一种抗新冠病毒全人源广谱中和抗体zwc12及应用
技术领域
1.本发明公开了一种抗体，属于微生物学和免疫学领域。


背景技术：

2.新冠肺炎（covid-19）的病原体是新型冠状病毒-2（sars-cov-2），sars-cov-2属于冠状病毒科的β-冠状病毒属，是一类有囊膜的单股正链rna病毒，其基因组长度约为30 kb。基因组的前2/3是非结构基因orf1a/b，主要编码与病毒复制相关的酶（rna依赖的rna聚合酶，rdrp），后1/3依次编码四种结构蛋白：刺突蛋白（s），包膜蛋白（e），膜蛋白（m）和核衣壳蛋白（n）。其中，s蛋白含有病毒受体结合区，可与人细胞表面的血管紧张素转换酶2（ace2）受体结合，介导病毒吸附和进入细胞，是病毒入侵宿主易感细胞的关键蛋白。
3.病毒在传播过程中会不断地随机产生突变，其中有些突变会增强s蛋白与ace2受体的结合能力，加快病毒在人群中的传播，如k417n、n501y、e484k及p681r等。因而一些携带关键位点突变的病毒变异株表现出更强的感染能力或更强的免疫逃逸能力，使现有的公共卫生干预措施或疫苗的有效性降低，如被世界卫生组织（who）列为“关注变异株”（variants of concern, voc）的alpha 株(b.1.1.7)、beta株 (b.1.351)、gamma株 (p.1)、delta株 (b.1.617.2) 和omicron株 (b.1.1.529)等，这些变异株的出现对疫情防控提出了新的严峻挑战。
4.靶向病毒表面刺突蛋白（s蛋白）的单克隆中和抗体成为潜在的有效治疗新冠肺炎的手段，它通过与新冠病毒结合，抑制病毒的活性，保护细胞免受侵害。相比小分子药物和血浆疗法，单抗药物机理清晰，对靶点的选择性高、特异性强、副作用小。根据chineseantibody网站信息，已有25项靶向s蛋白的单抗进入临床研究，这些单抗对于应对野生型新型冠状病毒都是有效的。目前国外已有四种靶向s蛋白的单抗获得了美国fda的紧急使用授权，包括再生元的单抗regn10933和regn10987联用，礼来的ly-cov555和ly-cov016，vir公司的vir-7831和阿斯利康的azd7442；国内，腾盛华创公司的抗新冠病毒中和抗体brii-196和brii-198联合疗法于2021年12月8日获中国国家药品监督管理局（nmpa）应急批准。然而，随着sars-cov-2的不断进化和变异，研发中的大部分单抗对一种或多种变异株失去中和活性，其中，礼来研发的ly-cov555和ly-cov016、再生元研发的regn10933对beta株病毒失去中和活性, 且抗体药物ly-cov555-ly-cov016鸡尾酒疗法、regen-cov鸡尾酒疗法、azd7442鸡尾酒疗法对omicron株失去中和活性。为应对病毒免疫逃逸，研发具有保守中和表位的广谱单抗，包括研发广谱的中和单抗或两种高效中和单抗的组合物，具有重大临床应用价值。
5.当前，中和单抗可以通过杂交瘤技术，人源化转基因小鼠，噬菌体文库筛选以及单细胞pcr技术制备。单细胞pcr技术具有全人源，天然稳定性好等优点，被广泛用于新冠中和抗体的研发。单细胞pcr技术的原理是新型冠状病毒感染恢复者或新冠疫苗接种者体内存在对抗病毒的保护性单克隆抗体，编码抗体的基因位于人体外周血单个淋巴细胞内，通过流式细胞仪分选和单细胞pcr技术可以“钓取”此基因。然后通过基因工程手段，可实现体外
规模化制备此分子。
6.本发明拟采用流式分选-单细胞pcr技术从重组新型冠状病毒疫苗接种者的外周血中获得具有优异广谱中和活性的单抗，目的是提供针对covid-19具有良好保护效果的全人源单克隆治疗性抗体，以应对当前流行以及将来可能出现的变异株。


技术实现要素：

7.基于上述发明目的，本发明通过流式分选-单细胞pcr技术筛选到了一种抗sars-cov-2的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:1第26-33、51-58、97-114位氨基酸序列所示；轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:5第27-32、50-52、89-97位氨基酸序列所示。所述单克隆抗体在本技术中被命名为“zwc12”。
8.在一个优选的实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示。
9.在一个更为优选的实施方案中，所述抗体的重链恒定区的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no:7所示。
10.第二，本发明还提供了一种编码上述单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列由seq id no:2所示，编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列由seq id no:6所示。
11.在一个优选的实施方案中，编码所述抗体的重链恒定区的多核苷酸序列由seq id no:4所示，编码所述抗体的轻链恒定区的多核苷酸序列由seq id no:8所示。
12.第三，本发明还提供了一种表达上述编码单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸的功能元件，这种功能元件可以是传统的表达载体。
13.在一个优选的实施方案中，所述功能元件为线性表达框。
14.在另一个优选的实施方案中，所述功能元件为哺乳动物表达载体。
15.第四，本发明还提供了一种含有上述线性表达框的宿主细胞。
16.在一个优选的实施方案中，所述细胞为expi 293f细胞。
17.在另一个优选的实施方案中，所述细胞为cho-k1或cho-s细胞，本发明可以使用cho-k1或cho-s细胞构建稳转工程细胞株，实现产业化生产。
18.最后，本发明还提供了上述单克隆抗体在制备covid-19治疗或预防药物中的应用。
19.本发明提供的单克隆抗体通过流式分选-单细胞pcr技术筛选获得，具有独特的cdr分区，其抗原识别表位位于s1蛋白的rbd区。所述抗体与sars-cov-2野生型s-ecd的亲和力为1.749 nm, 与alpha株、beta株、gamma株、delta株、omicron株s-ecd的亲和力分别为0.926 nm、1.525 nm、1.281 nm、0.519 nm、3.176 nm。在假病毒中和实验中，对新冠病毒野生型假病毒的ec
50
是1.041 μg/ml，中和alpha株假病毒的ec
50
是0.124 μg/ml，中和beta株假病毒的ec
50
是0.162 μg/ml，中和gamma株假病毒的ec
50
是0.136 μg/ml，中和delta株假病毒的ec
50
是0.411 μg/ml，中和omicron株假病毒的ec
50
是0.093 μg/ml。在真病毒中和实验中，对新冠病毒野生型的ec
50
是25.01μg/ml，中和beta株的ec
50
是721.4 μg/ml，中和delta株的ec
50
是7.969 μg/ml，显示zwc12对目前的主要变异株具有广谱高效中和活性。本发明公
开的单克隆抗体具有高表达、全人源、稳定性好的特点，适合产业化生产，对于应对目前及将来可能出现的变异株导致的爆发流行具有重大临床应用价值。
附图说明
20.图1. 流式细胞仪单细胞分选图；图2. h、κ、λ三种链基因的巢式pcr扩增后毛细管电泳的鉴定图谱；图3. 单克隆抗体可变区序列的检索结果输出图；图4. 抗体表达上清与sars-cov-2的结合活性图；图5. 亲和层析纯化后的单抗sds-page检测图谱；图6. elisa检测单抗zwc12与s蛋白、s1蛋白、rbd蛋白的结合活性随浓度变化的曲线图；图7. elisa检测zwc12的交叉结合活性；图8. zwc12对新冠假病毒的广谱中和活性；图9. zwc12在细胞模型上对真病毒的ec
50
测定曲线图；图10. zwc12与wt株 s-ecd蛋白的结合动力学曲线图；图11. zwc12与alpha株s-ecd蛋白的结合动力学曲线图；图12. zwc12与beta 株s-ecd蛋白的结合动力学曲线图；图13. zwc12与gamma株s-ecd蛋白的结合动力学曲线图；图14. zwc12与delta株s-ecd蛋白的结合动力学曲线图；图15. zwc12与omicron株s-ecd蛋白的结合动力学曲线图。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
22.实施例1 人源抗sars-cov-2单克隆抗体的筛选和制备。
23.1. 血液样品的采集。
24.在获得知情同意书后，采集重组新型冠状病毒疫苗免疫接种者第二次免疫14天后血液样品20 ml，用于后续实验。
25.2. 流式分选记忆b细胞。
26.将采集的血样利用ficoll密度梯度离心法分离pbmc，过程如下：1）取新鲜抗凝全血，edta抗凝。
27.2）在离心管中加入与血液样本等体积的分离液，将血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。
28.3）配平，室温，水平转子800 g，加减速度3，离心30 min。
29.4）离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆层与分离液层之间是一层薄且较致密的白膜，即：单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）层。
30.5）将白膜层小心吸取到新的50 ml离心管中，用pbs稀释3倍，颠倒混匀。室温，水平
转子600 g，离心10 min，弃上清。重复洗涤2 次。
31.6）用pbs将淋巴细胞重悬备用。
32.7）将用来分选的细胞计数，按照下表推荐用量，先加入除anti-his tag和anti-flag tag抗体以外的所有抗体以及抗原，4℃孵育1 h，随后pbs+2% fbs清洗两次，再加入anti-his tag和anti-flag tag抗体，用pbs+2% fbs补足反应体系，4℃孵育1 h。
33.表1. 流式分选荧光抗体/抗原。
34.8）使用含2% fbs的pbs重复洗涤2-3次，1 ml fpbs重悬，用40 μm细胞筛去除细胞团，4℃避光保存供分选。
35.9）使用细胞分选仪（beckman mofloxdp）分选sars-cov-2 wt（新冠野生株genbank编号：nc_045512.2） s-ecd特异的单个记忆b细胞。分选策略为： cd3-/cd19
+
/ igg
+
/cd27
+
/ sars-cov-2 s-ecd
+
，如图1，图1中a中圈出淋巴细胞，图1中b中圈出去除粘连的细胞，图1中c中圈出cd3-/ cd19
+
的b细胞，图1中d中圈出igg
+
/cd27
+
的记忆b细胞，图1中e中圈出sars-cov-2 wt s-ecd
+
的记忆b细胞。直接将单个记忆b细胞分选至96孔板中，96孔板中每孔预先加入20 μl去rna酶水和20 u rna酶抑制剂，-80℃保存。
36.结果：分选获得253个sars-cov-2 s-ecd
+
的记忆b细胞。
37.3. 利用单细胞-pcr技术扩增全人源单抗可变区基因。
38.1）反转录pcr参考说明书（qiagen，210212），程序简单介绍如下：通过流式细胞仪分选了456个单细胞。向每个反应体系中同时加入以下全部的针对重链（heavy chain，h）、kappa轻链( kappa chain，κ)、lamda轻链(lamda chain，λ)各亚型的特异引物（引物序列见表2）。
39.引物：h：5
′ꢀ
l-vh 1、5
′ꢀ
l-vh 3、5
′ꢀ
l-vh 4/6，5
′
l-vh 5、huigg-const-anti、3
′ꢀ
cm ch1。
40.κ：5
′ꢀ
l vκ 1/2、5
′ꢀ
l vκ 3、5
′ꢀ
l vκ 4、3
′ꢀ
cκ 543
–
566。
41.λ：5
′ꢀ
l vλ 1、5
′ꢀ
l vλ 2、5
′ꢀ
l vλ 3、5
′ꢀ
l vλ 4/5、5
′ꢀ
l vλ 6、5
′ꢀ
l vλ 7、5
′ꢀ
l vλ 8、3
′ꢀ
cλ。
42.表2 反转录pcr引物
。
43.pcr反应体系中包含：5
×
缓冲液6 μl、dntp 1.2 μl、反转录酶（qiagen，210212）1.2 μl、引物如上、模板为单细胞，水补齐至30 μl。
44.pcr反应条件为：50℃反转录30 min，95℃预变性15 min，接着95℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环，最后72℃延伸10 min。
45.2）巢式pcr取反转录产物1μl为模板，进行巢式pcr反应扩增h、κ、λ的可变区，扩增重链可变区、κ轻链可变区和λ轻链可变区的引物如下表3所示。
46.表3. 巢式pcr引物
。
47.pcr反应体系中包含：10
×
缓冲液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶（全式金生物技术有限公司，ap141）0.5 μl、引物如上、模板为反转录产物1 μl、水补齐至50 μl。pcr反应条件为：95 ℃预变性10 min，接着，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40个循环，最后72 ℃延伸10 min。
48.3）毛细管电泳对巢式pcr扩增产物用qiagen dna fast analysis cartridge （qiagen，929008）进行毛细管电泳，一个单细胞中重链和轻链基因均扩增成功的克隆，被认为是配对成功的克隆。图2是对h、κ、λ三种链基因的巢式pcr扩增后毛细管电泳的鉴定图谱。
49.4）序列分析经pcr鉴定阳性的克隆进行dna序列测定和分析，登录imgt网站（http://www.imgt.org/imgt_vquest/analysis）进行可变区检索，为典型的抗体序列，符合预期。检索结果如图3所示，图3中a显示重链可变区的检索结果，v区同源性最高为92.36%，j区同源性最高为96.08%，d区使用读框1。图3中b显示轻链的检索结果，v区同源性最高为96.06%，j区同源性最高为89.47%。
50.4. 线性表达框表达抗体。
51.相比传统的表达载体构建方法，构建线性表达框更为快速。设计的线性表达框含有单抗在哺乳细胞内表达的所有元件，线性表达框从5’端依次含有cmv启动子序列（genbank登记号：x03922.1）、抗体前导肽的编码序列、抗体可变区（从单细胞中扩增获得）、抗体恒定区（生工生物合成，重链恒定区序列由seq id no:3所示，dna编码序列由seq id no:4所示，kappa型轻链恒定区序列由seq id no:7所示，dna编码序列由seq id no:8所示，
多聚a尾（genbank登记号：x03896.1 ）连接起来，将该线性形式的dna转染入细胞中进行抗体表达。
52.具体过程是通过体外重叠延伸pcr技术将各个pcr片段连接构建：1）扩增启动子-前导序列以pmd-cmvh和pmd-cmvl为模板，分别扩增重链和轻链的启动子-前导序列片段。扩增重链启动子-前导序列片段的pcr反应体系中包括：模板质粒pmd-cmvh 10 ng，10
×
缓冲液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶 0.5 μl、引物5'-cmv-up (与cmv启动子上游序列匹配) （5'
‑ꢀ
gatatacgcgttgacattgattattgac
ꢀ‑
3'）、引物3'
‑ꢀ
leader-h(hr)（5'
‑ꢀ
acactgaacaccttttaaaattag
ꢀ‑
3', 用于重链的融合, 信号肽序列的核苷酸序列：5'-atgaacttcgggctcagcttgattttccttgtcctaattttaaaa g gtgt c-3'），编码的氨基酸序列为mnfglsliflvlilkgv。扩增轻链启动子-前导序列片段的pcr反应体系中包括：模板质粒pmd-cmvl 10 ng，10
×
缓冲液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶 0.5 μl、引物5'-cmv-up（5'
‑ꢀ
gatatacgcgttgacattgattattgac
ꢀ‑
3'）、引物3'
‑ꢀ
leader-l(hr) (5'
‑ꢀ
cccacaggtaccagatacccatag
ꢀ‑
3')，用于轻链的融合，全长信号肽序列核苷酸序列为：5-atggattcacaggcccaggttcttatgttactgctgctatgggtatc tggtacctgtggg，氨基酸序列为mdsqaqvlmllllwvsgtcg，信号肽序列来源鼠源单抗可变区）、水补齐至50 μl。
53.pcr反应条件：95 ℃预变性10 min，接着95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。
54.2）扩增抗体恒定区-多聚a尾片段h链恒定区-多聚a尾片段pcr体系中包含：模板质粒pmd-tkh 10 ng、10
×
缓冲液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶 0.5 μl、引物5'-ch （5'-accaagggcccatcggtcttcccc-3'）、引物3'-tk-poly(a) （5'
‑ꢀ
aagtgtagcggtcacgctgcgcgtaacc
ꢀ‑
3'）、水补齐至50 μl。
55.κ链恒定区-多聚a尾片段pcr体系中包含：模板质粒pmd-tkκ 10 ng、10
×
缓冲液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶 0.5 μl、引物5'-cκ （5'
‑ꢀ
actgtggctgcaccatctgtcttc
ꢀ‑
3'）、引物3'-tk-poly(a) （5'
‑ꢀ
aagtgtagcggtcacgctgcgcgtaacc
ꢀ‑
3'）、水补齐至50 μl。
56.λ链恒定区-多聚a尾片段pcr体系中包含：模板质粒pmd-tkλ 10 ng、10
×
缓冲液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶 0.5 μl、引物5'-cλ （ctacgtcagcccaaggctgccccc）、引物3'-tk-poly(a) （5'
‑ꢀ
aagtgtagcggtcacgctgcgcgtaacc
ꢀ‑
3'）、水补齐至50 μl。
57.pcr反应条件为：95℃预变性10 min，接着95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。
58.3）扩增抗体可变区取巢式pcr产物1μl为模板，使用transstart taq dna polymerase并按照产品说明书，分别使用对应的混合引物对抗体的h链、κ链、λ链进行扩增，对应引物如下表4所示。
59.表4.pcr引物
。
60.※
单独划线部分用于与上游片段融合，划线黑体部分用于与下游片段的融合。
61.pcr反应体系中包含：10
×
缓冲液5μl、2.5mmdntp4μl、dna聚合酶（全式金生物技术有限公司，ap141）0.5μl、引物如上、模板为巢式pcr产物1μl、水补齐至50μl。
62.pcr反应条件为：95℃预变性4min，接着，95℃30s，57℃30s，72℃45s，40个循环，最后72℃延伸10min。
63.4）分别扩增重链和轻链的线性表达框pcr反应体系中包括：模板：纯化后的启动子-前导序列片段10ng、重链/轻链可变区片段10ng、重链/轻链恒定区-多聚a尾片段10ng，10
×
缓冲液5μl、12.5mmdntp4μl、dna聚合酶（全式金生物技术有限公司，ap151-13）0.5μl、引物5'-cmv-up（5'-gatatacgcgttgacattgattattgac-3'）和3'-tk-poly(a)（5'-aagtgtagcggtcacgctgcgcgtaacc-3'、水补齐至50μl。
64.pcr反应条件为：95℃预变性10min，接着95℃30s，60℃30s，72℃3min，30个循环，最后72℃延伸10min。
65.5）pcr产物回收纯化和定量pcr反应产物直接用omega公司回收试剂盒回收。dna定量：用nano（ge healthcare）对pcr回收产物进行定量。
66.6）细胞接种：将293t细胞以2
×
105/ml接种于96孔细胞培养板中，在含有5% co2的细胞温箱中，37℃培养过夜。
67.7）细胞共转染：次日，96孔板每孔加入20 μl无血清的opti-mem培养基中，构建成功的重链和轻链线性表达框pcr产物各0.1 μg，混匀后加入0.4 μl转染试剂turbofect（thermo scientific, r0531），共同孵育15-20 min后逐滴加至过夜培养的293t细胞培养孔中。在含有5% co2的细胞温箱中，37℃培养48 h后收细胞培养上清备用。
68.5. elisa筛选具有结合活性的抗体。
69.1) 包被：实验前一天96孔酶联板，取重组的sars-cov-2 wt s-ecd抗原及羊抗人igg（h&l）抗体（abcam，ab97221）用包被液稀释至浓度2 μg/ml，包被酶标板，每孔100 μl，4℃包被过夜。
70.2) 封闭：实验当天用洗板机（bio-tek，405_ls）洗3次，每孔加入100
ꢀµ
l封闭液，37℃ 孵育1小时。
71.3) 样品孵育：洗板3次，加入50
ꢀµ
l的转染细胞培养上清和50
ꢀµ
l稀释液，37℃ 孵育1小时。
72.4) 二抗孵育：洗板3次，将hpr标记的羊抗人igg二抗（abcam，ab97225）以1:10000用稀释液进行稀释，每孔100
ꢀµ
l加入到elisa板对应孔中，37℃ 孵育1小时。
73.5) 显色：洗板3次，每孔加入100
ꢀµ
l的tmb单组份显色液，显色6 min，室温避光，之后每孔加入50
ꢀµ
l终止液终止反应。
74.6) 用酶标仪上检测450-630nm处的od值，以未加待测样品的孔为阴性对照，od
450-630
＞阴性对照2.1倍以上的孔为阳性。
75.结果：将42株单抗进行表达，并对sars-cov-2 wt s-ecd的结合活性进行鉴定。结果显示有21株单抗与sars-cov-2 wt s-ecd能够特异性结合,如图4所示。
76.6.表达载体的构建和酶切鉴定。
77.对zwc12构建轻、重链重组表达质粒，进行单抗的表达制备。
78.1) pcdna3.4-zwc12-h表达质粒构建：以线性表达框为模板，扩增重链，切胶回收1.4kb大小的重链片段，表达载体pcdna3.4（thermofisher scientific，a14697）使用ecor i/bamh i酶切后回收，将重链和载体片段通过同源重组（nebuilder hifi dna assembly master mix, e2621l）方法进行连接，转化top10挑取克隆进行测序鉴定，构建成功重链的表达载体pcdna3.4-zwc12-h。
79.2) pcdna3.4-zwc12-κ表达质粒构建：以轻链表达框为模板，扩增轻链，胶回收约0.7kb的轻链片段，将轻链和载体片段通过同源重组方法连接，转化top10挑取克隆进行测序鉴定，构建成功轻链的表达载体pcdna3.4-zwc12-κ。
80.3) 单抗的瞬时表达和亲和层析纯化使用expi293 表达系统，取15 μg重链和15 μg轻链混合后转染expi 293f细胞，按照说明书进行操作（thermofisher scientific，a14635），5-6天后收获培养液，离心后上清
约30 ml，使用体积为5 ml的预装protein a亲和层析柱，上样前使用20 mm pbs平衡，待电导显示到基线后进样，上样结束后，使用20 mm pbs洗涤色谱柱至基线平稳，使用0.1 m ph 3.0的甘氨酸缓冲液洗脱目的蛋白，待od
280
近基线后，停止收集，使用至少3个柱体积的20 mm的pbs洗涤色谱柱，至基线平稳后，用20%的乙醇洗涤色谱柱。亲和层析纯化后的单抗sds-page检测结果见图5 ：泳道1，2，3分别为单抗zwc12的柱前、柱后以及洗脱液的条带，蛋白样品可被巯基乙醇还原为50 kda、25 kda 大小的两个片段，分别对应抗体重链和轻链的理论分子量，符合预期，泳道m为分子量标记（分子量从大到小依次为：250，130，100，70，55，55，35，25，15，10 kda）。
81.实施例2. 抗体zwc12识别表位分析。
82.1) 包被：实验前一天96孔酶联板，取重组的sars-cov-2 wt（新冠野生株genbank编号：nc_045512.2）s-ecd抗原、s1抗原、rbd抗原和s2抗原用包被液稀释至浓度2 μg/ml，包被酶标板，每孔100 μl，4℃包被过夜。
83.2) 封闭：实验当天用洗板机（bio-tek，405_ls）洗3次，每孔加入100
ꢀµ
l封闭液，37℃ 孵育1小时。
84.3) 样品孵育：洗板3次，除首孔外，每孔加入100 μl稀释液，将抗体稀释至首孔1 μg/ml，4倍梯度稀释，100 μl/孔，每个抗体设置三个复孔，在37℃孵育1 h。
85.4) 二抗孵育：洗板3次，将hpr标记的羊抗人igg二抗（abcam，ab97225）以1:10000用稀释液进行稀释，每孔100
ꢀµ
l加入到elisa板对应孔中，37℃ 孵育1小时。
86.5) 显色：洗板3次，每孔加入100
ꢀµ
l的tmb单组份显色液，显色6 min，室温避光，之后每孔加入50
ꢀµ
l终止液终止反应。
87.6) 用酶标仪上检测450-630nm处的od值，以未加待测样品的孔为阴性对照，od
450-630
＞阴性对照2.1倍以上的孔为阳性。
88.结果：检测zwc12与不同抗原表位的结合活性，具体见图6， zwc12与sars-cov-2 wt的s-ecd、s1和rbd蛋白均特异结合，呈现剂量反应关系。结果表明，单抗zwc12识别的表位位于s1蛋白的rbd区。
89.单抗zwc12的序列分析结果如下：重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:1第26-33、51-58、97-114位氨基酸序列所示，编码重链可变区的多核苷酸序列由seq id no:2所示；轻链可变区的氨基酸序列如seq id no: 5所示，轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:5第27-32、50-52、89-97位氨基酸序列所示，编码轻链可变区的多核苷酸序列由seq id no:6所示。
90.实施例3：抗体zwc12的交叉结合活性鉴定。
91.对zwc12与sars-cov-2的受关注变异株（variants of concern）s蛋白的交叉结合活性进行鉴定，方法同上，结果如图7所示。zwc12与alpha株、beta株、gamma株、delta株、omicron株的s-ecd蛋白均特异结合，且呈现剂量反应关系。结果表明，单抗zwc12能够交叉结合alpha株、beta株、gamma株、delta株、omicron株的s-ecd蛋白。
92.实施例4. 抗体zwc12的假病毒中和活性鉴定。
93.1) 将纯化单抗用培养基 dmem+10% fbs 自初始浓度（zwc12单抗初始浓度3.7 μg/ml）, 3倍系列稀释，加入 96 孔培养板，设置3个复孔，体积50 μl/孔；随即每孔加入50 μ
hbs-ep+缓冲液，1500 g离心1 min，重复4次，将脱盐柱置于新的收集管，将100 μl蛋白溶液加入柱中，1500 g离心2 min，收集滤下液体，使用nanovue测定蛋白浓度。
108.3) 打开biocore t200机器，将进液管a插入hbs-ep+缓冲液瓶中，放入proteina芯片，运行prime程序。
109.4) 样品准备：用hbs-ep+缓冲液将配体（抗体）稀释至0.5 μg/ml，将分析物（抗原）稀释至100 nm、50 nm、25 nm、12.5 nm、6.25 nm、3.125 nm、1.5625 nm、0.78125 nm。
110.5) 使用多循环检测方法进行样品检测：打开run/wizard中的kinetics/affinity，flow path选择2-1或4-3，chip type选择protein a，选择ligand capture，点击下一步；在setup界面中，在startup下的solution中填写hbs-ep+，number of cycles选择3，点击下一步；在injection parameters界面：ligand名称填写抗体名称，contact time为60 s，flow rate为10 μl/min，stabilization period为0 s；sample的contact time为120 s，flow rate为30 μl/min，dissociation time为900 s；regeneration中solution为glycine ph 1.5，contact time为30 s，flow rate为30 μl/min，stabilization period为30 s；点击下一步；在sample界面中填写分析物的信息：s-ecd分子量为134 kda，浓度为0 nm、1.5625 nm、3.125 nm、6.25 nm、12.5 nm、25 nm、50 nm、100 nm、1.5625 nm，选择1.5625 nm作为重复，点击下一步；在system preparations界面中设置分析温度和样品舱温度为25℃，点击下一步；在rack position界面中，选择sample and reagent rack1，设置样品位置，按照样品位置和用量进行样品准备和放置，点击下一步；确认运行缓冲液体积达到实验所需，点击start，对实验方法和结果进行保存，程序开始自动运行，运行时间5小时。
111.6)结果分析：打开数据分析软件biacore t200 evaluation software，打开运行的结果文件：点击kinetics/affinity，选择surface bound；在select curves界面中选择0 nm和至少5个合适浓度，点击下一步；在select data界面中点击kinetics；在fit kinetics界面中，method选择1:1 binding，点击fit进行数据拟合；记录结合动力学数据ka、kd、kd等。表5依据report显示的分析数据，记录单抗zwc12与不同抗原的结合动力学数据ka、kd、kd。图10-15分别是zwc12与wt、alpha、beta、gamma、delta、omicron株的s-ecd的亲和力常数测定图，其kd依次为1.749 nm、0.926 nm、1.525 nm、1.281 nm、0.519 nm及3.176 nm。结果显示该中和抗体与sars-cov-2的野生型及目前主要变异株的s抗原均具有很好的亲和力，使其发展成新冠肺炎特效药成为可能。
112.表5 单抗zwc12与不同抗原的结合动力学数据。