1.本发明属于肿瘤免疫治疗领域和生物技术领域，具体提供了一种抗体及其在抗肿瘤中的应用。


背景技术：

2.肿瘤因其具有难治愈性、高死亡率、低愈后临床表现，而成为威胁人类健康的最严重的疾病之一，为此研究人员先后尝试了多种肿瘤治疗手段和技术，包括手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、基因治疗等等，但是截至目前仍未找到行之有效的治疗手段。随着生物技术和免疫学研究的深入，肿瘤免疫治疗和抗肿瘤抗体受到业内的重视，自上世纪80年代以来，全球范围内已有上百种抗体被批准用于肿瘤治疗，目前每年提交申请进行临床试验的抗体更是多达数千种。这是由于抗体治疗具有较高的靶向性和选择性，且治疗效果明显，不但可有效抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，还能够免于对正常组织或细胞造成不利影响，保证患者的正常生活状态，因而在白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等造血系统肿瘤和胃癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌等实体肿瘤中都有广泛应用。
3.受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ror1)是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，rtks)家族成员之一，与生长因子受体的酪氨酸激酶结构域具有很高的同源性。人ror1分子由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞外区包括一个免疫球蛋白样结构域(immunoglobulin-like domain，ig-like)、两个富含半胱氨酸卷曲的结构域(cysteine-rich domain or frizzled，crd or fzd)和一个kringle(kng)结构域；胞内区含有一个酪氨酸激酶结构域(tyrosine kinase domain，tkd)、两个富含丝氨酸/苏氨酸结构域(serine/threonines-rich domain，ser/thrd)和一个富含脯氨酸富集结构域(proline-rich domain，prd)。大量研究显示ror1在促进肿瘤的生长和转移、诱导肿瘤细胞耐药和抑制细胞凋亡等方面起到了关键性的作用，尤其是ror1正常组织中低水平表达，而高表达于多种恶性肿瘤或组织中，如慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌等等。ror1在肿瘤组织中具有高度识别性，基于这种特性，使得ror1成为一种新型的肿瘤特异性标志物和抗肿瘤靶点。
4.针对ror1靶点，已经开发出了多种肿瘤免疫疗法，包括：(1)单克隆抗体，是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，该类抗体灵敏度高，特异性强，交叉反应少，制备成本低，是目前应用最为广泛的抗体药物。目前研究人员针对ror1靶点开发了多种单克隆抗体，如jp2021522162a、wo2021202863a1、ep3842072a1、cn112384533a等公开了相应的抗ror1单克隆抗体；(2)双特异性抗体，该类抗体含有2种特异性抗原结合位点，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁应，激发具有导向性的免疫反应，进一步增强抗体治疗的靶向性，ep2984107a1公开了针对ror1和cd3靶点的双特异性抗体，可有效抵抗白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤；(3)嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)t细胞，car由两个主要的结构域组成：胞外域
和胞内信号转导区，胞外域位于细胞外部与环境相互作用，胞内信号转导区位于细胞内，将细胞外的信号传递到细胞内部，这种经过基因工程改造的t细胞能够特异性识别肿瘤细胞，而且能够利用激活的t细胞发挥强大的抗肿瘤作用，目前这种疗法在血液肿瘤上取得了较大成功，已有多款商品被批准上市。能够用于构建嵌合抗原受体的抗肿瘤靶点相当广泛，ror1也已报道被用于构建car，如wo2021202863a1、wo2020014366a1等公开了靶向ror1的car结构；(4)抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，adc)，是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中，这种组合药物既具有生物分子的靶向性，又具有化学药较强的肿瘤杀伤能力，为了降低毒副作用，往往要求生物分子具有较高的特异性，对于连接生物分子和化学药物的连接子也需要进行精确设计，以便充分发挥协同效应。针对ror1的adc药物也已经被报道，如peyman等(peyman b，mozafar m，ali hakakian.anti-ror1 scfv-endog as a novel anti-cancer therapeutic drug，apjcp，2017，19(1)：97-102)将抗ror1 scfv与免疫毒素结合，可快速导致肿瘤细胞凋亡；(5)抗体衍射物，除单克隆抗体、双特性抗体等具有经典结构的抗体之外，研究人员还针对ror1靶点开发出诸如单链片段可变抗体(scfv)、fab抗体片段等抗体衍生物，均取得了一定的治疗效果。
5.虽然以ror1为靶点的肿瘤免疫疗法已被广泛报道，但是上述药物或产品仍面临靶向性不强，易形成脱靶效益，排斥反应强烈，肿瘤免疫逃逸现象时有发生，抗肿瘤活性尤其是对于实体肿瘤的治疗活性有待强化等技术问题。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明中提供了一种新型的抗ror1抗体，具体的该抗体包含重链可变区、和轻链可变区；所述重链可变区包含分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；所述轻链可变区包含分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
7.进一步的，该抗体所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。
8.进一步的，所述抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。
9.提供了一种编码上述抗体的核酸，以及包括所述核酸的重组表达载体和重组表达转化体。
10.提供了一种上述抗体的制备方法，包括如下步骤：培养如权利要求6所述的重组表达转化体，从培养物中获得所述抗ror1抗体。
11.提供了一种上述抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤为ror1阳性造血系统恶性肿瘤或实体瘤，具体包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性粒细胞白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性粒细胞白血病(cml)、骨髓瘤等等。
12.有益效果
13.本发明中所提供的抗ror1抗体，为单克隆抗体，其成分单一，纯度高，序列结构明显，易于通过生物发酵方式实现大规模生产，生产成本低，适用于临床应用。本发明中所述抗体与目标抗原具有较强的亲和力，能够有效识别目标抗原，特异性高，靶向性强，可有效防止脱靶效益的发生。本发明所提供的抗体稳定性好，可耐受高温和极端ph环境，有利于后
期制剂开发和临床使用。本发明中所述抗体能够明显抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，且对多种肿瘤细胞均有杀伤效果，在动物实验中，能够显著抑制肿瘤生长，促进免疫因子分泌，充分调动机体免疫系统，发挥协同抗肿瘤效果。本发明提供的抗体还具有较高的稳定性和溶解能力，有利于体内抗肿瘤作用的发挥，对于实体肿瘤作用明显。
附图说明
14.图1：抗ror1抗体稳定性检测
15.图2：抗ror1抗体对血液肿瘤细胞的杀伤效应
16.图3：抗ror1抗体对卵巢癌细胞的杀伤效应
17.图4：抗ror1抗体对k562小鼠模型肿瘤体积的影响
18.图5：抗ror1抗体对k562小鼠模型ifn-γ水平
19.图6：抗ror1抗体对skov3小鼠模型肿瘤体积的影响
20.图7：抗ror1抗体对skov3小鼠模型vegf水平
具体实施方式
21.实施例1抗ror1抗体的筛选
22.本发明中通过融合杂交瘤技术筛选并获得靶向ror1的鼠单克隆抗体。
23.1.1实验小鼠免疫
24.使用重组人ror1蛋白免疫小鼠，具体步骤包括：(1)选择6-8周龄balb/c雌性小鼠共20只，正常饲养3天，使其适应实验环境；(2)将ror1蛋白与等体积弗氏完全佐剂进行乳化，共振30min，使其充分混合，皮下多点注射于小鼠体内；(3)首次免疫两周后，进行小鼠效价检测，选择效价高的免疫小鼠进行腹腔注射冲击免疫；(4)将ror1蛋白与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，共振30min，使其充分混合，腹腔注射小鼠；(5)重复(4)步骤3次，强化免疫应激反应。
25.1.2细胞融合
26.选取血液中抗ror1抗体效价高的小鼠，脱颈处死，在无菌工作台上取小鼠脾脏，使用无菌pbs清洗3次；使用注射器向脾脏中注射dmem培养液，反复冲洗收获脾脏细胞；将获得的脾脏细胞，1000rpm 4℃离心5min，然后使用dmem培养液重悬细胞；将获得的脾脏细胞与对数生长期的小鼠骨髓瘤细sp2/0按1:1比例混合，使用peg催化法进行细胞融合；细胞融合后，将细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃培养箱进行培养。
27.1.3阳性克隆的筛选和保藏
28.细胞融合10天后，取细胞上清，elisa法检测阳性克隆，将获得的阳性克隆杂交瘤细胞扩大培养，然后收集细胞保藏于-80℃冰箱中，进行后续实验。
29.1.4抗ror1抗体筛选
30.复苏和培养阳性杂交瘤细胞，以2
×
106个细胞/ml将杂交瘤细胞接种到基于透析的生物反应器中，每周收获一次含有抗体的上清液。借助fplc使用protein a(购自pharmacia公司)纯化小鼠单克隆抗体。通过bca试剂盒或a280吸光值来确定抗体浓度，抗体纯度通过sec(尺寸排阻色谱)确定，并通过sds(十二烷基硫酸钠)凝胶电泳和考马斯亮蓝染色来检查纯度，经检测抗体纯度符合后续实验要求。
31.使用fortebio生物大分子相互作用仪(购自美国艾瑞生物公司)，检测抗ror1抗体与人ror1的亲和力。本发明经过多轮筛选，获得了多个备选抗体，其中与目标抗原亲和力较高的部分抗体亲和力数据结果如表1所示。
32.表1抗ror1抗体与人ror1亲和力
33.抗ror1抗体亲和力(nm)结合常数(1/ms)解离常数(1/s)#122.52e-083.31e+048.35e-04#221.05e-088.82e+049.23e-04#282.20e-092.43e+055.34e-04#521.95e-093.65e+057.12e-04#661.51e-098.73e+041.32e-04#836.76e-095.43e+043.67e-04#1181.88e-084.08e+047.69e-04
34.除考察抗体与目标抗原的亲和力之外，本发明中还进一步考察了所述抗体的稳定性，包括热稳定性和ph值稳定性，这是由于一方面对体外环境而言，抗体药物存储和运输过程中容易失活，导致治疗失败甚至引起严重不良反应，因此抗体分子的稳定性高低对于其临床应用具有关键影响；另一方面对体内环境而言，抗体分子需要作用于肿瘤细胞进而发挥抗肿瘤效果，但是肿瘤微环境与正常组织微环境差异较大，如呈现出缺氧、低ph状态等等，因此选择稳定性高等抗体分子，对于抗体在体内发挥抗肿瘤生物活性也是有益的。
35.本发明中对抗ror1抗体的热稳定性和ph稳定性进行了检测。首先，将待筛选抗体分别在4℃、25℃、37℃、50℃、70℃的环境中孵育2小时，再将其与人ror1重组蛋白4℃共孵育2小时，然后加入10μl anti-flag磁珠4℃再孵育1小时，tbst洗涤磁珠3次后，sds-page和考马斯亮蓝染色检测免疫共沉淀结果。其次，待筛选抗体分别在ph2、ph5、ph7、ph10、ph12的环境中孵育2小时，再将其与人ror1重组蛋白4℃共孵育2小时，然后加入10μl anti-flag磁珠4℃再孵育1小时，tbst洗涤磁珠3次后，sds-page和考马斯亮蓝染色检测免疫共沉淀结果。
36.综合亲和力检测和稳定性检测结果，本发明中选择亲和力和稳定性均较强的#28号抗体作为候选抗体，进行后续实验。该抗体的稳定性结果如图1所示，其中热稳定性如图1a所示，在4℃、25℃、37℃、42℃处理下，该抗体能够与目标抗原保持较高的结合能力，在60℃处理下其结合能力有所下降；ph值稳定性如图1b所示，在ph2、ph5、ph7、ph10、ph12处理下，均可与目标抗原高效结合，并且在低ph值下展现出了更强的结合活性，说明在抗体的总体稳定性较强，有利于临床使用。
37.1.5抗ror1抗体序列测定
38.培养#28号抗体对于的杂交瘤细胞株，采用trizol法提取rna，反转录制备cdna，用设计合成的小鼠igg特异引物组测序。结果显示，该抗体重链可变区包含分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；所述轻链可变区包含分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。
39.实施例2抗ror1抗体的制备
40.根据测序结果，设计适当引物序列，通过重叠延伸pcr反应分别获得抗体的重链和
轻链可变区核苷酸序列。通过基因重组方式，将抗体轻重链核苷酸序列构建分别到真核表达载体pcdna3.4-g418和pcdna3.4-dhfr中。利用电转染方法将上述真核表达载体导入cho细胞中，在5l生物反应器中采用分批补料方式培养cho细胞，每天检测细胞密度和活力，当细胞活力降至75％以下或培养周期达到14天，离心收集细胞培养上清，采用hplc方法测定细胞上清抗体表达水平。采用protein a(购自pharmacia公司)亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化所述抗体，并用sds-page电泳证明，所得产物纯度大于90％，然后将亲和层析的产物再次经过分子筛层析，获得纯度大于98％的样品。
41.实施例3抗ror1抗体对肿瘤细胞的杀伤效应
42.据报道，ror1抗体对多种血液肿瘤和实体肿瘤具有抑制作用，为了验证本发明所述抗体的生理活性，选用多种血液瘤细胞系和实体瘤细胞进行考察。
43.3.1抗ror1抗体对血液肿瘤细胞的杀伤效应
44.多种造血系统肿瘤中均表达ror1，本发明中选用nb4(急性髓系白血病细胞系)、k562(慢性髓系白血病细胞系)、raji(淋巴瘤细胞系)和u266(多发性骨髓瘤细胞系)作为研究对象，通过cck-8法检测杀伤作用。具体方法包括：
45.(1)将细胞接种于96孔板，细胞接种量为2
×
104/孔，每组设置3个复孔；
46.(2)细胞生长至对数生长期后，更换新鲜培养基；
47.(3)每孔加入10μg/ml的抗ror1抗体，37℃细胞培养箱孵育12、24、36小时；
48.(4)每孔加入cck-8(dojindo，日本)试剂(20μl/孔)，37℃细胞培养箱孵育2小时后，450nm处测定吸光度；
49.(5)根据cck-8试剂盒(dojindo，日本)说明书，统计活细胞数目并推算杀伤效率：杀伤率＝[((t+e)-t&e)/t]
×
100％
[0050]
其中，t代表活的靶细胞数量；e代表活的效应细胞数量；则t+e等于活的靶细胞和效应细胞的总数；t&e代表靶细胞经效应细胞杀伤后的活细胞数量。
[0051]
如图2所示，本发明所提供的抗体对于多种血液肿瘤细胞均有抑制作用，其中对于nb4、k562、raji、u266等四种血液肿瘤细胞均展示出了较强的杀伤效应，其中对于raji的杀伤作用不仅作用较强，且需要时间较短，处理36小时和24小时，细胞杀伤率变化不大；而对于其他三种细胞，随着处理时间的延长，杀伤效果持续提高。上述结果说明，本发明所提供的抗体对于白血病、淋巴瘤、骨髓瘤细胞具有较强的抑制作用，该抗体可用于治疗包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤在内的多种造血系统恶性肿瘤。
[0052]
3.2抗ror1抗体对卵巢癌细胞的杀伤效应
[0053]
本发明中选用caov3、es2、skov3和hey等卵巢癌细胞系作为实验对象，研究本发明中所提供的抗体对卵巢癌的杀伤作用。仍采用cck-8法检测和计算肿瘤细胞杀伤率，实验步骤参照3.1节进行。
[0054]
如图3所示，本发明所提供的抗ror1抗体对于多种卵巢癌细胞也展现出了不同的杀伤效果，其中对于skov3的杀伤效果最强，作用36小时后可以达到超过60％的杀伤率，而对于caov3、es2和hey的杀伤作用次之。
[0055]
实施例4抗ror1抗体对血液肿瘤的体内抑制效应
[0056]
为了进一步验证本发明中所提供的抗体的抗肿瘤效果，本节中主要研究本发明所提供的抗ror1抗体在小鼠体内的抗肿瘤作用，选择采用k562细胞构建动物模型。
[0057]
4.1动物模型制备与治疗
[0058]
采用c57bl/6小鼠，6-8周龄，均为雌性，体重18-23g。实验动物在spf级恒温恒湿房间内饲养5天，适应环境；在37℃5％co2环境中培养k562细胞，每2-3天进行传代培养，调整细胞至对数生长期；离心收集细胞，无菌生理盐水重悬细胞，调整浓度为1
×
107个/ml，剃去c57bl/6小鼠右侧腹部体毛，将100μl细胞悬液注射入小鼠右前侧胁部皮下。每日观测肿瘤生长情况，当肿瘤直径达到3mm和5mm之间时进行后续实验。
[0059]
造模成功后，将实验动物随机分为两组，每周注射抗ror1抗体(10mg/kg)和等体积的生理盐水，每周检测肿瘤体积，治疗4周后尾静脉取血，留存血液样本，处死小鼠。
[0060]
4.2肿瘤体积
[0061]
实验动物给药后每周检测肿瘤体积变化，使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，肿瘤体积(l x w2)/2估算，其中l是长度或最长尺寸，w是肿瘤的宽度。
[0062]
结果如图4所示，使用抗ror1抗体治疗，可有效抑制白血病细胞在小鼠体内的生长速度，明显降低肿瘤体积，治疗4周后，治疗组肿瘤体积约为对照组的50％以上，说明本发明所提供的抗ror1抗体可限制抑制血液肿瘤的体内增殖过程。
[0063]
4.3抗ror1抗体对血液肿瘤模型中炎症因子表达的影响
[0064]
血液肿瘤的发生发展受多种因素影响，抗体发挥抗肿瘤作用也与细胞因子分泌、免疫细胞活化、缺氧环境形成和肿瘤微环境变化等多种因素相关，其中在抗体治疗过程中，免疫因子的表达水平发生变化，可介导一系列免疫机制，发挥协同抗肿瘤作用。因此，本发明中为初步探讨抗ror1抗体的作用机制，检测了治疗后小鼠血浆中ifn-γ水平变化。
[0065]
治疗4周后尾静脉取血，离心收集血浆，使用elisa法检测血浆中的ifn-γ浓度，结果如图5所示。使用抗ror1抗体治疗后，可显著提高血液中ifn-γ表达水平，ifn-γ属于ⅱ型干扰素中的一种，具有较高的抗病毒活性和广泛的免疫调节作用，提示本发明中的抗ror1抗体能够通过激活ifn-γ表达，诱导机体内多种免疫途径，进而发挥协同抗肿瘤作用。但需要说明的是，该抗体在刺激ifn-γ分泌上的能力，似乎弱于亲和力更强的候选抗体，在前期实验中，使用亲和力更强抗体，可进一步提高ifn-γ表达水平，我们推测这可能与血液肿瘤所处的生理环境相关，血液肿瘤处于体液环境中，这种环境中存在天然的缓冲体系，使其内环境变化较小，故抗体的稳定性强在这一环境下似乎不具有更多的优势。尽管如此，本发明中所提供的抗体相对于阴性对照组，仍能够大幅度提高ifn-γ表达水平，有利于抗肿瘤治疗。
[0066]
实施例5抗ror1抗体对卵巢癌的体内抑制效应
[0067]
为了进一步验证本发明中所提供的抗体的抗肿瘤效果，本节中主要研究本发明所提供的抗ror1抗体在小鼠体内的抗肿瘤作用，选择采用skov3细胞构建动物模型。
[0068]
5.1动物模型制备与治疗
[0069]
采用c57bl/6小鼠，6-8周龄，均为雌性，体重18-23g。实验动物在spf级恒温恒湿房间内饲养5天，适应环境；在37℃5％co2环境中培养skov3细胞，每2-3天进行传代培养，调整细胞至对数生长期；离心收集细胞，无菌生理盐水重悬细胞，调整浓度为1
×
107个/ml，剃去c57bl/6小鼠右侧腹部体毛，将100μl细胞悬液注射入小鼠右前侧胁部皮下。每日观测肿瘤生长情况，当肿瘤直径达到3mm和5mm之间时进行后续实验。
[0070]
造模成功后，将实验动物随机分为两组，每周注射抗ror1抗体(10mg/kg)和等体积
的生理盐水，每周检测肿瘤体积，治疗4周后尾静脉取血，留存血液样本，处死小鼠。
[0071]
5.2肿瘤体积
[0072]
实验动物给药后每周检测肿瘤体积变化，使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，肿瘤体积(l x w2)/2估算，其中l是长度或最长尺寸，w是肿瘤的宽度。
[0073]
结果如图6所示，使用抗ror1抗体治疗，可有效抑制卵巢癌细胞在小鼠体内的生长速度，明显降低肿瘤体积，治疗4周后，治疗组肿瘤体积约为对照组的50％；在早期实验中，我们尝试使用亲和力更强的抗体治疗实体瘤动物，然而在抑制肿瘤生长方面，其效果略逊色于本发明所提供的抗体，这可能是由于实体肿瘤的微环境变化更加复杂，使得稳定性稍差的抗体难以充分发挥其生物活性。
[0074]
5.3抗ror1抗体对血液肿瘤模型中炎症因子表达的影响
[0075]
与存在于体液环境中的造血系统肿瘤不同，实体肿瘤往往不能随血液流动，因此养料的供给对肿瘤细胞的生长至关重要，据报道在实体肿瘤的发生过程中常常伴随着血管的异常增殖，在这一过程中血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，vegf)发挥了重要作用。因此，本发明中为初步探讨抗ror1抗体的作用机制，检测了治疗后小鼠血浆中vegf水平变化。
[0076]
治疗4周后尾静脉取血，离心收集血浆，使用elisa法检测血浆中的vegf浓度，结果如图7所示。使用抗ror1抗体治疗后，可显著抑制vegf的表达，使得肿瘤组织难以通过血液循环系统获得足够的营养成分，从而限制其生长，而且这一结果明显强于早期实验中使用的其他抗体，说明本发明所提供的稳定性强，且亲和力高的抗体，更适用于实体肿瘤的治疗。
[0077]
虽然本发明参考其示例性的实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。