无水乙醇清洗3～4次，之后用无菌水润洗，再放入干燥无菌的培养皿中烘干后在紫外灯下照射灭菌4h。将获得的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16于28℃下lb液体培养18h后，于12000rpm转速下离心10min获得菌体，加等体积pbs液体重悬并离心2次后，将获得的菌体用pbs配制成1
×
107cfu/ml枯草芽孢杆菌j16菌液。将灭菌后的ppc地膜和枯草芽孢杆菌j16菌液加入到100ml改良的sm培养基(液体培养基)中，并设置只加入灭菌水的阴性对照组(ck)，每10天测定一次检测od
600nm
，共计30天，并于第30d利用肉眼和扫描电镜观察ppc地膜降解情况，利用傅里叶红外光谱测定ppc地膜的化学官能团变化。
27.试验表明枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16具有肉眼可见的降解ppc地膜的能力，可以显著降解ppc地膜，而ck的ppc地膜没有产生任何变化(实验结果如图3所示)；说明枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16对ppc地膜具有降解作用；经扫描电镜观察，ppc膜片均变得粗糙不平，出现明显的侵蚀孔洞和清晰的裂痕等微观形态(如图4所示)；经傅里叶红外管光谱显示，1 305cm-1
、1 633cm-1
、2 900cm-1
、3702cm-1
的振动峰有明显削弱和位置偏移，其中c-h伸缩振动峰在2 900cm-1
处削弱，1 740cm-1
处酯羰基指数降低(如图5所示)。由于ppc是一种线性饱和碳氢化合物，c-h伸缩振动峰与酯羰基指数的变化间接说明枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16已在利用ppc而导致c-h减弱，表明枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16使ppc发生了生物降解，导致其表面的化学功能团发生了变化。
28.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16在28℃震荡培养条件下能够高效降解ppc地膜，为可降解地膜的原位腐解开发及其利用奠定了良好的基础。
29.具体实施方式二：本实施方式将ppc地膜在玉米田间进行高垄覆盖，即培养畦经整地上肥后，按45～60cm宽，10cm高起垄，一垄盖一条地膜。将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16用pbs配制成1
×
107cfu/ml枯草芽孢杆菌j16菌液，每10d喷洒于地表，于90d后观察枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16田间的ppc降解效果。试验表明枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16具有肉眼可见的降解ppc地膜的能力，在田间可将ppc地膜分解成小块且边缘不整齐，而未施加枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)j16的地膜在田间没有发生断裂和碎裂，且边缘整齐光滑。(如图6所示)。