β
淀粉样蛋白的单克隆抗体、和使用该抗体的
β
淀粉样蛋白相关肽的测定方法
技术领域
1.本发明涉及β淀粉样蛋白的单克隆抗体、和使用该抗体的β淀粉样蛋白相关肽的测定方法。


背景技术：

2.阿尔茨海默氏病(alzheimer's disease；ad)是痴呆症的主要原因，占所有痴呆症的50-60％。2001年全世界的痴呆症患者数达到2400万人以上，预测在2030年将达到8200万人。阿尔茨海默氏病的发病被认为与aβ密切相关。β淀粉样蛋白(aβ)由作为单次跨膜蛋白的由770个氨基酸残基组成的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein；app)通过β分泌酶和γ分泌酶的蛋白降解而产生(参照图1)。由于伴随aβ的纤维化的聚集而出现老年斑时，由此引发tau蛋白聚集蓄积在神经细胞内，发生神经功能障碍、神经细胞死亡。作为其结果，认为会出现认知能力的极度降低。一直以来，知晓aβ主要由40mer(aβ1-40)和42mer(aβ1-42)组成，也清楚会转移到脑脊液(csf)中。另外，还启示出可能也会转移到血液中。进而近些年，已知csf中也存在与aβ1-40和aβ1-42长度不同的aβ样的肽。
3.对于aβ而言，在最近的研究中，本发明人等报道了：作为aβ相关肽(aβ样肽)之一的app669-711与aβ1-42之比有望成为血液生物标志物(非专利文献1，专利文献1：国际公开wo2015/178398)。这些aβ和aβ相关肽通过在免疫沉淀法(ip)之后执行质谱分析(maldi-tof ms)而进行定量。
4.进而，本发明人等在专利文献2：国际公开wo2017/047529中公开了，利用数学方法组合了选自由aβ和aβ相关肽(aβ样肽)的3个比、即aβ1-39/aβ1-42、aβ1-40/aβ1-42、和app669-711/aβ1-42组成的组中的2种以上的比的数值有望成为血液生物标志物。这些aβ和aβ相关肽通过在免疫沉淀法(ip)之后执行质谱分析(maldi-tof ms)而进行定量。
5.从而，本发明人等使用质谱分析(maldi-tof ms)发现：作为aβ相关肽之一的app669-711与aβ1-42之比有望成为血液生物标志物候补。此外，本发明人等报道了：组合了该app669-711/aβ1-42比与aβ1-40/aβ1-42比的复合生物标志物(composite biomarker)在日本和澳大利亚的多个待检体中显示出能够高精度地推测脑内淀粉样蛋白蓄积，其为具有可靠性和通用性的生物标志物(非专利文献2)。
6.作为包含app669-711的aβ相关肽等生物标志物的分析技术，质谱分析(maldi-tof ms)是有用的。另一方面，作为其它分析技术，夹心elisa是被广泛用作临床检测法的测定法，且该方法廉价，因此能成为有用的分析技术。
7.目前，能分析血浆中的aβ1-40、aβ1-42的elisa试剂盒可以从各制造商(和光纯药、ibl等)购买获得。
8.专利文献3：日本特开2005-170951号公报中，公开了识别β淀粉样蛋白的n端部(aβ1-16)的单克隆抗体ban-52a和ban-50a、特异性识别β淀粉样蛋白的c端部的单克隆抗体ba-27a、bs-85和bc-05a，公开了aβ1-40、aβ1-42特异性的夹心eia。
9.专利文献4：日本特开2014-208678号公报中，公开了特异性识别aβ11-x的抗体，公开了针对aβ11-40的夹心elisa、针对aβ11-x的蛋白质印迹。
10.迄今为止，用于血液生物标志物(aβ和aβ相关肽)的免疫沉淀-质谱分析(immunoprecipitation-mass spectrometry；ip-ms)中，使用抗aβ抗体克隆6e10实施免疫沉淀(ip)(非专利文献1、2、3，专利文献5、6、7、8)。克隆6e10对aβ的亲和性强，自古以来被许多研究者用于免疫测定法、ip-ms(非专利文献4、5、6)。实际上，与使用了其它市售克隆的ip-ms的数据相比，6e10得到了检测aβ相关肽的灵敏度最高的数据，可以说是优异的抗体克隆。该6e10是通过将杂交瘤细胞移植到小鼠的腹腔内并在腹水中产生抗体而获得的。然后，用蛋白g将所产生的抗体纯化，使该纯化品结合到磁珠上而制作抗体固定化磁珠，将该抗体固定化磁珠用于ip。
11.专利文献5：wo 2015/111430(专利文献6，美国公开us 2016/0334420)公开了app裂解肽的测定方法。
12.专利文献7：日本特开2017-20980号公报(专利文献8：美国公开us2017/0016910)公开了多肽的质谱分析方法。
13.现有技术文献
14.专利文献
15.专利文献1：国际公开wo2015/178398
16.专利文献2：国际公开wo2017/047529
17.专利文献3：日本特开2005-170951号公报
18.专利文献4：日本特开2014-208678号公报
19.专利文献5：国际公开wo2015/111430
20.专利文献6：美国公开us 2016/0334420
21.专利文献7：日本特开2017-20980号公报
22.专利文献8：美国公开us 2017/0016910
23.非专利文献
24.非专利文献1：kaneko n,nakamura a,washimi y,kato t,sakurai t,arahata y,bundo m,takeda a,niida s,ito k,toba k,tanaka k,yanagisawa k.:novel plasma biomarker surrogating cerebral amyloid deposition.proc jpn acad ser b phys biol sci.2014；90(9):353-364.
25.非专利文献2：nakamura a,kaneko n,villemagne vl,kato t,doecke j,dore v,fowler c,li qx,martins r,rowe c,tomita t,matsuzaki k,ishii k,ishii k,arahata y,iwamoto s,ito k,tanaka k,masters cl,yanagisawa k.:high performance plasma amyloid-βbiomarkers for alzheimer's disease.nature.2018；554(7691):249-254.
26.非专利文献3：关于6e10：
27.https://www.alzforum.org/antibodies/v-amyloid-1-16-or-app-6e10-0
28.非专利文献4：kim ks,wen gy,bancher c,chen cm,sapienza vj,hong h,wisniewski hm.:detection and quantitation of amyloid b-peptide with 2 monoclonal antibodies.neurosci res commun.1990；7(2):113-122.
29.非专利文献5：ramakrishnan m,kandimalla kk,wengenack tm,howell kg,
poduslo jf.:surface plasmon resonance binding kinetics of alzheimer's disease amyloid beta peptide-capturing and plaque-binding monoclonal antibodies.biochemistry.2009；48(43):10405-15.
30.非专利文献6：wang r,sweeney d,gandy se,sisodia ss:the profile of soluble amyloid beta protein in cultured cell media.detection and quantification of amyloid beta protein and variants by immunoprecipitation-mass spectrometry.j biol chem.1996；13；271(50):31894-902.
31.非专利文献7：关于腹水法：http://www.asas.or.jp/jsaae#old/news/3.html；(项目：“harvest mouse and technomouse-单克隆抗体产生在体外
‑”
)
32.非专利文献8：关于腹水法：http://www.asas.or.jp/jsaae#old/news/3.html：(项目：抗体的形状-腹水(ascites fluid)一项)


技术实现要素：

33.发明要解决的问题
34.能够与6e10同样高灵敏度地检测aβ相关肽的其它抗aβ抗体尚属未知。
35.另外，通常从动物伦理的观点出发，如6e10那样利用腹水法产生单克隆抗体的方法越来越难以实施(非专利文献7)。另外，腹水法中，也存在混入宿主来源的igg的可能性(非专利文献8)。
36.基于这样的现状，期望出现能够与6e10同样高灵敏度地检测aβ相关肽的、可替代6e10的新颖的抗aβ抗体。另外，也期望不仅利用腹水法获得可替代6e10的新颖的抗aβ抗体，而且由培养上清液也可获得。
37.因此，本发明的目的在于提供能够检测aβ相关肽的新颖的抗aβ抗体。另外，本发明的目的在于提供不仅利用腹水法产生、而且由培养上清液也可产生的、能够检测aβ相关肽的新颖的抗aβ抗体。
38.进而，本发明的目的在于提供：以免疫化学方式利用上述新颖的抗aβ抗体测定生物试样中的aβ相关肽的方法，即，基于使用了能够检测aβ相关肽的新颖的抗aβ抗体的免疫沉淀(immunoprecipitation；ip)的aβ相关肽的测定方法、基于免疫沉淀-质谱分析(immunoprecipitation-mass spectrometry；ip-ms)的aβ相关肽的测定方法、和基于连续免疫沉淀-质谱分析(continuous immunoprecipitation-mass spectrometry；cip-ms)的aβ相关肽的测定方法。
39.进而，本发明的目的在于提供用于测定aβ相关肽的试剂盒，所述试剂盒包含含有上述新颖的抗aβ抗体的抗体固定化载体。
40.进而，本发明的目的在于提供能够识别aβ3-8肽(序列号1)的新颖的抗aβ抗体。
41.用于解决问题的方案
42.本发明人进行了深入研究，结果为了制作识别aβ相关肽的抗体，对小鼠免疫klh结合合成肽daefrhdsgyevhhqkc(序列号10：该序列相当于cys(c)结合到aβ1-16的c末端lys(k)上的序列)，通过细胞融合和elisa筛选，获得产生识别aβ相关肽的抗体的6个杂交瘤克隆。使用该6个克隆的抗体并通过ip-ms进行评价，获得了通过ip-ms能够检测血浆中aβ相关肽的新颖的1个抗体克隆。也可以构成用于测定血浆中aβ相关肽的ip-ms的试剂盒，所述试
剂盒包含该新颖的抗aβ抗体作为构成成分。
43.本发明包括以下的发明。
44.本发明的第1方式为识别aβ相关肽的单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤以保藏编号nite bp-02998保藏在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心。
45.另外，为一种杂交瘤，其以保藏编号nite bp-02998保藏在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心。
46.本发明的第2方式为一种测定生物试样中的aβ相关肽的方法，所述方法包括如下工序：
47.反应工序，使含有生物试样的液体与抗体固定化载体接触，从而使前述生物试样中的aβ相关肽与前述抗体固定化载体结合，所述抗体固定化载体包含载体及结合在前述载体上的上述单克隆抗体；
48.清洗工序，对结合了前述aβ相关肽的前述抗体固定化载体进行清洗；
49.洗脱工序，使用酸性溶液使前述aβ相关肽从前述抗体固定化载体解离、洗脱，得到纯化溶液；以及
50.检测工序，通过质谱分析对前述纯化溶液中的前述aβ相关肽进行检测。
51.本发明的第3方式为一种测定生物试样中的aβ相关肽的方法，所述方法包括如下工序：
52.第1反应工序，使含有生物试样的液体与第1抗体固定化载体接触，从而使前述生物试样中的aβ相关肽与前述第1抗体固定化载体结合，所述第1抗体固定化载体包含载体及结合在前述载体上的上述单克隆抗体；
53.第1清洗工序，对结合了前述aβ相关肽的前述第1抗体固定化载体进行清洗；
54.第1洗脱工序，使用酸性溶液使前述aβ相关肽从前述第1抗体固定化载体解离、洗脱，得到第1洗脱液；
55.中性化工序，通过在前述第1洗脱液中加入中性缓冲液而使前述洗脱液的ph为中性，得到ph呈中性的第1纯化溶液；
56.第2反应工序，使前述第1纯化溶液与第2抗体固定化载体接触，从而使前述第1纯化溶液中的前述aβ相关肽与前述第2抗体固定化载体结合，所述第2抗体固定化载体包含载体及结合在前述载体上的上述抗体；
57.第2清洗工序，对结合了前述aβ相关肽的前述第2抗体固定化载体进行清洗；
58.第2洗脱工序，使用酸性溶液使前述aβ相关肽从前述第2抗体固定化载体解离、洗脱，得到第2纯化溶液；以及
59.检测工序，通过质谱分析对前述第2纯化溶液中的前述aβ相关肽进行检测。
60.本发明的第4方式为一种测定生物试样中的aβ相关肽的方法，所述方法包括如下工序：
61.反应工序，使含有生物试样的液体与上述的单克隆抗体接触，从而使前述生物试样中的aβ相关肽与前述单克隆抗体结合；以及
62.检测工序，利用选自由夹心型免疫测定法、直接elisa、间接elisa、竞争elisa、蛋白质印迹、免疫组织化学染色、流式细胞术、免疫沉淀、亲和色谱、和免疫细胞染色组成的组中的方法检测结合在前述单克隆抗体上的前述aβ相关肽。
63.本发明的第5方式为一种识别aβ3-8肽的单克隆抗体。
64.另外，为一种识别aβ3-8肽的单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤以保藏编号nite bp-02998保藏在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心。
65.发明的效果
66.根据本发明，可提供以保藏编号nite bp-02998保藏的杂交瘤细胞克隆16-10e，可提供由杂交瘤细胞克隆16-10e产生的识别aβ相关肽的新颖的抗aβ抗体。
67.根据本发明，可提供以免疫化学方式利用上述新颖的抗aβ抗体克隆16-10e测定生物试样中的aβ相关肽的方法，即，通过免疫沉淀(immunoprecipitation；ip)测定aβ相关肽的方法、通过免疫沉淀-质谱分析(immunoprecipitation-mass spectrometry；ip-ms)测定aβ相关肽的方法、通过连续免疫沉淀-质谱分析(continuous immunoprecipitation-mass spectrometry；cip-ms)测定aβ相关肽的方法。
68.进而，根据本发明，可提供用于测定aβ相关肽的试剂盒，所述试剂盒包含含有抗aβ抗体克隆16-10e的抗体固定化载体。
69.进而，根据本发明，可提供识别aβ3-8肽(序列号1)的新颖的单克隆抗体。
附图说明
70.图1是示意性示出基于淀粉样前体蛋白(app)降解的、aβ肽的生成路径的图。
71.图2是示出：在实施例1中，通过硫酸铵沉淀和蛋白g将杂交瘤(克隆5-1d、8-1f)的培养上清液纯化，通过sds-page进行确认的结果的图。
72.图3是示出：在实施例1中，通过硫酸铵沉淀和蛋白g将杂交瘤(克隆12-8h、14-12e)的培养上清液纯化，通过sds-page进行确认的结果的图。
73.图4是示出：在实施例1中，通过硫酸铵沉淀和蛋白g将杂交瘤(克隆16-10e、40-10g)的培养上清液纯化，通过sds-page进行确认的结果的图。
74.图5示出在实施例2中使用阳性对照6e10及获得的6个克隆进行ip-ms的结果。横轴为m/z、纵轴为离子的相对强度。各ip-ms谱图自上方起为关于抗aβ抗体克隆6e10、5-1d、8-1f、12-8h、14-12e、16-10e、和40-10g的结果。
75.图6是在实施例3-1中在第一ip中改变16-10e的抗体固定化磁珠量时的ip-ms谱图。横轴为m/z、纵轴为离子的相对强度。各ip-ms谱图自上方起为关于抗aβ抗体克隆6e10(对照，第一ip磁珠量：291μg)、16-10e(第一ip磁珠量：1164、582、291、145μg)的结果。使用的抗体磁珠量如图6中的表所述，表示磁珠的重量。
76.图7是在实施例3-2中在第二ip中改变16-10e的抗体固定化磁珠量时的ip-ms谱图。横轴为m/z、纵轴为离子的相对强度。各ip-ms谱图自上方起为关于抗aβ抗体克隆6e10(对照，第二ip磁珠量：73μg)、16-10e(第二ip磁珠量：145、73、36、18μg)的结果。使用的抗体磁珠量如图7中的表所述，表示磁珠的重量。
77.图8是示出实施例4中使用了克隆16-10e和6e10的抗体的aβ3-8肽的直接elisa的结果的图。横轴表示aβ3-8浓度(nmol/ml)，纵轴表示利用酶标仪测得的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(absorbance)。
具体实施方式
78.[识别aβ相关肽的单克隆抗体]
[0079]
本发明的识别aβ相关肽的单克隆抗体是由杂交瘤(克隆16-10e)产生的单克隆抗体，所述杂交瘤(克隆16-10e)以保藏编号nite bp-02998保藏在国家技术评估学会(national institute of technology and evaluation；nite)，专利微生物保藏中心(nite patent microorganisms depositary；npmd)。
[0080]
保藏编号：nite bp-02998
[0081]
保藏日：2019年6月27日
[0082]
保藏机构：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心
[0083]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
292-0818日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室
[0084]
上述以保藏编号nite bp-02998保藏的杂交瘤(克隆16-10e)具有识别aβ相关肽的单克隆抗体的产生能力。
[0085]
为了制作本发明的识别aβ相关肽的单克隆抗体，对小鼠免疫klh(匙孔血蓝蛋白，keyhole limpet hemocyanin)结合合成肽daefrhdsgyevhhqkc(序列号10)，通过细胞融合和elisa筛选，获得了产生识别aβ相关肽的单克隆抗体的杂交瘤(克隆16-10e)。更详细的抗体制作在实施例中进行说明。如实施例中所述，本发明的识别aβ相关肽的单克隆抗体不仅可以利用腹水法获得，而且也可以由融合细胞的培养上清液获得。
[0086]
上述的序列daefrhdsgyevhhqkc(序列号10)相当于cys(c)结合到aβ1-16的c末端lys(k)上的序列。
[0087]
另外，本发明的识别aβ相关肽的单克隆抗体是识别aβ3-8肽efrhds(序列号1)本身的单克隆抗体。
[0088]
公知的克隆6e10被用作识别以aβ3-8作为表位的aβ相关肽的抗体，但如实施例项目中所示，与aβ3-8肽本身不具有反应性。由此可知，本发明的抗aβ抗体克隆16-10e和克隆6e10对aβ3-8肽efrhds(序列号1)的反应性不同，本发明的识别aβ相关肽的单克隆抗体为新颖的抗体。
[0089]
[aβ相关肽]
[0090]
aβ相关肽是由全长770残基的氨基酸组成的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein；app)受到β分泌酶和γ分泌酶等蛋白酶的蛋白降解而产生的，可以包括各种分子种类(参照图1)。如前所述，本发明的抗aβ抗体克隆16-10e识别aβ3-8肽efrhds(序列号1)，因此在本发明中，意图使前述抗aβ抗体所识别的aβ相关肽优选至少包含aβ的第3-8位的肽序列efrhds(序列号1)。
[0091]
作为前述aβ相关肽，没有限定，可以示例出以下的肽。app663-711、app664-711、app666-709，app666-711、app669-709(序列号7)、app669-710(序列号8)、app669-711(序列号9)、app669-713，app671-711、app672-708(序列号2)、app672-709(序列号3)、app672-710(序列号4)、app672-711(序列号5)、app672-713(序列号6)、app674-711、app674-679(序列号1)。
[0092]
app674-679(aβ3-8)(序列号1)
[0093]
efrhds
[0094]
app672-708(aβ1-37)(序列号2)
[0095]
daefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvg
[0096]
app672-709(aβ1-38)(序列号3)：
[0097]
daefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvgg
[0098]
app672-710(aβ1-39)(序列号4)
[0099]
daefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggv
[0100]
app672-711(aβ1-40)(序列号5)：
[0101]
daefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvv
[0102]
app672-713(aβ1-42)(序列号6)：
[0103]
daefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvvia
[0104]
app669-709(aβ(-3-38))(序列号7)：
[0105]
vkmdaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvgg
[0106]
app669-710(aβ(-3-39))(序列号8)
[0107]
vkmdaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggv
[0108]
app669-711(aβ(-3-40))(序列号9)：
[0109]
vkmdaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvv
[0110]
如上所述，app674-679和aβ3-8表示相同的肽。同样地，app672-709与aβ1-38表示相同的肽，app672-711与aβ1-40表示相同的肽，app672-713与aβ1-42表示相同的肽，app669-709与aβ(-3-38)表示相同的肽，app669-710与aβ(-3-39)表示相同的肽，app669-711与aβ(-3-40)表示相同的肽。其它也是同样。
[0111]
[抗体固定化载体]
[0112]
本发明的抗体固定化载体包含载体及结合在前述载体上的识别上述本发明的aβ相关肽的单克隆抗体。
[0113]
作为所使用的载体的原材料，可以使用公知的物质，例如可以选自由琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)、葡聚糖、硅胶、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、(甲基)丙烯酸系聚合物、氟树脂、金属络合物树脂、玻璃、金属、和磁性体组成的组。
[0114]
载体的形状可以是平面状、球状和其它形状。例如，载体可以是构成用于目标物质的分离和/或浓缩的芯片、微珠或微型装置内的流路壁者。在载体表面具有键合性官能团。
[0115]
前述抗体可以通过间隔物与前述载体结合。作为间隔物，可以使用公知者，例如可列举出高分子聚合物。作为高分子聚合物的例子，可列举出亚烷基和氧亚烷基。
[0116]
另外，例如，间隔物可以是选自由聚氧烷基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙烯烷基醚、多糖、生物降解性高分子、和脂质聚合物组成的组中的有机高分子聚合物。聚氧烷基化多元醇和聚乙烯烷基醚中的烷基例如碳数可以为1～6、优选为1～3。作为多糖的例子，可列举出葡聚糖、粘多糖、和甲壳素类。作为粘多糖的例子，可列举出透明质酸。作为生物降解性高分子的例子，可列举出pla(聚乳酸；poly(lactic acid))和plga(聚乳酸-乙醇酸；poly(lactic-glycolic acid))。
[0117]
间隔物可以包含上述示例的1种，也可以包含任选自上述示例中的2种以上。另外，间隔物可以为直链，也可以为支链。
[0118]
本发明中所使用的抗体固定化载体可以如下制备：通过载体和抗体以及在使用间
隔物时间隔物物质的各要素所具有的共价键合性官能团、离子键合性官能团和氢键键合性官能团等键合性官能团，根据官能团的种类并利用公知的方法使上述各物质结合，从而制备。本发明的实施方式中，基于连续免疫沉淀-质谱分析(cip-ms)测定aβ相关肽的情况下，第1抗体固定化载体和第2抗体固定化载体可以相同，也可以不同。
[0119]
[aβ相关肽的测定方法]
[0120]
(基于免疫沉淀-质谱分析(immunoprecipitation-mass spectrometry；ip-ms)的aβ相关肽的测定方法)
[0121]
本发明的第2方式为一种测定生物试样中的aβ相关肽的方法，所述方法包括如下工序：
[0122]
反应工序，使含有生物试样的液体与抗体固定化载体接触，从而使前述生物试样中的aβ相关肽与前述抗体固定化载体结合，所述抗体固定化载体包含载体及结合在前述载体上的上述单克隆抗体；
[0123]
清洗工序，对结合了前述aβ相关肽的前述抗体固定化载体进行清洗；
[0124]
洗脱工序，使用酸性溶液使前述aβ相关肽从前述抗体固定化载体解离、洗脱，得到纯化溶液；以及
[0125]
检测工序，通过质谱分析对前述纯化溶液中的前述aβ相关肽进行检测。
[0126]
(基于连续免疫沉淀-质谱分析(continuous immunoprecipitation-mass spectrometry；cip-ms)的aβ相关肽的测定方法)
[0127]
另外，本发明的第3方式为一种测定生物试样中的aβ相关肽的方法，所述方法包括如下工序：
[0128]
第1反应工序，使含有生物试样的液体与第1抗体固定化载体接触，从而使前述生物试样中的aβ相关肽与前述第1抗体固定化载体结合，所述第1抗体固定化载体包含载体及结合在前述载体上的上述单克隆抗体；
[0129]
第1清洗工序，对结合了前述aβ相关肽的前述第1抗体固定化载体进行清洗；
[0130]
第1洗脱工序，使用酸性溶液使前述aβ相关肽从前述第1抗体固定化载体解离、洗脱，得到第1洗脱液；
[0131]
中性化工序，通过在前述第1洗脱液中加入中性缓冲液而使前述洗脱液的ph为中性，得到ph呈中性的第1纯化溶液；
[0132]
第2反应工序，使前述第1纯化溶液与第2抗体固定化载体接触，从而使前述第1纯化溶液中的前述aβ相关肽与前述第2抗体固定化载体结合，所述第2抗体固定化载体包含载体及结合在前述载体上的上述抗体；
[0133]
第2清洗工序，对结合了前述aβ相关肽的前述第2抗体固定化载体进行清洗；
[0134]
第2洗脱工序，使用酸性溶液使前述aβ相关肽从前述第2抗体固定化载体解离、洗脱，得到第2纯化溶液；以及
[0135]
检测工序，通过质谱分析对前述第2纯化溶液中的前述aβ相关肽进行检测。
[0136]
如此，连续免疫沉淀-质谱分析(cip-ms)中，经过中性化工序，然后，重复进行结合反应工序、清洗工序、及解离和洗脱工序。以下，对连续免疫沉淀-质谱分析(cip-ms)进行详述，但在该说明中也包括关于免疫沉淀-质谱分析(ip-ms)的说明。即，在免疫沉淀-质谱分析(ip-ms)的情况下，可以将第1洗脱工序的第1洗脱液供于质谱分析。
[0137]
(第1结合反应工序)
[0138]
首先，使含有生物试样的液体(通常包含生物试样和结合溶液)与前述第1抗体固定化载体接触，从而使前述第1抗体固定化载体与前述生物试样中包含的靶aβ相关肽结合。
[0139]
生物试样包括血液、脑脊液(csf)、尿液、身体分泌液、唾液、和痰等体液；及粪便。血液试样包括全血、血浆和血清等。血液试样可以通过对从个体采集的全血进行适宜处理而制备。作为在由所采集的全血制备血液试样时所进行的处理，没有特别限定，可以进行临床学可接受的所有处理。例如可以进行离心分离等。另外，供于结合工序的血液试样可以是在其制备工序的中途阶段或制备工序之后的阶段适宜进行冷冻等低温下保存者。需要说明的是，本发明中生物试样被废弃而不返回至作为生物试样来源的个体。将血液试样作为对象试样的情况下，相对于固体、脑脊液的情况而言试样采集的侵袭性低，而且是用于一般的体检、综合性健康检查等中的各种疾病筛查的对象试样，故而优选。
[0140]
作为结合溶液，可以使用通常的免疫沉淀法(ip)中使用的结合溶液。结合溶液组成中优选包含表面活性剂，以抑制非特异性吸附。作为前述表面活性剂，优选：不易引起抗体等蛋白质的变性、能够在清洗工序中容易地去除、即使混入后续的质谱分析中也不会抑制靶aβ相关肽的信号的中性的表面活性剂。具体而言，可列举出亲水性部分具有麦芽糖的中性表面活性剂、亲水性部分具有海藻糖的中性表面活性剂、和亲水性部分具有葡萄糖的中性表面活性剂等。对于这些中性表面活性剂的疏水性部，没有特别限定，优选碳数为7～14程度的烷基。结合溶液优选包含选自这些中的表面活性剂的中性缓冲液。
[0141]
作为亲水性部分具有麦芽糖的中性表面活性剂，可列举出：
[0142]
正癸基-β-d-麦芽糖苷(dm)[cmc：0.087％]
[0143]
正十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)[cmc：0.009％]
[0144]
正壬基-β-d-硫代麦芽糖苷(ntm)[cmc：0.116％]
[0145]
等。cmc为临界胶束浓度。
[0146]
作为亲水性部分具有海藻糖的中性表面活性剂，可列举出：
[0147]
α-d-吡喃葡萄糖基-α-d-吡喃葡萄糖苷单辛酸酯(海藻糖c8)[cmc：0.262％]
[0148]
α-d-吡喃葡萄糖基-α-d-吡喃葡萄糖苷单十二酸酯(海藻糖c12)[cmc：0.008％]
[0149]
α-d-吡喃葡萄糖基-α-d-吡喃葡萄糖苷单肉豆蔻酸酯(海藻糖c14)[cmc：0.0007％]
[0150]
等。
[0151]
作为亲水性部分具有葡萄糖的中性表面活性剂，可列举出：
[0152]
正辛基-β-d-硫代葡萄糖苷(otg)[cmc：0.278％]
[0153]
正辛基-β-d-葡萄糖苷(og)[cmc：0.731％]
[0154]
正庚基-β-d-硫代葡萄糖苷(htg)[cmc：0.883％]
[0155]
等。
[0156]
可以使用1种上述的中性表面活性剂或组合多种而使用。可根据所使用的载体、抗体、和靶多肽来适宜选择所使用的中性表面活性剂。
[0157]
作为结合溶液的中性缓冲液中的表面活性剂浓度没有特别限定，例如为0.001～10％(v/v)，优选0.01～5％(v/v)，更优选0.05～2％(v/v)。通过设为这样的表面活性剂浓度，从而容易良好地获得抗体与要结合的对象多肽的结合反应。中性缓冲液的中性是指
ph6.5～8.5左右。另外，作为缓冲液组成，可列举出tris缓冲液、磷酸缓冲液、hepes缓冲液等。
[0158]
进而，在第1结合工序前也可以实施血液试样的预处理。该预处理例如进行血液试样中包含的igg、igm等抗体的去除。血液试样中包含会与固定化于结合工序中所使用的载体的抗体发生结合的试样来源抗体。因此，通过在结合工序前去除该试样来源抗体，从而能够防止该试样来源抗体与结合工序中所使用的抗体结合。试样来源的抗体的去除可以通过使血液试样与结合有蛋白g、蛋白a、蛋白l、抗igg抗体、抗igm抗体、抗iga抗体、抗igy抗体、抗igd抗体、抗ige抗体等的载体接触来进行。本发明中，在连续进行2次亲和性纯化的情况下，也可以不在第1结合工序前实施血液试样的预处理。
[0159]
(第1清洗工序)
[0160]
接着，使用清洗溶液对通过第1结合工序而得到的前述第1抗体固定化载体与前述靶aβ相关肽的结合体进行清洗。
[0161]
清洗工序中优选：首先，使用包含表面活性剂的中性缓冲液作为前述清洗溶液进行清洗，然后，使用不包含表面活性剂的中性缓冲液作为前述清洗溶液进行清洗。
[0162]
作为前述清洗溶液的包含表面活性剂的中性缓冲液可以使用与上述的作为结合溶液的包含表面活性剂的中性缓冲液同样的缓冲液。首先，通过使用前述包含表面活性剂的中性缓冲液进行清洗，从而进行不需要成分例如疏水性高的血中蛋白质、脂质、糖脂等的常规去除。中性缓冲液的中性优选接近体液的ph，例如，优选ph6.5～8.5，更优选ph7.0～8.0。通过用这样的中性缓冲液进行清洗，从而能够防止在该清洗工序中抗原抗体结合体中的靶aβ相关肽从载体解离。
[0163]
然后，优选使用不包含表面活性剂的中性缓冲液进行清洗。通过使用不包含表面活性剂的中性缓冲液进行清洗，从而容易防止之后的操作中的起泡等不良情况。
[0164]
清洗工序中，通过将载体表面置于清洗溶液的0.01～500mpa、优选为0.05～300mpa、进一步优选为0.1～200mpa的流体压力下，从而能够去除不需要的成分。若低于上述范围，则有无法获得期望的清洗效果的倾向。若超过上述范围，则有抗体与所结合的对象多肽的结合被切断的担心。通过以更高压力进行清洗条件，从而改善抗体固定化载体上的非特异性吸附物质的去除效率，其结果，有助于提高结合的对象多肽的分析的灵敏度(提高s/n比)。
[0165]
需要说明的是，清洗的具体的方法没有特别限定。例如球状载体的情况下，可以通过在清洗液内进行搅拌来进行清洗。平面载体的情况下，可以通过从清洗喷嘴喷射高压清洗液来进行清洗。更具体而言，为了对平面载体上的特定区域进行高压清洗，可以使用具有与该区域的面积相应的内径的清洗喷嘴。该喷嘴例如由双管构成，可以将内管专用于向载体表面喷射清洗液即注液、将外管专用于对载体表面喷射的清洗液的抽吸即排液。
[0166]
(第1解离洗脱工序)
[0167]
接着，对于清洗后的前述第1抗体固定化载体与前述靶aβ相关肽的结合体，使用酸性水溶液作为洗脱液使前述靶aβ相关肽从前述抗体固定化载体解离。
[0168]
为了使抗原从结合有抗原的抗体(抗原抗体复合体)解离，使酸性水溶液接触抗原抗体复合体。本发明中，使用酸性水溶液，使前述靶aβ相关肽从结合有前述靶aβ相关肽的抗体固定化载体解离、洗脱。
[0169]
酸性水溶液优选包含表面活性剂。酸性水溶液中包含表面活性剂时，使前述靶aβ相关肽有效地从前述载体解离。其结果，有助于提高结合的靶aβ相关肽的回收率。上述表面活性剂的浓度低于cmc浓度时，无法获得表面活性剂的效果，前述靶aβ相关肽的解离效率差。例如，使用在50mm甘氨酸(glycine)缓冲液(ph2.8)中包含0.1％ddm的水溶液时，容易获得更高的洗脱效率。酸性水溶液的酸性是指ph1～3.5左右。
[0170]
另外，通过在酸性水溶液中包含表面活性剂，从而防止已洗脱的靶aβ相关肽吸附于管、试管、微孔板等，有抑制由该吸附所致的靶aβ相关肽损失的效果。
[0171]
通常，也将用于解离的包含表面活性剂的酸性水溶液作为洗脱液使用，能够洗脱从载体解离的前述靶aβ相关肽。或者，本领域技术人员可以适宜选择洗脱液。连续免疫沉淀-质谱分析(cip-ms)的情况下，第1解离洗脱工序中，为了不降低接下来的第2反应工序的反应效率，前述酸性水溶液优选不包含有机溶剂。免疫沉淀-质谱分析(ip-ms)的情况下，第1洗脱液优选包含有机溶剂。
[0172]
解离工序中，通过使载体表面接触洗脱液而能够解离、洗脱前述靶aβ相关肽。也可以根据需要在洗脱液内对载体进行搅拌。如此，得到第1洗脱液。免疫沉淀-质谱分析(ip-ms)的情况下，第1洗脱液可以供于质谱分析。
[0173]
(中性化工序)
[0174]
通过在得到的第1洗脱液中加入中性缓冲液，从而使前述洗脱液的ph为中性，得到ph呈中性的第1纯化溶液。中性化工序中，前述中性缓冲液可以使用与上述的作为结合溶液的中性缓冲液相同的缓冲液。前述中性缓冲液优选包含表面活性剂。中性缓冲液的中性优选接近体液的ph，例如，优选ph6.5～8.5，更优选ph7.0～8.0。作为第1纯化溶液的ph，例如，优选ph6.5～8.5，更优选ph7.0～8.0。通过设为这样的ph范围，从而接下来的第2反应工序容易得到高反应效率。另外，中性化工序中，为了不降低接下来的第2反应工序的反应效率，前述中性缓冲液优选不包含有机溶剂。
[0175]
(第2结合反应工序)
[0176]
接着，使前述第1纯化溶液与前述第2抗体固定化载体接触，从而使前述第2抗体固定化载体与前述第1纯化溶液中包含的靶aβ相关肽结合。
[0177]
前述第1纯化溶液通过上述的操作已经包含结合溶液。然而，在该阶段可以进一步追加与第1结合反应工序同样的、通常的免疫沉淀法(ip)中使用的结合溶液。
[0178]
供于前述第2反应工序的前述第1纯化溶液的液体量优选小于供于前述第1反应工序的前述含有生物试样的液体(包含前述生物试样和结合溶液的生物试样液)的液体量。本发明的方式中，供于前述第2反应工序的前述第1纯化溶液的液体量小于供于前述第1反应工序的前述生物试样液的液体量(即，前述生物试样和结合溶液的总计液体量)时，第2反应工序中的抗体与靶aβ相关肽的结合效率增高，能够进一步减少靶aβ相关肽的损失。即，大多数情况下，抗体与亲和性纯化时成为靶标的aβ相关肽的结合率不是100％，因此每次进行亲和性纯化时或多或少会发生靶aβ相关肽的损失。连续进行2次亲和性纯化时比仅进行1次亲和性纯化时的杂质减少，同时靶aβ相关肽也会减少。因此，为了提高第2次抗体与靶aβ相关肽的结合效率、减少靶aβ相关肽的损失，优选在第2次亲和性纯化中减少反应溶液体量(即，第1纯化溶液的液体量)。
[0179]
优选供于前述第2反应工序的前述第1纯化溶液的液体量比供于前述第1反应工序
的前述生物试样液的液体量(即，前述生物试样和结合溶液的总计液体量)少。以供于前述第1反应工序的前述生物试样液的液体量作为基准，用体积表示，供于前述第2反应工序的前述第1纯化溶液的液体量例如可以为0.1～50％左右、优选为0.5～20％左右、进一步优选为1～10％左右。这可以如下进行：通过减少第1洗脱工序中使用的酸性溶液的量而减少第1洗脱液的量、减少中性化工序中使用的中性缓冲液的量等，从而减少第1纯化溶液的液体量。
[0180]
另外，前述第2反应工序中的前述第2抗体固定化载体的量优选小于前述第1反应工序中的前述第1抗体固定化载体的量。本发明的方式中，前述第2反应工序中的前述第2抗体固定化载体的量小于前述第1反应工序中的前述第1抗体固定化载体的量时，可以减少通过质谱分析进行测量时成为试样溶液的洗脱液(第2纯化溶液)的液体量，作为结果，靶aβ相关肽被进一步浓缩而能够高灵敏度地检测。即，通过质谱分析进行测量时的试样溶液量越小，靶aβ相关肽越被浓缩而能够高灵敏度地检测。为了减少通过质谱分析进行测量时成为试样溶液的洗脱液量，优选减少第2次亲和性纯化中使用的抗体固定化载体量。另外，也具有减少非特异性吸附物质、抗体固定化载体来源的杂质的混入的效果。
[0181]
以前述第1反应工序中的前述第1抗体固定化载体的量作为基准，用载体的表面积表示前述第2反应工序中的前述第2抗体固定化载体的量，例如可以为1～50％左右、优选为5～25％左右。只要第1抗体固定化载体与前述第2抗体固定化载体相同，则表示载体的表面积与载体的重量、载体的个数相同。
[0182]
(第2清洗工序)
[0183]
使用清洗溶液对通过第2结合工序而得到的前述第2抗体固定化载体与前述靶aβ相关肽的结合体进行清洗。
[0184]
清洗工序中优选：首先，使用包含表面活性剂的中性缓冲液作为前述清洗溶液进行清洗，然后，使用不包含表面活性剂的中性缓冲液作为前述清洗溶液进行清洗。
[0185]
作为前述清洗溶液的包含表面活性剂的中性缓冲液可以使用与上述的作为结合溶液的包含表面活性剂的中性缓冲液同样的溶液。首先，通过使用前述包含表面活性剂的中性缓冲液进行清洗，从而进行不需要成分例如疏水性高的血中蛋白质、脂质、糖脂等的常规去除。中性缓冲液的中性优选接近体液的ph，例如，优选ph6.5～8.5，更优选ph7.0～8.0。通过用这样的中性缓冲液进行清洗，从而能够防止在该清洗工序中抗原抗体结合体中的靶aβ相关肽从载体解离。
[0186]
然后，优选使用不包含表面活性剂的中性缓冲液进行清洗。通过使用不包含表面活性剂的中性缓冲液进行清洗，从而容易防止之后的操作中的起泡等不良情况。进而，也能够降低检测工序中由表面活性剂的混入所致的电离抑制(离子化抑制，ion suppression)。
[0187]
清洗工序中，通过将载体表面置于清洗溶液的0.01～500mpa、优选为0.05～300mpa、进一步优选为0.1～200mpa的流体压力下，从而能够去除不需要的成分。若低于上述范围，则有无法获得期望的清洗效果的倾向。若超过上述范围，则有抗体与所结合的对象aβ相关肽的结合被切断的担心。通过以更高压力进行清洗条件，从而改善抗体固定化载体上的非特异性吸附物质的去除效率，其结果，有助于提高所结合的对象aβ相关肽的分析的灵敏度(提高s/n比)。
[0188]
需要说明的是，清洗的具体方法与第1清洗工序中说明的情况相同，没有特别限
matrix))。基质添加剂可以根据分析对象(多肽)和/或基质由本领域技术人员进行适宜选择。例如，作为基质添加剂，可以使用含膦酸基的化合物。具体而言，作为包含1个膦酸基的化合物，可列举出膦酸(phosphonic acid)、甲基膦酸(methylphosphonic acid)、苯基膦酸(phenylphosphonic acid)、和1-萘基甲基膦酸(1-naphthylmethylphosphonic acid)等。另外，作为包含2个以上膦酸基的化合物，可列举出亚甲基二膦酸(methylenediphosphonic acid；mdpna)、亚乙基二膦酸(ethylenediphosphonic acid)、乙烷-1-羟基-1,1-二膦酸(ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid)、次氮基三膦酸(nitrilotriphosphonic acid)、和亚乙基二氨基四膦酸(ethylenediaminetetraphosphonic acid)等。上述的含膦酸基的化合物中，优选1分子中具有2个以上、优选2～4个膦酸基的化合物。
[0201]
例如，抗体固定化载体表面残留的清洗溶液的金属离子混入到解离工序后的洗脱液中的情况下，含膦酸基的化合物的使用是有用的。该金属离子在质谱分析中会对背景产生不良影响。含膦酸基的化合物的使用具有抑制这样的不良影响的效果。
[0202]
需要说明的是，除了上述基质添加剂以外，也可以使用更普通的添加剂、例如选自由铵盐和有机碱组成的组中的物质。
[0203]
基质添加剂可以在水中或基质溶剂中制成0.1～10w/v％、优选为0.2～4w/v％的溶液。基质添加剂溶液和基质溶液例如可以以1：100～100：1、优选以1：10～10：1的体积比进行混合。
[0204]
(基于免疫测定的aβ相关肽的测定方法)
[0205]
进而，本发明的第4方式为一种测定生物试样中的aβ相关肽的方法，所述方法包括如下工序：
[0206]
反应工序，使含有生物试样的液体与上述的单克隆抗体接触，从而使前述生物试样中的aβ相关肽与前述单克隆抗体结合；以及
[0207]
检测工序，利用选自由夹心型免疫测定法、直接elisa、间接elisa、竞争elisa、蛋白质印迹、免疫组织化学染色、流式细胞术、免疫沉淀、亲和色谱、和免疫细胞染色组成的组中的方法检测结合在前述单克隆抗体上的前述aβ相关肽。
[0208]
这些反应工序和检测工序可以使用本领域技术人员公知的方法。例如，夹心型免疫测定法中，利用酶作为标记物的夹心elisa(enzyme-linked immunosorbent assay)的情况下，可以将作为一抗的上述抗aβ单克隆抗体用作固相化抗体(捕获抗体)、且将前述作为二抗的针对靶aβ相关肽的其它抗体用作检测抗体(标记抗体)。
[0209]
夹心型免疫测定法中，除了利用酶作为标记物的夹心elisa之外，可以使用利用放射性同位素的放射免疫测定法(ria)、利用化学发光物质的化学发光免疫测定法(cia)、利用荧光发光物质的荧光免疫测定法(fia)、利用金属络合物的电化学发光免疫测定法(eclia)、利用荧光素酶等生物发光物质的生物发光免疫测定法(blia)、用pcr扩增被抗体标记的核酸来进行检测的免疫pcr、检测由于形成免疫复合体而产生的浊度的免疫比浊法(tai)、检测由于形成免疫复合体而聚集的乳胶的乳胶凝集比浊法(la)、在纤维素膜上进行反应的免疫色谱法等。
[0210]
可提供包含该新颖的抗aβ抗体克隆16-10e作为构成成分的、用于测定血浆中aβ相关肽的ip-ms的试剂盒。具体而言，提供一种用于测定aβ相关肽的试剂盒，其包含在前述载体上结合有抗aβ抗体(克隆16-10e)的抗体固定化载体作为构成成分。
[0211]
试剂盒进而可以包含ip-ms(也包括cip-ms)测定法的操作中使用的各种成分，例如用于制备试样溶液的稀释液、清洗溶液等。
[0212]
实施例
[0213]
以下示出实施例，对本发明进行具体地说明，但本发明不限定于这些实施例。以下只要没有特别声明，则在该物质为固体时用％表示的物质的量表示重量基准，在该物质为液体时用％表示的物质的量表示体积基准。
[0214]
中性表面活性剂用以下的简称表示。
[0215]
正癸基-β-d-麦芽糖苷(dm)
[0216]
正十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)
[0217]
正壬基-β-d-硫代麦芽糖苷(ntm)
[0218]
[实施例1：抗aβ抗体的制作]
[0219]
使用合成肽daefrhdsgyevhhqkc(序列号10：该序列相当于cys(c)结合到aβ1-16的c末端lys(k)而得到的序列)。使用二价反应性试剂使前述合成肽daefrhdsgyevhhqkc的c末端的lys与载体蛋白klh(匙孔血蓝蛋白，keyhole limpet hemocyanin)结合。
[0220]
使用注射筒将该klh结合合成肽与fca(弗氏完全佐剂)混合并使其乳化，将200μg注射(免疫)至1只balb/c小鼠的尾根部肌肉内。自免疫起2周后，由小鼠测试血液，确认了针对aβ的抗体活性上升。然后，进行了采血、髂骨淋巴结采集。
[0221]
在50％聚乙二醇的存在下对得到的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤实施了细胞融合。将融合细胞分注在4张96孔微孔板中进行培养。在细胞融合起8天后，自96孔微孔板的各孔中进行培养上清液取样，通过elisa实施一次筛选，对于阳性孔，进而进行二次筛选。利用有限稀释法将通过筛选而选出的阳性孔的细胞克隆。然后，通过elisa依次进行一次、二次筛选，冷冻保存阳性的6个克隆的杂交瘤。
[0222]
培养获得的杂交瘤(克隆5-1d、8-1f、12-8h、14-12e、16-10e、40-10g)。将各培养上清液进行硫酸铵沉淀，然后，使用蛋白g将抗体纯化，通过sds-page进行确认(图2、3、4)。纯化抗体利用考马斯亮兰法(bradford法)进行蛋白定量。
[0223]
图2～4是示出通过硫酸铵沉淀和蛋白g将杂交瘤的培养上清液纯化、并且通过sds-page进行确认的结果的图，图2是关于杂交瘤(克隆5-1d、8-1f)的结果，图3是关于杂交瘤(克隆12-8h、14-12e)的结果，图4是关于杂交瘤(克隆16-10e、40-10g)的结果。需要说明的是，各图中，洗脱级分1、2和3表示蛋白g亲和色谱时的洗脱级分。
[0224]
[实施例2：基于抗aβ抗体的ip-ms]
[0225]
利用组合了使用抗aβ单克隆抗体的免疫沉淀(ip)和质谱分析(ms)的ip-ms测定了人血浆中aβ相关肽。
[0226]
在ip中，使抗aβ抗体克隆5-1d、8-1f、12-8h、14-12e、16-10e、和40-10g分别共价结合于作为磁珠的dynabeads epoxy(thermo fisher scientific)而制作抗体固定化磁珠，使用这些抗体固定化磁珠。另外，使用利用克隆6e10(biolegend)而制作的抗体固定化磁珠作为阳性对照。克隆6e10是以aβ相关肽的aβ3-8残基为表位的抗aβ抗体(igg)。
[0227]
将加标有aβ1-40、aβ1-42或app669-711的血浆250μl与包含内标肽(internal standard)的反应溶液[800mm glcnac、0.2％(w/v)ntm、0.2％(w/v)ddm、300mm nacl、100mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)]250μl混合，将混合物与上述各抗体固定化磁珠[磁珠量(磁珠的
重量)291μg]混合，在4℃下进行1小时抗原抗体反应(第一ip)。
[0228]
作为前述内标(internal standard)肽，使用经11pm稳定同位素标记(sil)的aβ1-38(anaspec制，san jose,ca,usa，称为sil-aβ1-38)。sil-aβ1-38中，phe和ile的碳原子被
13
c取代。
[0229]
抗原抗体反应后，清洗抗体磁珠，使用包含ddm的甘氨酸缓冲液(ph2.8)对aβ相关肽进行洗脱。
[0230]
抗原抗体反应后，用第一清洗缓冲液清洗抗体固定化磁珠[用第一清洗缓冲液(0.1％ddm、0.1％ntm、50mm tris-hcl(ph7.4)、150mm nacl)100μl清洗3次，用50mm乙酸铵缓冲液50μl清洗2次]。然后，用包含ddm的甘氨酸缓冲液(含有0.1％ddm的50mm甘氨酸缓冲液，ph2.8)将捕获到抗体固定化磁珠上的aβ相关肽洗脱。在得到的洗脱液中加入包含ddm的tris缓冲液[800mm glcnac、0.2％(w/v)ddm、300mm nacl、300mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)]使ph返回至中性(ph7.4)。然后，再次使中性的洗脱液与抗体固定化磁珠[磁珠量(磁珠的重量)73μg]在4℃下接触1小时，使aβ相关肽发生抗原抗体反应(第二ip)，用第二清洗缓冲液进行清洗[用第二清洗缓冲液(0.1％ddm、150mm tris-hcl(ph7.4)、150mm nacl)100μl清洗5次，用50mm乙酸铵缓冲液50μl清洗2次、用纯水30μl清洗1次]后，用洗脱液(5mm hcl,0.1mm蛋氨酸,70％(v/v)乙腈)洗脱捕获到抗体固定化磁珠上的aβ相关肽。如此，通过2个阶段ip操作得到包含aβ相关肽的各洗脱液。
[0231]
作为线性tof用的基质，使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)。基质溶液通过用70％(v/v)乙腈1ml溶解chca 1mg而制备。作为基质添加剂，使用0.4％(w/v)亚甲基二膦酸(mdpna)。将1mg/ml chca溶液与0.4％(w/v)mdpna等量混合，得到基质/基质添加剂溶液[0.5mg/ml chca/0.2％(w/v)mdpna]。
[0232]
预先将0.5μl基质/基质添加剂溶液滴加到μfocus maldi plate tm 900μm(hudson surface technology,inc.,fort lee,nj)的各孔上，进行干燥。
[0233]
将ip后的各洗脱液滴加到上述μfocus maldi plate tm 900μm的4个孔上，进行干燥。
[0234]
质谱数据使用axima performance(shimadzu/kratos,manchester,uk)通过正离子模式的线性tof而获得。线性tof的m/z值用峰的平均质量表示。m/z值是使用人血管紧张素ii和人acth片段18-39、牛胰岛素氧化β链、牛胰岛素作为外部标准进行校准得到的。
[0235]
将结果示于图5。图5是示出使用阳性对照的6e10、及获得的6个克隆进行ip-ms的结果。横轴为m/z、纵轴为离子的相对强度。各ms谱图自上方起是关于抗aβ抗体克隆6e10、5-1d、8-1f、12-8h、14-12e、16-10e和40-10g的结果。
[0236]
将aβ相关肽的氨基酸序列示于表1。实施例1中制作的抗aβ抗体克隆5-1d、8-1f、12-8h、14-12e、16-10e和40-10g中，仅在将16-10e用于ip时，显示出与阳性对照的6e10同等的谱图。在其它5个抗体克隆中，在所显示的质量范围(m/z值：4100～4800)内未检测到aβ相关肽峰。由该结果证实了16-10e是通过ip-ms来测定血浆aβ相关肽的有用克隆。
[0237]
[表1]
[0238][0239]
[实施例3：改变使用了16-10e的抗体磁珠的用量时的ip-ms评价]
[0240]
[实施例3-1：第一ip中改变16-10e抗体磁珠量时的ip-ms]
[0241]
用通常的增殖培养基扩大培养杂交瘤16-10e后，使其适应无血清培养基。然后，逐渐进行扩大培养最终以300ml培养。在活细胞数为20％以下的时间点回收培养上清液。使用蛋白a柱将该培养上清液纯化，用pbs进行透析。将抗体溶液无菌过滤后，取出一部分作为样品，测定280nm的吸光度，计算出抗体浓度。
[0242]
使经纯化的克隆16-10e抗体溶液与dynabeads epoxy(thermo fisher scientific)接触而使16-10e抗体与dynabeads epoxy共价结合，由此准备抗体固定化磁珠。另外，将使用克隆6e10制得的抗体固定化磁珠用作比较对照。
[0243]
将市售的血浆250μl与包含内标肽(sil-aβ1-38)的反应溶液250μl混合，将混合物与各抗体固定化磁珠混合，在4℃下进行1小时抗原抗体反应(第一ip)。使第一ip中使用的16-10e抗体磁珠量(磁珠的重量)变为145、291、582、1164μg这4个等级。关于6e10抗体固定化磁珠量，使用291μg。
[0244]
抗原抗体反应后，用第一清洗缓冲液清洗抗体固定化磁珠[用第一清洗缓冲液(0.1％ddm、0.1％ntm、50mm tris-hcl(ph7.4)、150mm nacl)100μl清洗1次，用50mm乙酸铵缓冲液50μl清洗1次]。然后，用包含ddm的甘氨酸缓冲液(含有0.1％ddm的50mm甘氨酸缓冲液，ph2.8)洗脱被抗体固定化磁珠捕捉的aβ相关肽。在得到的洗脱液中加入包含ddm的tris缓冲液[800mm glcnac、0.2％(w/v)ddm、300mm nacl、300mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)]使ph恢复至中性(ph7.4)。然后，再次使中性的洗脱液与相同的克隆的抗体磁珠在4℃下接触1小时，使之与aβ相关肽进行抗原抗体反应(第二ip)。第二ip工序中，16-10e抗体磁珠和6e10抗体磁珠的用量(磁珠的重量)均以73μg进行固定。用第二清洗缓冲液进行清洗[用第二清洗缓冲液(0.1％ddm、150mm tris-hcl(ph7.4)、150mm nacl)100μl清洗2次，用50mm乙酸铵缓冲液50μl清洗1次、用纯水30μl清洗1次]后，用洗脱液(5mm hcl,0.1mm蛋氨酸,70％(v/v)乙腈)洗脱被抗体固定化磁珠捕捉的aβ相关肽。如此，基于2个阶段ip操作得到包含aβ相关肽的各洗脱液。
[0245]
与实施例2同样地操作，预先将0.5μl基质/基质添加剂溶液滴加到μfocus maldi plate tm 900μm(hudson surface technology,inc.,fort lee,nj)的各孔上，进行干燥。
[0246]
将ip后的各洗脱液滴加到上述μfocus maldi plate tm 900μm的4个孔上，进行干燥。
[0247]
与实施例2同样地操作，获得了质谱数据。
[0248]
将结果示于图6。图6是改变第一ip中的16-10e的抗体固定化磁珠量时的ip-ms谱图。将6e10作为比较对照。横轴为m/z，纵轴为离子的相对强度。各ip-ms谱图自上方起是关于抗aβ抗体克隆6e10(对照，第一ip磁珠量：291μg)、16-10e(第一ip磁珠量：1164、582、291、145μg)的结果。使用的抗体磁珠量如图6中的表所述，表示磁珠的重量。
[0249]
由这些结果确认了：即使在第一ip中改变16-10e抗体固定化磁珠量，均可以得到同等的质谱，用6e10抗体固定化磁珠检测到的aβ相关肽全部被检测到。
[0250]
[实施例3-2：第二ip中改变16-10e抗体磁珠量时的ip-ms]
[0251]
除使用的抗体固定化磁珠量以外，与实施例3-1同样地使用16-10e抗体固定化磁珠实施了ip-ms。在第一ip中，16-10e抗体固定化磁珠和6e10抗体固定化磁珠的用量均以291μg进行固定，在第二ip中，以18、36、73、145μg这4个等级改变了16-10e抗体磁珠用量。关于6e10抗体磁珠量，使用73μg。
[0252]
将结果示于图7。图7是改变第二ip中的16-10e的抗体固定化磁珠量时的ip-ms谱图。将6e10作为比较对照。横轴为m/z，纵轴为离子的相对强度。各ip-ms谱图自上方起是关于抗aβ抗体克隆6e10(对照，第二ip磁珠量：73μg)、16-10e(第二ip磁珠量：145、73、36、18μg)的结果。使用的抗体磁珠量如图7中的表所示，表示磁珠的重量。
[0253]
由这些结果确认了：即使在第二ip中改变16-10e抗体固定化磁珠量，均可以得到同等的质谱，用6e10抗体固定化磁珠检测到的aβ相关肽全部被检测到。
[0254]
如实施例3-1和3-2那样，示出：即使改变16-10e抗体磁珠的用量，也与6e10抗体磁珠同样地能够检测血浆中的aβ相关肽。
[0255]
[实施例4：克隆16-10e与6e10的aβ反应性的不同]
[0256]
在96孔板的孔中加入aβ3-8肽(序列号1)溶液(10、100nmol/ml)各50μl，在4℃下孵育一夜，由此进行固相化。也准备了未固相化aβ3-8肽的孔(即，无抗原)。然后，废弃各孔的aβ3-8肽溶液，进行封闭后，用pbs-tween进行清洗，在各孔中加入实施例3中得到的克隆16-10e的抗体(2μg/ml)50μl。在4℃下孵育1小时后，用pbs-tween进行清洗，加入hrp标记-抗小鼠igg-fc溶液50μl。在4℃下孵育1小时后，用pbs-tween进行清洗，加入elisa pod基质tmb试剂盒(nacalai)100μl，在暗处孵育30分钟使其显色。加入2n硫酸100μl使显色反应停止。用酶标仪测定了主波长450nm/副波长650nm的吸光度(absorbance)。
[0257]
将结果示于图8。图8是示出使用了克隆16-10e和6e10的抗体的aβ3-8的直接elisa的结果的图。横轴表示aβ3-8浓度(nmol/ml)，纵轴表示利用酶标仪测得的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(absorbance)。
[0258]
其结果，示出：克隆16-10e中，固相化有aβ3-8的孔的吸光度高，16-10e与aβ3-8具有反应性。
[0259]
另一方面，进行除使用克隆6e10代替克隆16-10e以外同样的实验，测定了各孔的主波长450nm/副波长650nm的吸光度。其结果，克隆6e10与未固定化aβ3-8的孔为同等水平
的吸光度，证实了6e10与aβ3-8不具有反应性。即，证实了：克隆6e10可用作识别将aβ3-8作为表位的aβ相关肽的抗体，但与aβ3-8肽本身不具有反应性。
[0260]
由这些结果证实了：克隆16-10e与克隆6e10之间对aβ3-8肽的反应性存在差异。
[0261]
克隆16-10e是识别aβ3-8肽的新颖的单克隆抗体。
[0262]
(1)
[0263]
一种识别aβ相关肽的单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤以保藏编号nite bp-02998保藏在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心。
[0264]
(2)
[0265]
一种抗体固定化载体，其包含载体及结合在前述载体上的上述(1)所述的单克隆抗体。
[0266]
(3)
[0267]
一种用于测定aβ相关肽的试剂盒，其包含上述(2)所述的抗体固定化载体。
[0268]
(4)
[0269]
一种杂交瘤，其以保藏编号nite bp-02998保藏在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心。
[0270]
(5)
[0271]
根据上述(4)所述的杂交瘤，其具有识别aβ相关肽的单克隆抗体的产生能力。
[0272]
(6)
[0273]
一种测定生物试样中的aβ相关肽的方法，其包括如下工序：
[0274]
反应工序，使含有生物试样的液体与抗体固定化载体接触，从而使前述生物试样中的aβ相关肽与前述抗体固定化载体结合，所述抗体固定化载体包含载体及结合在前述载体上的上述(1)所述的单克隆抗体；
[0275]
清洗工序，对结合了前述aβ相关肽的前述抗体固定化载体进行清洗；
[0276]
洗脱工序，使用酸性溶液使前述aβ相关肽从前述抗体固定化载体解离、洗脱，得到纯化溶液；以及
[0277]
检测工序，通过质谱分析对前述纯化溶液中的前述aβ相关肽进行检测。
[0278]
(7)
[0279]
根据上述(6)所述的方法，其中，前述酸性溶液是包含表面活性剂的酸性溶液。
[0280]
(8)
[0281]
根据上述(6)或(7)所述的方法，其中，前述生物试样为选自由血液、脑脊液、尿液、粪便、及身体分泌液组成的组中的生物来源试样。
[0282]
(9)
[0283]
根据上述(6)或(7)所述的方法，其中，前述生物试样为全血、血浆或血清。
[0284]
(10)
[0285]
根据上述(6)～(9)中任一项所述的方法，其中，在前述质谱分析中，使用基质辅助激光解吸电离型质谱分析装置。
[0286]
(11)
[0287]
一种测定生物试样中的aβ相关肽的方法，其包括如下工序：
[0288]
第1反应工序，使含有生物试样的液体与第1抗体固定化载体接触，从而使所述生
物试样中的aβ相关肽与所述第1抗体固定化载体结合，所述第1抗体固定化载体包含载体及结合在所述载体上的上述(1)所述的单克隆抗体；
[0289]
第1清洗工序，对结合了所述aβ相关肽的所述第1抗体固定化载体进行清洗；
[0290]
第1洗脱工序，使用酸性溶液使所述aβ相关肽从所述第1抗体固定化载体解离、洗脱，得到第1洗脱液；
[0291]
中性化工序，通过在所述第1洗脱液中加入中性缓冲液而使所述洗脱液的ph为中性，得到ph呈中性的第1纯化溶液；
[0292]
第2反应工序，使所述第1纯化溶液与第2抗体固定化载体接触，从而使所述第1纯化溶液中的所述aβ相关肽与所述第2抗体固定化载体结合，所述第2抗体固定化载体包含载体及结合在所述载体上的上述(1)所述的抗体；
[0293]
第2清洗工序，对结合了所述aβ相关肽的所述第2抗体固定化载体进行清洗；
[0294]
第2洗脱工序，使用酸性溶液使所述aβ相关肽从所述第2抗体固定化载体解离、洗脱，得到第2纯化溶液；以及
[0295]
检测工序，通过质谱分析对所述第2纯化溶液中的所述aβ相关肽进行检测。
[0296]
(12)
[0297]
根据上述(11)所述的方法，其中，供于所述第2反应工序的所述第1纯化溶液的液体量小于供于所述第1反应工序的所述含有生物试样的液体的液体量。
[0298]
(13)
[0299]
根据上述(11)或(12)所述的方法，其中，前述第2反应工序中的前述第2抗体固定化载体的量小于前述第1反应工序中的前述第1抗体固定化载体的量。
[0300]
(14)
[0301]
根据上述(11)～(13)中任一项所述的方法，其中，前述第1洗脱工序中，前述酸性溶液是包含表面活性剂的酸性溶液。
[0302]
(15)
[0303]
根据上述(11)～(14)中任一项所述的方法，其中，前述第2洗脱工序中，前述酸性溶液为包含有机溶剂的酸性溶液。
[0304]
(16)
[0305]
根据上述(11)～(15)中任一项所述的方法，其中，前述生物试样为选自由血液、脑脊液、尿液、粪便、及身体分泌液组成的组中的生物来源试样。
[0306]
(17)
[0307]
根据上述(11)～(15)中任一项所述的方法，其中，前述生物试样为全血、血浆或血清。
[0308]
(18)
[0309]
根据上述(11)～(17)中任一项所述的方法，其中，在前述质谱分析中，使用基质辅助激光解吸电离型质谱分析装置。
[0310]
(19)
[0311]
一种测定生物试样中的aβ相关肽的方法，其包括如下工序：
[0312]
反应工序，使含有生物试样的液体与上述(1)所述的单克隆抗体接触，从而使所述生物试样中的aβ相关肽与所述单克隆抗体结合；以及
[0313]
检测工序，利用选自由夹心型免疫测定法、直接elisa、间接elisa、竞争elisa、蛋白质印迹、免疫组织化学染色、流式细胞术、免疫沉淀、亲和色谱、和免疫细胞染色组成的组中的方法检测结合在所述单克隆抗体上的所述aβ相关肽。
[0314]
(20)
[0315]
一种单克隆抗体，其识别aβ3-8肽(序列号1)。
[0316]
(21)
[0317]
一种识别aβ3-8肽的单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤以保藏编号nite bp-02998保藏在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心。