一种同时检测4种烟草病毒的多重rt-pcr方法
技术领域
1.本发明属于烟草病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测4种烟草病毒的多重rt-pcr方法。


背景技术：

2.在我国，影响烟草作物的一些主要病毒包括烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,tmv)、辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,chivmv)、马铃薯y病毒(potato virus y,pvy)和烟草脉带花叶病毒(tobacco vein-banding mosaic virus,tvbmv)，严重影响烟草的产量和质量，造成了巨大的经济损失。
3.烟草花叶病毒是烟草花叶病毒属的模式成员，烟草花叶病毒感染许多植物物种，尤其是茄科植物，包括烟草、番茄、和胡椒。辣椒脉斑驳病毒(chivmv)、马铃薯y病毒(pvy)和烟草脉带花叶病毒(tvbmv)属于马铃薯y病毒属病毒的重要成员，主要由蚜虫以非持久性方式传播。
4.建立敏感、快速和经济的检测方法对于研究烟草作物中这些病毒的感染是必不可少的。分子生物学检测法从核酸水平检测病毒，因而灵敏度高、特异性强，能克服血清学及其他检测方法中的一些缺点，可以进行大批量的样本检测，是目前发展最快、最有发展前景的病毒检测技术。如rt-pcr、核酸杂交、双链rna(dsrna)电泳、指示分子nasba、环介导等温扩增及基因芯片技术等在病毒检测中的应用日趋广泛。目前国内多采用单重rt-pcr，即在1个反应管中只能检测1种病毒。如要检测复合感染样品中的几种病毒，则需进行数次rt-pcr反应，不仅操作步骤繁琐、易造成交叉污染，而且成本高、耗时长。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种同时检测4种烟草病毒的多重rt-pcr方法，可同时检测四种烟草病毒tmv、chivmv、pvy和tvbmv。该多重rt-pcr系统能够诊断与检测烟草病毒复合感染，可将其应用于烟草病毒感染的流行病学研究。
6.为了达到上述技术目的，本发明公开了一种同时检测4种烟草病毒的多重rt-pcr方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.s1：总rna的提取和逆转录：利用rna提取试剂盒从健康和感染病毒的烟草叶片中提取总rna，用反转录酶和随机引物通过两步反转录法，进行cdna链的合成，反应完成后所获得的cdna保存于-20℃备用，反应体系如下：
8.第一步：
9.10.第二步：
[0011][0012]
s2：引物设计：根据病毒的病毒外壳蛋白基因的核苷酸序列设计引物；
[0013]
s3：单pcr反应：
[0014]
反应体系如下：
[0015][0016][0017]
pcr程序：
[0018][0019]
用2％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物，用goldviewⅱ型核酸染色剂进行胶染，紫外光照射下拍照，通过与dl 1000dnamarkers作为分子量标记的比较，确定扩增片段的分子大小；
[0020]
s4：聚合酶链反应产物的克隆和测序：将rt-pcr扩增产物中各病毒对应的特异性条带切胶，用普通琼脂糖凝胶dna对试剂盒回收、纯化；回收的rt-pcr产物与载体按反应体
系连接，连接产物转化e.colidh5α感受态细胞，涂布于lb培养基平板上，培养，放置后进行蓝白斑筛选，用菌落pcr方法筛选含有插入物的克隆，筛选出的阳性单菌落接种于液体培养基中培养过夜；提取阳性克隆质粒进行测序；然后通过对ncbi核苷酸数据库的blast比对来验证这些序列；
[0021]
s5：多重聚合酶链反应的优化：将制备好的4个病毒质粒以及内参基因质粒对多重pcr扩增进行优化，优化因素包括5对引物比例、退火温度、退火时间、延伸时间、循环周期；使用多重聚合酶链反应检测试剂盒扩增了25.0μl多重聚合酶链反应，反应体系为：
[0022][0023]
引物(tmv(1.0μl)、tvbmv(0.5μl)、chivmv(2.0μl)、pvy(0.5μl)、ef-1α(1.0μl)
[0024]
pcr程序：
[0025][0026]
用2.5％的琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物，用goldviewⅱ型核酸染色剂进行胶染，在紫外光照射下拍照，通过与dl 1000dnamarkers作为分子量标记的比较，确定扩增片段的分子大小；
[0027]
s6：多重rt-pcr的稳定性检测：从混合病毒质粒溶液中省略了4种病毒的一种，加入引物对其进行扩增，来测试多重rt-pcr的稳定性；
[0028]
s7：多重聚合酶链反应的敏感性评价：以4种烟草病毒的等量质粒混合物为模板，经过10倍系列稀释，单个病毒序列通过简单聚合酶链反应和多重聚合酶链反应检测，初始质粒量设定为5pg；
[0029]
s8：多重聚合酶链反应的应用：
[0030]
采用优化后的多重rt-pcr反应体系检测自然感染样品的烟草病毒；利用多重rt-pcr单rt-pcr检测从田间采集的烟草样品，琼脂糖凝胶电泳后，pcr产物的条带清晰，比较多重rt-pcr单rt-pcr检测的结果是否一致；若从不同的田间样品中获得的病毒扩增子的大小没有明显的差异，表明多重rt-pcr方法可用于检测来自广泛田间区域的4种烟草病毒。
[0031]
优选的，所述s1中的病毒为烟草花叶病毒(tmv)、辣椒脉斑驳病毒(chivmv)、马铃薯y病毒(pvy)、烟草脉带花叶病毒(tvbmv)；rna提取试剂盒为使用takaraminibest universal rnaextraction kit提取试剂盒；反转录酶使用m-mlv；
[0032]
优选的，所述s2中设计各个病毒引物时需要选择具有相似退火温度、无非特异性扩增和各自扩增片段最佳大小的最佳引物对；每种目标病毒至少设计4对特异性引物；
[0033]
优选的，所述s4中rt-pcr产物的载体为pgd19-t,rt-pcr产物与载体的连接条件为16℃下连接2.5h；所述lb培养基平板涂布100mg/ml的amp，过夜培养温度为37℃；阳性克隆质粒的测序用m13正向和反向引物(通用引物)进行测序；
[0034]
优选的，所述s5中退火温度为44-65℃，温度增量为3℃；退火时间为10-60秒，时间增量为10秒；延伸时间为20-70秒，时间增量为10秒；循环周期为25-45个循环，循环周期增量为5个循环。
[0035]
本发明的有益效果是：
[0036]
针对于现有技术无法在一次反应中同时检测烟草花叶病毒(tmv)、辣椒脉斑驳病毒(chivmv)、马铃薯y病毒(pvy)、烟草脉带花叶病毒(tvbmv)4种病毒；本发明提出了同时检测4种烟草病毒的多重逆转录聚合酶链反应方法；该方法大大提高了检测效率同时也降低了检测成本；该方法已成功应用于病毒复合感染烟草样品的检测；逆转录聚合酶链反应具有敏感性、快速性和特异性的优点；本发明的多重逆转录聚合酶链反应在节省模板、时间和成本方面比单纯逆转录聚合酶链反应具有优势；检测烟草样品中的复合感染具有明显的优势，有助于研究这4种烟草病毒的分布、流行病学和病毒病的防治；该方法可作为检测烟草病毒的有效工具，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0037]
图1是引物的特异性检测电泳图；
[0038]
图2是多重rt-pcr退火温度优化电泳图；
[0039]
图3是多重rt-pcr退火时间优化电泳图；
[0040]
图4是多重rt-pcr延伸时间优化电泳图；
[0041]
图5是多重rt-pcr循环周期优化电泳图；
[0042]
图6是多重逆转录聚合酶链反应的敏感性评价结果电泳图；
[0043]
图7是多重rt-pcr体系的稳定性分析电泳图；
[0044]
图8是多重rt-pcr在烟草病毒检测中的应用电泳图。
具体实施方式
[0045]
为了清楚完整的对本发明的方案及效果进行描述，通过以下实施例进行详细说明。
[0046]
实施例1
[0047]
通过本发明s2步骤进行引物设计，本发明的所有引物都是从4个病毒的cp基因序列和一个内参基因序列经过的多重比对后设计的，单聚合酶链反应扩增产物的大小分别201bp(tmv)、252bp(pvy)、362bp(ef-1α)、306bp(tvbmv)和520bp(chivmv)的预期片段如图1所示。在单聚合酶链反应实验中，使用了4种病毒的cdna混合溶液作为模板，但每个反应中
只扩增出加入单个病毒引物对的特异条带。这证明了设计的引物的特异性，并表明这些引物对可以成功地纳入多重逆聚合酶链反应。
[0048]
实施例2
[0049]
将rt-pcr扩增产物中各病毒对应的特异性条带切胶，用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收、纯化。回收的rt-pcr产物与载体pgd19-t按反应体系在16℃2h 30min连接。取连接产物转化e.colidh5α感受态细胞，涂布于含amp(100mg/ml)的lb培养基平板上，37℃培养14-16h，进行蓝白斑筛选，用菌落pcr方法筛选含有插入物的克隆，将筛选出的阳性单菌落接种与含amp(100mg/ml)lb液体培养基中，37℃培养过夜。提取阳性克隆质粒送生工(sangon biotech)，用m13正向和反向引物(通用引物)进行测序。然后通过对ncbi核苷酸数据库的blast比对来验证这些序列；经过本发明s4步骤的验证，得出克隆的聚合酶链反应片段的序列与基因库中的病毒序列一致，证实了聚合酶链反应的有效性和特异性。
[0050]
实施例3
[0051]
多重聚合酶链反应的优化；
[0052]
为了确定多重聚合酶链反应的最佳组合，对多重体系进行了许多因素的优化，包括引物的比例、退火温度、退火时间、延伸时间和循环时间；利用4个病毒质粒，以混合质粒(10pg)为模板对多重逆转录聚合酶链反应进行优化；首先，对5对不同比例的引物进行了优化，最终确定了最佳引物量分别为1.0μl(tmv)、2.0μl(chivmv)、0.5μl(tvbmv)、0.5μl(pvy)、1.0μl(ef-1α)；将优化好的引物量混合物用于多重聚合酶链反应；退火温度从44℃到65℃，每个梯度的增量为3℃；退火温度为44-53℃时，tmv、chivmv、tvbmv、pvy和ef-1α靶片段亮度随着退火温度的升高而增加，当退火温度达到56℃时5个靶片段的亮度达到最佳，当退火温度高于56℃时，tmv、chivmv、pvy和ef-1α目标带亮度降低或消失；多重聚合酶链反应的最佳退火温度为56℃如图2所示；退火时间从10秒增加到60秒每个梯度的增量为10秒；5个目标片段的亮度随着退火时间的增加而增加，当退火时间达到50秒时，所有片段亮度达到最亮，而退火时间超过50秒后各个片段亮度有所降低，多重聚合酶链反应的最佳退火时间为50秒如图3所示；延伸时间从20秒到70秒，每个梯度的增量为10秒；当延伸时间从20秒增加到60秒时，所有片段的亮度随着时间的增加而增加，当时间大于60秒时，tmv目标带的亮度降低或消失；多重聚合酶链反应的最佳延伸时间是60秒如图4所示；循环周期以从25个循环增加到45个循环，每个梯度的增量为5个循环；当循环周期小于30个循环时，不能观察到tmv和pvy条带；当循环周期增加到大于40个循环时不会显著增加聚合酶链反应目标产物的产量，因此选择40次作为最佳循环周期如图5；总的来说，建立了最佳反应体系如下：
[0053][0054]
pcr程序：
[0055][0056]
实施例4
[0057]
多重逆转录聚合酶链反应的敏感性评价；
[0058]
利用优化好的多重pcr体系，以4种病毒的质粒等量混合物为模板，经过10倍系列稀释(100–
10-9
)，多重rt-pcr检测；当用单pcr检测每个病毒，经过10系列稀释(100–
10-9
)，仍能检测到每个病毒；多重pcr同时检测5个片段时，pvy的最高稀释度为10-3
，其余4个目标片段在稀释度为10-9
是也能检测到；初始质粒浓度为5pg，如图6所示。
[0059]
实施例5
[0060]
多重逆转录聚合酶链反应的稳定性检测；
[0061]
为了测试多重rt-pcr的稳定性，进行了分析，从混合病毒质粒(10pg)溶液中省略了4种病毒中的一种，其中从混合的质粒溶液中省略了4种病毒中的一种。结果表明，在除去任何一种病毒的质粒后，仍能检测到其他病毒，包括内参基因，如图7所示。
[0062]
实施例6
[0063]
多重rt-pcr在烟草病毒检测中的应用；
[0064]
采用多重rt-pcr反应体系检测大田自然感染样品的烟草病毒。利用多重rt-pcr和单rt-pcr检测了10份在田间采集的样品，如图8a所示，结果表明多重rt-pcr检测结果和单rt-pcr检测结果一致，表明多重rt-pcr方法可用于检测来自广泛田间区域的4种烟草病毒。使用优化的多重系统检测了大田32烟草样品，如图8b,c所示。