1.本发明涉及医疗器械领域，特别涉及重组蛋白、含该重组蛋白的蛋白海绵制品和应用。


背景技术：

2.组织粘合剂是指能够在体内聚合，由此引发组织间或组织与非组织(如植入体)间的粘合，并且具有控制流血(止血)及阻止气体和液体流动(密封)等功能的一类生物材料。现代医学在修复受损组织时不仅要求最大程度的恢复其功能和外观，而且还要最大限度的减少病人痛苦。在处置尺寸较大的受损组织时，通常采用机械固定的传统方法，如用缝合线或铆钉等固定组织的位置。用于临床使用的固定材料需要满足以下条件：
3.(1)能使组织紧密连接；
4.(2)有一定的治疗作用；
5.(3)能阻止体液渗出；
6.(4)在承受载荷时有一定的伸缩性。
7.目前通常采用传统缝合或钉合的方法来拉近并固定受损组织，但是这一做法的效果并不理想，因为在缝合或钉合操作中所用的缝合线、铆钉等固定材料除固定作用外并不具备更多复杂的功能(如对受伤部位的紧密密封、消炎、镇痛等)；此外在手术中，伤口缝合可能引起出血或周围组织的损害，在伤口愈合后会留有疤痕并且还有创口拆线的痛苦(对幼儿这一点更为突出)。采用组织粘合剂粘合创口的方法固定、修复受损组织是解决这一问题的有效的途径。与传统的方法相比，应用组织粘合剂粘合创口具有诸多优势，如：
8.(1)操作方便、损伤小、使用后不需要拆除并且愈合后几乎无疤痕产生，还能够满足微创技术的需求；
9.(2)组织粘合剂本身还能够作为止血、抗菌和消炎药物的载体起到药物控释的作用，这使搭载药物的组织粘合剂在固定受损组织的同时兼具止血、消炎等功能，并可作为细胞支架加速伤口愈合；
10.(3)组织粘合剂可以通过注射、喷涂等方法使用，相对于缝合和钉合，其使用简单易行，无需专业操作。
11.另一方面，组织粘合剂快速的止血和伤口粘合功能尤其适合在战时环境下第一时间处置难以缝合的伤情，甚至处置一些止血绷带难以处理的内部创伤；此外，组织粘合剂在对伤口进行快速密封的同时还能起到防止伤口与外界进一步的接触，起到预防感染的效果。据报道战争中很大部分战场死亡是在受伤后与到达野战医院这段时间内发生的，如能使用加入止血和镇痛等药物的高效组织粘合剂，将会挽救更多的生命。此外，随着临床医学技术的发展，微创技术已经在临床各科广泛开展，但由于微创手术的创口小，视野和操作性有限，在操作中难以使用上述传统的创伤组织机械固定技术。因此，组织粘合剂在外科手术、整形美容、战场救护等方面有着极为广泛的应用前景。目前常用的组织粘合剂有三种：纤维蛋白粘合剂粘合剂；明胶-间苯二酚-甲醛及氰基丙烯酸酯粘合剂。
12.理想的组织粘合材料需具备以下性能：
13.(1)在常温常压下即可使组织紧密连接；
14.(2)材料本身无菌、无免疫原性；
15.(3)材料在一定的时间内能够抑制细菌生长并且最好具有一定的治疗作用；
16.(4)在潮湿环境下(即有水、血液、组织液等存在情况下)对受损组织能产生有效的粘合并能阻止体液渗出；
17.(5)材料对人体无毒或低毒，无过敏反应、炎症反应以及异物反应、无三致性(致畸、致癌以及致突变)；
18.(6)材料自身可降解并且降解产物也无毒；
19.(7)材料的生物相容性好，其溶出物等不对机体细胞产生毒性，不影响受损机体组织的愈合；
20.(8)有合适的硬度、强度和韧性等力学性能。
21.目前常用的三类组织粘合剂，氰基丙烯酸酯和明胶-间苯二酚都具有良好的粘合性能，但由于氰基丙烯酸酯降解产物会引起细胞凋亡，而明胶-间苯二酚系统需要甲醛做固化剂，因此以上两种组织粘合剂具有较强的细胞毒性，都不是理想的组织粘合材料；虽然纤维蛋白粘合剂具有优良生物相容性，但其组织的结合强度相对较低，加之生产需要以血液为原料，生产成本高且存在传播某些缘于血液疾病的风险，故该粘合剂也难以大规模使用。由此可见，由于粘合强度、生物相容性和安全性等限制，目前临床使用的组织粘合剂尚不能完全替代传统的缝合线及铆钉等固定材料，因此迫切需要研制一种生物相容性好、成本低、能够满足临床固定要求且能在液体环境下使用的组织粘合剂。


技术实现要素：

22.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于生物工程仿生可吸收蛋白海绵组织快速止血粘合剂、其制备方法及应用，该组织止血粘合剂具有较高生物相容性且较强的粘合效果。
23.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
24.本发明的第一方面提供了重组蛋白，包括无规则卷曲组成的柔性链段、富含β-sheet的晶态刚性区序列和vpgxg重复序列。
25.在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的重组蛋白，包括鱿鱼环齿蛋白无规则卷曲组成的柔性链段、鱿鱼环齿蛋白富含β-sheet的晶态刚性区序列、含(vpgxg)重复序列，及该重组蛋白与具有抗炎、抗感染、促进细胞生长等功能片段的蛋白序列的组合。
26.在本发明的一些具体实施方案中，所述重组蛋白还包括具有抗炎、抗感染和/或促进细胞生长的功能片段。
27.在本发明的一些具体实施方案中，所述无规则卷曲组成的柔性链段、所述富含β-sheet的晶态刚性区序列、所述vpgxg重复序列以及所述具有抗炎、抗感染和/或促进细胞生长的功能片段，通过肽键直接相连或通过连接肽相连。
28.在本发明的一些具体实施方案中，所述无规则卷曲组成的柔性链段具有：
29.(i)、如seq id no.1所示的氨基酸序列；或
30.(ii)、如(i)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基
酸序列，且与(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
31.(iii)、与如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列；
32.或
33.所述富含β-sheet的晶态刚性区序列具有：
34.(1)、如seq id no.2所示的氨基酸序列；或
35.(2)、如(1)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(1)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
36.(3)、与如(1)或(2)所述的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列；
37.或
38.所述具有抗炎、抗感染和/或促进细胞生长的功能片段具有：
39.(i)、如seq id no.3～6任意所示的氨基酸序列；或
40.(ii)、如(i)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
41.(iii)、与如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列。
42.具体的，所述具有促进细胞生长的蛋白序列来自于人源转化生长因子β1(seq id no.3)、人源转化生长因子β2(seq id no.4)、人源转化生长因子β3(seq id no.5)或人源表皮生长因子部分序列(seq id no.6)。
43.在本发明的一些具体实施方案中，所述vpgxg重复序列包括n个重复单元vpgxg；其中，x为任意一种天然氨基酸，n为大于零的整数；优选地，n为5～20之间的整数；更优选地，x为缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
44.在一些优选的实施方案中，重复序列单元具有[(vpgkg)5(vpgvg)]特征结构；在一些优选的实施方案中，重复序列单元具有[(vpgkg)8]特征结构；在一些优选的实施方案中，重复序列单元具有[(vpgag)(vpgkg)4]特征结构；在一些优选的实施方案中，重复序列单元具有[(vpgvg)(vpgkg)3(vpgag)(vpgkg)3]特征结构；在另一些优选的实施方案中，重复序列单元具有[(vpgag)(vpgkg)4(vpgvg)]特征结构。
[0045]
在本发明的一些具体实施方案中，所述连接肽包括多个连续的任意氨基酸。
[0046]
在本发明的一些具体实施方案中，本发明重组蛋白还包含该蛋白的保守性修饰变体。所述保守性修饰变体包括本发明重组蛋白中的10％的氨基酸，优选5％的氨基酸，更优选2％的氨基酸，最优选1个氨基酸被其功能上相似的保守性氨基酸全部、或者部分置换所得的变体。所述保守性置换是本领域公知的，包括以下6组氨基酸：
[0047]
丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；
[0048]
天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；
[0049]
天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；
[0050]
精氨酸(r)、赖氨酸(k)；
[0051]
异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；
[0052]
苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)。
[0053]
由此获得的重组蛋白变体的总净电荷和其分子上电荷分布与置换前基本上保持相同。
[0054]
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组蛋白具有：
[0055]
(a)、如seq id no.7～23任意所示的氨基酸序列；或
[0056]
(b)、如(a)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(a)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
[0057]
(c)、与如(a)或(b)所述的氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列。
[0058]
在一些实施方案中，所述重组蛋白具有与seq id no.7～seq id no.23中任一个至少85％、至少90％、至少95％，优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性、且与其功能相同或相似的氨基酸序列。
[0059]
在一些更优选的实施方案中，所述重组蛋白具有seq id no.8、seq id no.10、seq id no.17、seq id no.21、seq id no.22、seq id no.23中任一个所示的氨基酸序列。
[0060]
基于上述研究，本发明还提供了编码所述重组蛋白的核酸分子。
[0061]
在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有：
[0062]
(a)、如seq id no.24～40任意所示的核苷酸序列；或
[0063]
(b)、如seq id no.24～40任意所示的核苷酸序列的反向互补核苷酸序列；或
[0064]
(c)、与(a)或(b)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(a)或(b)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
[0065]
(d)、与(a)、(b)或(c)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(a)、(b)或(c)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0066]
(e)、与(a)、(b)、(c)或(d)所述核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列。
[0067]
在一些实施方案中，所述核酸分子具有与seq id no.24～seq id no.40中任一个至少85％、至少90％、至少95％，优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性的核苷酸序列。
[0068]
在一些实施方案中，所述核酸可由编码相同氨基酸的不同的连续三个碱基的密码子所替换。所述同氨基酸碱基替换是本领域所公知的，包含以下20种密码子替换：
[0069]
1)苯丙氨酸(f)：ttt、ttc；
[0070]
2)亮氨酸(l)：tta、ttg、ctt、ctc、cta、ctg；
[0071]
3)异亮氨酸(i)：att、atc、ata；
[0072]
4)缬氨酸(v)：gtt、gtc、gta、gtg；
[0073]
5)丝氨酸(s)：tct、tcc、tca、tcg；
[0074]
6)脯氨酸(p)：cct、ccc、cca、ccg；
[0075]
7)苏氨酸(t)：act、acc、aca、acg；
[0076]
8)丙氨酸(a)：gct、gcc、gca、gcg；
[0077]
9)酪氨酸(y)：tat、tac；
[0078]
10)组氨酸(h)：cat、cac；
[0079]
11)谷氨酰胺(q)：caa、cag；
[0080]
12)天冬酰胺(n)：aat、aac；
[0081]
13)赖氨酸(k)：aaa、aag；
[0082]
14)天冬氨酸(d)：gat，gac；
[0083]
15)谷氨酸(e)：gaa、gag；
[0084]
16)半胱氨酸(c)：tgt、tgc；
[0085]
17)精氨酸(r)：cgt、cgc、cga、cgg、aga、agg；
[0086]
18)丝氨酸(s)：agt、agc；
[0087]
19)甘氨酸(g)：ggt、ggc、gga、ggg；
[0088]
20)终止密码子：taa、tag、tga。
[0089]
由此获得的核酸变体编码与原核酸相同的氨基酸序列。
[0090]
本发明的第二方面提供了表达载体，包括所述核酸分子。在一些实施方案中，所述表达载体的骨架载体为pet25b。
[0091]
本发明的第三方面提供了宿主细胞，转化或转染所述的表达载体。
[0092]
本发明的第四方面提供了所述重组蛋白的制备方法，构建所述表达载体，转化或转染获得所述宿主细胞，培养所述宿主细胞，诱导表达，分离、破碎，收集并纯化，获得所述重组蛋白。
[0093]
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法具体包括以下步骤：
[0094]
(1)构建本发明第二方面所述核酸的表达载体；
[0095]
(2)将本发明第二方面所述的核酸表达载体转化或转染入宿主细胞；
[0096]
(3)培养宿主细胞，诱导本发明第一方面所述的重组蛋白的表达；
[0097]
(4)分离表达了重组蛋白的宿主细胞；
[0098]
(5)对宿主细胞进行破碎处理，并收集沉淀；
[0099]
(6)通过纯化对沉淀进一步处理，获取权利要求8所述重组蛋白产品。
[0100]
在一些实施方案中，所述方法的步骤(1)中采用的原核表达载体是pet25b。
[0101]
在一些实施方案中，所述方法的步骤(2)中的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
[0102]
在一些实施方案中，所述方法的步骤(3)中的宿主细胞通过发酵罐或者摇瓶培养。在一些具体的实施方案中，宿主细胞先通过平板涂布的方式涂布于氨苄青霉素抗性的琼脂糖平板中，再挑取宿主细胞单菌落接入5ml lb液体培养基(氨苄青霉素浓度100μg/ml)制备为一级种子。以10％的接种量将一级种子转接于500ml lb液体培养基(氨苄青霉素浓度100μg/ml)中，于37℃，220r/min培养12小时，以此菌液作为二级发酵种子液，二级种子液od为5～10。以1.67％的接种量将二级种子液接种于摇瓶中培养，随后加入氨苄青霉素配置液(终浓度200μg/ml)，起始od600约为0.1-0.5。当od升高至0.8-1.2时，注入iptg溶液，使其终浓度为0.1-1.0mm，继续培养4h～16h，；
[0103]
在一些具体的实施方案中，二级种子液接种于发酵罐中培养，后加入氨苄青霉素配置液(终浓度200μg/ml)，起始od600为0.1-0.5。在前期富集阶段，温度：37℃，转速300-500rpm；空气供给量30.0-45.0l/min；罐压0.05mpa；通过氨水调节ph至6.9。在补料培养阶段，使用蠕动泵补充葡萄糖，补料后控制溶氧＞20％。当od600达到10之前，快速生长阶段，持续补充葡萄糖。当od达到10-15时，葡萄糖补料维持稳定的速度，控制供氧水平。当od600达到30，停止补料约1～3min，待溶氧回升至40～60％，排出罐压并用注射器注入iptg溶液，使其终浓度为0.5mm，再恢复补料，补料至发酵结束前2h停止。
[0104]
在一些实施方案中，所述方法的步骤(4)中的分离过程包括离心和缓冲液漂洗。
[0105]
在一些实施方案中，所述方法的步骤(5)中的破碎处理包括超声破碎、高压破碎、
震荡破碎等；所述收集沉淀步骤包括离心和过滤。在一些具体的实验方案中，收集的菌体以1:3～1:10的质量/体积比与平衡液a均匀混合后进行破碎处理。在一些具体的实施方案中，超声破碎的功率为35％～40％。在一些具体的实施方案中，高压破碎的压力为25-35kpsi。
[0106]
在一些实施方案中，所述方法的步骤(6)中的纯化手段包括离心、亲和层析、疏水层析、透析、漂洗、离心和超滤。在一些具体的实验方案中，菌体破碎后的产物通过在3000g～18000g转速下离心20～40min后收集沉淀，并以提取缓冲液反复清洗沉淀2～4次，获得重组蛋白沉淀；
[0107]
在一些具体的实施方案中，菌体破碎后的重组蛋白沉淀进一步以平衡液b充分溶解，并于12000g～18000g转速下离心20～40min，并收集上清，为重组蛋白高盐溶液；在一些具体的实验方案中，将重组蛋白沉淀溶解后上清吸附到镍柱(ni6xff)上，再用洗脱液洗脱，收集产物，同为重组蛋白的高盐溶液；在另一些具体的实施方案中，菌体破碎后的重组蛋白沉淀以平衡液b充分溶解，并于12000g～18000g转速下离心20～40min后，取上清吸附到疏水层析柱上，洗脱得重组蛋白高盐产物。
[0108]
在一些具体的实施方案中，重组蛋白的高盐溶液转入透析袋中，并置于含有5％乙酸的水溶液中进行透析，至容易澄清透明，为重组蛋白的水溶液；
[0109]
在一些具体的实施方案中，重组蛋白的水溶液进一步通过分子筛层析(hiprep 26/50desalting)去除乙酸成分，为重组蛋白纯品。
[0110]
在一些具体的实施方案中，所述平衡液a配方为：50mm tris,500mm nacl,2mm edta,ph 7.4；提取液配方为：100mm tris,500mm nacl,5mm edta,2％triton,ph 7.4；清洗液配方为：100mm tris,ph 7.4；平衡液b配方为：4m硫氰酸胍,500mm nacl,100mm nah2po4,10mm tris,ph 8.5；洗脱液配方为：4m硫氰酸胍,500mm nacl,100mm nah2po4,10mm tris,ph 4.5；透析袋截留分子量为5000d。
[0111]
在本发明的一些具体实施方案中，所述纯化包括以含有硫氰酸胍的缓冲液溶解蛋白、亲和层析、透析、分子筛层析中的一种或多种。
[0112]
本发明的第五方面提供了所述重组蛋白、所述核酸分子、所述表达载体、所述宿主细胞在制备粘合剂、止血剂或密封剂中的应用。
[0113]
本发明的第六方面提供了生物制品或药物，包括所述重组蛋白以及可接受的辅料。
[0114]
在本发明的一些具体实施方案中，所述生物制品包括蛋白海绵、止血剂、粘合剂或密封剂中的一种或多种。
[0115]
在一些具体的实施方案中，重组蛋白水溶液或重组蛋白纯品进一步通过冻干的方式，除去挥发性试剂或水成分，制备为蛋白海绵。在一些具体的实施方案中，重组蛋白水溶液与胶原蛋白溶液混合，并进一步通过冻干的方式，制备成蛋白海绵。在一些具体的实施方案中，重组蛋白水溶液与壳聚糖混合，并进一步通过冻干的方式，制备成蛋白海绵。在一些具体的实施方案中，重组蛋白水溶液与重组人生长因子蛋白混合，并进一步通过冻干的方式，制备成蛋白海绵。
[0116]
本发明第七方面提供了本发明所述的重组蛋白以及获得的蛋白海绵用于界面粘合的应用。
[0117]
在一些具体的实验方案中，重组蛋白在硬底片中具有极强的粘合性能；在一些具
体的实验方案中，蛋白海绵具有快速封闭肝脏、心脏、肾脏、动脉的穿孔和止血的效果；在另一些具体的实验中，蛋白海绵具有快封闭肺部、膀胱穿孔，阻止气体泄漏的效果。
[0118]
本发明的重组蛋白制品(包括重组蛋白海绵)含有鱿鱼环齿蛋白序列，以及具有vpgxg重复单元的蛋白组成，在不同底片(如动物内脏，玻璃，钢)及测试条件下具有优异的黏合性能，可用于各种软组织粘合、止血等，如动脉紧急粘合止血及肺、膀胱的密封。本产品制备及止血粘合操作简单，是较为理想的医用止血和密封产品，具有极好的发展前景。
附图说明
[0119]
图1示重组蛋白sds-page电泳图；其中，m示marker；右侧泳道示本发明提供的重组蛋白；
[0120]
图2示蛋白海绵扫描电镜图片；
[0121]
图3示蛋白海绵扫描电镜图片；
[0122]
图4示重组蛋白在硬底片上的粘合强度对延伸率曲线；
[0123]
图5示蛋白海绵在软底片上的粘合强度对延伸率曲线；
[0124]
图6示蛋白海绵在软底片上的断裂能和粘合强度；
[0125]
图7示蛋白海绵在组织上粘合、止血和封闭出血点的应用；其中，图7a示在猪心止血和封闭出血点的应用；图7b示蛋白海绵在猪肝脏止血和封闭出血点的应用；图7c示蛋白海绵对猪肾脏线性伤口的粘合和封闭出血的应用；图7d示蛋白海绵在动脉血管止血和封闭出血点的应用；图7e示蛋白海绵在膀胱泄露点封闭的应用；图7f示蛋白海绵在肺泄露点封闭的应用；
[0126]
图8示蛋白海绵在大鼠皮下可自行降解；
[0127]
图9示蛋白海绵在大鼠皮下黏附4天前后肌肉的he染色结果和真皮免疫组化的结果。
具体实施方式
[0128]
本发明公开了一种重组蛋白、含该重组蛋白的蛋白海绵制品和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0129]
本发明提供的重组蛋白、含该重组蛋白的蛋白海绵制品和应用中，所用原料或制剂均可由市场购得。
[0130]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0131]
实施例1重组蛋白的制备
[0132]
在本实施例中，发明人基于无规则卷曲组成的柔性链段(f)、鱿鱼环齿蛋白的晶态刚性区序列(l)、含(vpgxg)重复序列、人转化生长因子序列(tgfβ1/tgfβ2/tgfβ3)、人表皮生长因子结合区序列(e)设计了如下10种重组蛋白序列，具体序列信息参见表1：
[0133]
表1重组蛋白序列特征
[0134][0135]
具体序列信息见表2。
[0136]
表2
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149]
[0150]
[0151]
[0152]
[0153]
[0154]
[0155]
[0156]
[0157][0158]
1.1获得表达重组蛋白的菌株
[0159]
以上所述10种重组蛋白对应核苷酸序列由生工生物(上海)公司合成，并构建于pet25b表达质粒载体上，用于转化入大肠杆菌原核表达感受态blr(de3)中。具体的实施方案如下：将100ng的pet25b-a1(或a2～a10)质粒在冰浴环境中加入100μl的blr大肠杆菌感受态中(购自novagen公司)，并在冰浴环境中维持30min；然后将混合物转入42℃水浴中热激45s，随后冰浴2min。向混合物中加入lb培养基600μl，于37℃、180rpm震荡环境中处理1h。将混合物均匀涂布在含有氨苄青霉素钠(15μg/ml)抗生素的lb固体培养基上，37℃培养18h，即可获得可以稳定表达重组蛋白的菌株。挑取生长的菌落接种在10mllb培养基中，于37℃、220rpm震荡环境中培养，并在培养混合物od600值达到0.6时，用异丙基硫代半乳糖苷(iptg，终浓度0.5mmol/l)进行诱导培养，于16℃、220rpm震荡环境中培养过夜。诱导完成后，将菌液以4000rpm离心30min，弃去上清；用pbs重悬菌体沉淀，再次以4000rpm离心30min，弃去上清，得到含有目的蛋白的菌体沉淀。通过sds-page电泳和免疫印迹实验鉴定正确表达重组蛋白的菌株。
[0160]
1.2重组蛋白的表达
[0161]
本发明中，所述生物工程仿生蛋白(a1-a10)表达方式如下：
[0162]
(1)一级种子培养
[0163]
平板挑取e.coli bl21单菌落接入5ml lb液体培养基(氨苄青霉素钠浓度100μg/ml)中，37℃，220r/min摇床培养。
[0164]
(2)二级种子
[0165]
将一级种子液按2％(10ml)转接于50ml lb液体培养基(氨苄青霉素钠浓度100μg/ml)中，于37℃，220r/min培养12小时，以此菌液作为发酵种子液，记录种子的od。
[0166]
(3)发酵
[0167]
以1.67％的接种量(500ml)将二级种子液接种于发酵罐培养基，随后加入氨苄青霉素钠配置液(终浓度200μg/ml)，起始od600约为0.3-0.5。
[0168]
(4)前期富集。温度：37℃；转速300-700rpm；空气供给量30.0l/min；罐压0.05mpa；ph设定6.9，通过氨水调节。
[0169]
(5)补料培养。当发酵至～5h，初始糖耗尽，观察do变化，溶氧快速上升，使用蠕动泵进行葡萄糖补料，补料后控制溶氧＞20％。
[0170]
(6)快速生长阶段。自补糖开始至od600达到10之前。当od600达到10以后，葡萄糖补料维持稳定的速度，控制供氧水平。
[0171]
(7)诱导培养。od600达到30左右，停止补料约3min，待溶氧回升至55％，排出罐压并用注射器注入iptg溶液，使其终浓度为0.5mm，再恢复葡萄糖补料。补料速率仍维持至发酵结束前2h停止。
[0172]
1.3重组蛋白的纯化
[0173]
1.3.1纯化方案1
[0174]
(1)将表达后得到表达a1(或a2-a10)蛋白的菌体用平衡液a(50mm tris,500mm nacl,2mm edta,ph 7.4)进行重悬，终浓度为20％m/v，之后进行高压破碎，离心得到沉淀。
[0175]
(2)将沉淀混悬于提取液(100mm tris,500mm nacl,5mm edta,2％triton)中反复清洗沉淀四次。
[0176]
(3)将沉淀混悬于清洗液(100mm tris,ph 7.4)中清洗，重复三遍，清洗后得到的沉淀放入-80℃冰箱中保存。获得重组蛋白。
[0177]
1.3.2纯化方案2
[0178]
(1)将表达后得到的表达表达a9(或a10)蛋白的菌体用平衡液a(50mm tris,200mm nacl,2mm edta,ph 7.4)进行重悬，终浓度为10％m/v，之后进行高压破碎，离心得到沉淀。
[0179]
(2)将沉淀混悬于提取液(100mm tris,200mm nacl,5mm edta,5％triton)中反复清洗沉淀2次。
[0180]
(3)将沉淀混悬于清洗液(100mm tris,ph 7.4)中清洗，重复三遍，清洗后得到的沉淀放入-80℃冰箱中保存。
[0181]
(4)将沉淀溶于平衡液b(4m硫氰酸胍,200mm nacl,100mm nah2po4,10mm tris,ph 8.5)后16000g离心取上清并抽滤，将该蛋白溶液吸附到镍柱(ni6xff)上，再用洗脱液(4m硫氰酸胍,200mm nacl,100mm nah2po4,10mm tris,ph 4.5)洗脱，收集产物。
[0182]
(5)将洗脱得到的溶于硫氰酸胍的蛋白溶液装入透析袋中，并放入5％乙酸水溶液中透析，每4h换一次透析液直至溶液澄清透明。
[0183]
(6)将溶于5％乙酸水溶液的蛋白使用除盐柱(hiprep 26/50desalting)来除去乙酸组分。得到重组蛋白溶液。
[0184]
1.3.3纯化方案3
[0185]
(1)将表达后得到的表达a9(或a10)蛋白的菌体用平衡液a(50mm tris,200mm nacl,2mm edta,ph 7.4)进行重悬，终浓度为10％m/v，之后进行高压破碎，离心得到沉淀。
[0186]
(2)将沉淀混悬于提取液(100mm tris,200mm nacl,5mm edta,5％triton)中反复清洗沉淀2次。
[0187]
(3)将沉淀混悬于清洗液(100mm tris,ph 7.4)中清洗，重复三遍，清洗后得到的沉淀放入-80℃冰箱中保存。
[0188]
(4)将沉淀溶于平衡液b(4m硫氰酸胍,200mm nacl,100mm nah2po4,10mm tris,ph 8.5)后16000g离心取上清并抽滤，将该蛋白溶液吸附到镍柱(ni6xff)上，再用洗脱液洗脱，收集产物。
[0189]
(5)将洗脱得到的溶于硫氰酸胍的蛋白溶液装入透析袋中，并放入5％乙酸水溶液中透析，每4h换一次透析液直至溶液澄清透明。
[0190]
(6)将溶于5％乙酸水溶液的蛋白使用除盐柱(hiprep 26/50desalting)来除去乙酸组分。得到重组蛋白溶液。
[0191]
1.3.4纯化方案4
[0192]
(1)将表达后得到的表达a1(或a8)菌体用平衡液a(50mm tris,2m nacl,2mm edta,ph 7.4)进行重悬，终浓度为10％m/v，之后进行高压破碎，离心得到沉淀。
[0193]
(2)将沉淀混悬于提取液(50mm tris,2m nacl,5mm edta,5％triton)中反复清洗沉淀2次。
[0194]
(3)将沉淀混悬于清洗液(50mm tris,ph 7.4)中清洗，重复三遍，清洗后得到的沉淀放入-80℃冰箱中保存。
[0195]
(4)将沉淀溶于平衡液b(4m硫氰酸胍,2m nacl,50mm tris,ph 9.0)后16000g离心取上清并抽滤，将该蛋白溶液吸附到疏水层析柱上，再用洗脱液(4m硫氰酸胍,50mm tris,ph 9.0)线性洗脱，收集产物。
[0196]
(5)将洗脱得到的溶于硫氰酸胍的蛋白溶液装入透析袋中，并放入5％乙酸水溶液中透析，每4h换一次透析液直至溶液澄清透明。
[0197]
(6)将溶于5％乙酸水溶液的蛋白使用除盐柱(hiprep 26/50desalting)来除去乙酸组分。得到重组蛋白溶液。
[0198]
实施例2蛋白海绵的制备
[0199]
2.1蛋白海绵制备1
[0200]
将获得的重组蛋白a2溶液转入-80℃预冻6小时以上，转入冻干机中冻干至干品，密封低温干燥保存，制得a2蛋白海绵。
[0201]
2.2蛋白海绵制备2
[0202]
将获得的重组蛋白a7溶液与壳聚糖溶液按照摩尔量3：1的比例混合，转入-80℃预冻10小时以上，转入冻干机中冻干至干品，密封低温干燥保存，制得a7蛋白海绵。
[0203]
2.3蛋白海绵制备3
[0204]
将获得的重组蛋白a8溶液与人重组胶原蛋白溶液按照摩尔量5：1的比例混合，转入-80℃预冻4小时以上，转入冻干机中冻干至干品，密封低温干燥保存，制得a8蛋白海绵。
[0205]
2.4蛋白海绵制备4
[0206]
将获得的重组蛋白a6溶液与重组人生长激素溶液按照摩尔量300：1的比例混合，转入-80℃预冻6小时以上，转入冻干机中冻干至干品，密封低温干燥保存，制得a6蛋白海绵。
[0207]
2.5蛋白海绵制备5
[0208]
将获得的重组蛋白a10溶液与重组人生长激素溶液、胶原蛋白水溶液按照摩尔量300：1：10的比例混合，转入-80℃预冻6小时以上，转入冻干机中冻干至干品，密封低温干燥保存，制得a10蛋白海绵。
[0209]
实施例3：蛋白海绵表面形貌检测
[0210]
将a2蛋白海绵进行扫描电镜检测，结果见图2。将a6蛋白海绵进行扫描电镜检测，结果见图3。
[0211]
实施例4：蛋白海绵在硬底片的粘合效果
[0212]
将a2蛋白海绵5mg加入3mg水，涂抹到长度5cm、宽度5mm的钢片、玻璃、pvc及铝片上，粘合后静置4h，进行断裂强度测量，粘合强度对延伸率曲线如图4所示。结果显示其具有优良的硬底片粘合性能。
[0213]
实施例5：蛋白海绵在软底片的粘合效果
[0214]
将a2蛋白海绵进行压片操作，对长度5cm、宽度5mm猪的心脏、肾脏、肝脏、脾、胃、肺、肌肉、皮肤切片进行界面粘合，粘合面积为5mm
×
5mm。粘合后静置20min，进行断裂强度
测量，粘合强度对延伸率曲线如图5所示，粘合能如图6所示，结果显示其具有优良的软底片粘合效果。
[0215]
实施例6：蛋白海绵在组织伤口粘合和封闭泄露点的应用效果
[0216]
图7a示a2蛋白海绵在猪心止血和封闭出血点的应用。图7b示蛋白海绵在猪肝脏止血和封闭出血点的应用。图7c示蛋白海绵对猪肾脏线性伤口的粘合和封闭出血的应用图7d示蛋白海绵在动脉血管止血和封闭出血点的应用。图7e示蛋白海绵在膀胱泄露点封闭的应用。图7f示蛋白海绵在肺泄露点封闭的应用。蛋白海绵在各组织中具有良好的粘合效果，可快速止血和组织脏器渗漏。
[0217]
实施例7：蛋白海绵生物生物相容性评价
[0218]
将a2蛋白海绵通过手术置入大鼠皮下，并缝合创口。4天后可见创口处蛋白海绵完全降解(图8)。对蛋白海绵植入处的肌肉和真皮组织分别进行he染色和免疫组化染色(图9)，结果显示蛋白海绵植入处组织无明显炎症反应。
[0219]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。