1.本发明属于石油污染治理技术领域，具体涉及一种高效的海洋石油降解复合菌剂。


背景技术：

2.石油是现代工业的“血液”，但随着石油开采量的日益增大，在开采、运输、储藏以及事故性泄露中，石油大量进入环境，严重污染了土壤、地下水、河流和海洋。尤其是近几十年来，石油已成为土壤、水体等环境的主要污染物之一。在石油污染的修复方法中，微生物修复因其具有处理效果好、成本低、适应性强、无二次污染等特点，是一项清洁环境的低投资、高效益、便于应用、发展潜力大的新兴技术。
3.海洋专性解烃菌是一类溢油发生前在海洋环境中丰度很低甚至低于检测限，溢油发生后可以迅速增殖并以石油组分为唯一碳源和能源的微生物。它们当中包括alcanivorax（食烷菌属）、cycloclasticus（解环菌属）、marinobacter（海杆菌属）、marinobacterium（海细菌属）、neptunomonas、oleispira（油螺旋菌属）、thalassolituus等属的细菌。20世纪90年代兴起的溢油原位生物修复技术，正是通过添加海水中缺乏的氮、磷元素刺激这类细菌的生长、加快石油降解速率来实现的。由于这类细菌在溢油去除过程中作用显著，并且具有迥异于陆源耐盐降解菌的生长特性、难以获得纯培养，所以它们是一种重要的、相对稀缺的海洋菌种资源。但是采用单独一种专性解烃菌往往存在石油降解速率低、修复效果差的问题。因此，如何充分利用海洋专性解烃菌之间的协同效应、制备复合菌液对海洋溢油进行生物修复，已成为海洋溢油生物修复技术研究的难点。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种高效的海洋石油降解复合菌剂，该石油降解复合菌剂具有更高的石油降解能力，且对环境耐受能力增强，其耐盐性能更高，适用于对海洋溢油进行生物修复。
5.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种微生物载体的制备方法，包括：上述微生物载体通过酯化反应修饰苎麻纤维而得；上述酯化反应修饰用化合物至少包括灵芝酸a；上述微生物载体的吸油能力＞13.5g/g，保油率＞94%。本发明采用灵芝酸a作为改性剂之一，对苎麻纤维进行化学修饰，制得微生物载体材料，具有更强的吸附能力，其对石油的饱和吸附量明显提升；且具有更佳的保油能力，有效增强对石油的清除效果。将其应用于微生物固定化工艺中，制得复合菌剂。相比于游离的菌剂，利用本发明载体材料制备的复合菌剂微生物密度高，且有效减少了微生物的流失，增强其对石油的降解速率；同时载体材料的孔隙结构提供了优异的渗透性，促进微生物细胞与底物间的传质，维持了微生物较高的生物活性，进而有效提升其降解石油的能力；且载体其良好的吸油保油能力，能够有效吸附、锁定石油，供负载的微生物降解，协同作用使得复合菌剂对石油清除能力更佳。同时，利
(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯基]-1,2,3-噻二唑的加入，有效提升了表面活性剂的乳化性能，形成的乳液稳定性更高。
16.上述海洋石油降解复合菌剂的制备方法，包括：复合菌液的制备，取各降解菌株进行种子液培养以及发酵处理得到各菌发酵液，按照一定体积比复混得到复合菌液；复合菌剂的制备，取上述微生物载体与复合菌液以及非离子表面活性剂混合培养得到复合菌剂。
17.进一步地，复合菌剂的制备方法，具体为：（1）复合菌液的制备种子液的制备，菌株lcl-1接种到液体lb培养基上，菌株97co-6接种到m8培养基上，菌株py97s接种到乙酸钠培养基上，在25~28℃、140~160rpm、避光的条件下培养至对数生长后期，得到各菌种子液；发酵液的制备，取上述各菌种子液按照6~8%的接种量分别相应培养基中，设置发酵条件为：通气量0.2~0.3m3/h，搅拌速度140~180rpm，发酵温度25~28℃；并在消泡电极的控制下采取流加豆油的常规方式消泡，当细胞密度为108~109cfu/ml时停止发酵，得到各菌发酵液；混合菌液的制备，按体积比1：1~1.5：1~1.5的比例将三种菌的发酵液混合得到复合菌液；（2）复合菌剂的制备取微生物载体加入固定化培养基中，120~125℃下灭菌25~30min；然后依次加入混合菌液和非离子表面活性剂，并置于28~30℃、150~170r/min条件下摇床培养32~36h；4000~4200r/min转速下离心8~10min，除去上清液，加入生理盐水清洗3~5次，制得复合菌剂。
18.根据具体实施例，固定化培养基组分包括：nacl 14~16g/l，牛肉浸膏 4~6g/l，蛋白胨 9~11g/l，ph为7.2
±
0.3；微生物载体的加入量为0.08~0.2g/ml；混合菌液与固定化培养基的体积比为1：8~10；非离子表面活性剂的加入浓度为0.01~0.03wt%。
19.根据具体实施例，复合菌剂使用量为5g/l时，其石油降解率＞91%；更优选地，石油降解率＞97%。
20.本发明还公开了上述微生物载体在污水处理、环境修复中的用途。
21.本发明的又一目的在于，提供了上述海洋石油降解复合菌剂应用于对海洋溢油污染的海域或海岸线或滩涂的生物修复。
22.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明采用灵芝酸a作为改性剂之一，对苎麻纤维进行化学修饰，制得微生物载体材料，具有更强的吸附石油能力；且保油能力显著提升。将其应用于微生物固定化工艺中，制得复合菌剂，其降解石油的能力有效提升；且增强了复合菌剂的耐盐能力，更适用于海洋环境。此外，本发明采用4-[4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯基]-1,2,3-噻二唑对表面活性剂进行进一步修饰，有效提升了表面活性剂的乳化性能，形成的乳液稳定性更高；作用于微生物细胞，能够促进细胞表面组成物质的释放，如胞外多糖等的分泌，提升微生物对石油的降解性能；且能够有效提升微生物对环境的耐受能力，其耐盐性能显著提升。
[0023]
因此，本发明提供了一种高效的海洋石油降解复合菌剂，该石油降解复合菌剂具
有更高的石油降解能力，且对环境耐受能力增强，其耐盐性能更高，适用于对海洋溢油进行生物修复。
附图说明
[0024]
图1为本发明试验例1中微生物载体红外光谱测试结果；图2为本发明试验例1中非离子表面活性剂红外光谱测试结果。
具体实施方式
[0025]
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：本发明实施例所用威尼斯不动杆菌lcl-1，市购，保藏号为m 2015538；食烷菌97co-6，市购，保藏号为cgmcc no.3736；海杆菌py97s，市购，保藏号为cgmcc no.3244。
[0026]
本发明实施例所用培养基：lb培养液的组分包含：10g/l 胰蛋白胨；5g/l 酵母提取物；5g/l 氯化钠，ph 5.5。
[0027]
m8培养基的组分包含：22.79g/l nacl，11.18g/l mgcl2·
6h2o，3.98g/l na2so4，1.46g/l cacl2·
2h2o，1.30g/l tapso，0.72g/l kcl，0.27g/l nh4cl，89.00mg/l na2hpo4·
7h2o，83.00mg/l nabr，31.00mg/l nahco3，27.00mg/lh3bo3，24.00mg/l srcl2·
6h2o，2.60mg/l naf，2.00mg/l fecl2·
4h2o，2g/l 乙酸钠，0.5g/l 蛋白胨，0.5g/l 酵母提取物，0.5g/l 马铃薯浸出粉，0.2g/l 葡萄糖，0.2g/l 蔗糖，0.05g/l 苹果酸钠，0.05g/l 柠檬酸三钠，0.05g/l 酒石酸钾钠，ph 7.5。
[0028]
乙酸钠培养基的组分包含：22.79g/l nacl，11.18g/l mgcl2·
6h2o，3.98g/l na2so4，1.46g/l cacl2·
2h2o，1.30g/l tapso，0.72g/l kcl，0.27g/l nh4cl，89.00mg/l na2hpo4·
7h2o，83.00mg/l nabr，31.00mg/l nahco3，27.00mg/l h3bo3，24.00mg/l srcl2·
6h2o，2.60mg/l naf，2.00mg/l fecl2·
4h2o，2g/l 乙酸钠，ph 7.4。
[0029]
实施例1：微生物载体的制备：苎麻预处理，取苎麻去皮、粉碎，过80目筛，用自来水和去离子水各清洗3次，自然晾干，之后56℃下干燥得到苎麻纤维；然后加入丙酮、正己烷，充分搅拌后静置5h，取出烘干得到预处理后的苎麻纤维；其中，苎麻纤维与丙酮的固液比为1g：18ml；苎麻纤维与正己烷的固液比为1g：4.3ml。
[0030]
微生物载体的制备，取预处理后的苎麻纤维，加入灵芝酸a-乙酸（90wt%）混合溶液，120℃油浴加热，65r/min的转速下搅拌恒温回流6h；反应结束后依次用乙醇、丙酮、蒸馏水洗涤4次，60℃下烘干得到微生物载体；其中，预处理后的苎麻纤维与混合溶液的固液比为1g：54ml；灵芝酸a与乙酸的固液比为0.32g/ml。
[0031]
复合菌剂的制备：（1）复合菌液的制备种子液的制备，菌株lcl-1接种到液体lb培养基上，菌株97co-6接种到m8培养基上，菌株py97s接种到乙酸钠培养基上，在28℃、155rpm、避光的条件下培养至对数生长后期，得到各菌种子液；发酵液的制备，取上述各菌种子液按照7.1%的接种量分别相应培养基中，设置发
酵条件为：通气量0.25m3/h，搅拌速度160rpm，发酵温度28℃；并在消泡电极的控制下采取流加豆油的常规方式消泡，当细胞密度为109cfu/ml时停止发酵，得到各菌发酵液；混合菌液的制备，按体积比1：1.2：1.3的比例将三种菌的发酵液混合得到复合菌液；（2）复合菌剂的制备取微生物载体加入固定化培养基中，浓度为0.14g/ml；121℃下灭菌30min；然后依次加入混合菌液（与固定化培养基的体积比为1：9.5）和非离子表面活性剂（加入浓度为0.02wt%），并置于28℃、160r/min条件下摇床培养36h；4200r/min转速下离心8min，除去上清液，加入生理盐水清洗5次，制得复合菌剂。
[0032]
具体的，固定化培养基组分包括：nacl 15g/l，牛肉浸膏 5g/l，蛋白胨 10g/l，ph为7.2
±
0.3。
[0033]
非离子表面活性剂的制备：取腰果酚，加入50.4wt%浓度的氢氧化钠，搅拌条件下加热至116℃、真空脱水2h；然后充入氮气、再抽真空，温度升至145℃，取环氧乙烷用氮气以液体状态压入反应釜，设置压力2.0
×
105pa；待反应开始后体系温度上升、压力开始下降，继续通入环氧乙烷，并控制反应温度在150℃、压力在2.5
×
105pa；当环氧乙烷加完后，继续搅拌反应至压力不再下降，并出现降温；然后冷却至100℃以下，取出反应产物，加入冰醋酸中和至微酸性；接着加入镍催化剂和无水乙醇，在密闭容器中通入惰性气体置换空气，再通入氢气至容器内压力为3mpa，常温搅拌进行加氢反应至压力停止下降为止，得到非离子表面活性剂。
[0034]
具体制备过程中，腰果酚与环氧乙烷的摩尔比为1：23.6；氢氧化钠的加入量为腰果酚的0.42wt%；镍催化剂的加入量为腰果酚的52wt%；无水乙醇的加入量为腰果酚质量的3倍。
[0035]
实施例2：微生物载体的制备与实施例1的不同之处：微生物载体的制备过程中，预处理后的苎麻纤维与混合溶液的固液比为1g：48.5ml；灵芝酸a与乙酸的固液比为0.22g/ml。
[0036]
非离子表面活性剂的制备与实施例1相同。
[0037]
复合菌剂的制备与实施例1的不同之处：微生物载体的加入量为0.09g/ml；混合菌液与固定化培养基的体积比为1g：8.4ml；非离子表面活性剂的加入浓度为0.012wt%。
[0038]
实施例3：微生物载体的制备与实施例1的不同之处：微生物载体的制备过程中，预处理后的苎麻纤维与混合溶液的固液比为1g：56ml；灵芝酸a与乙酸的固液比为0.36g/ml。
[0039]
非离子表面活性剂的制备与实施例1相同。
[0040]
复合菌剂的制备与实施例1的不同之处：微生物载体的加入量为0.18g/ml；混合菌液与固定化培养基的体积比为1g：9.7ml；非离子表面活性剂的加入浓度为0.025wt%。
[0041]
实施例4：微生物载体的制备与实施例1的不同之处：微生物载体的制备过程中，预处理后的苎麻纤维与混合溶液的固液比为1g：60ml；灵芝酸a与乙酸的固液比为0.4g/ml。
[0042]
非离子表面活性剂的制备与实施例1相同。
[0043]
复合菌剂的制备与实施例1的不同之处：微生物载体的加入量为0.19g/ml；混合菌
液与固定化培养基的体积比为1：10；非离子表面活性剂的加入浓度为0.03wt%。
[0044]
实施例5：微生物载体的制备与实施例1相同。
[0045]
非离子表面活性剂的制备与实施例1的不同之处：制备过程中还加入4-[4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯基]-1,2,3-噻二唑，其与环氧乙烷的摩尔比为1：3.8。
[0046]
复合菌剂的制备与实施例1的不同之处：非离子表面活性剂为本实施例制备的。
[0047]
实施例6：微生物载体的制备与实施例5的不同之处：制备过程中不添加灵芝酸a。
[0048]
非离子表面活性剂的制备与实施例5相同。
[0049]
复合菌剂的制备与实施例5的不同之处：微生物载体为本实施例制备的。
[0050]
对比例1：微生物载体的制备与实施例1的不同之处：制备过程中不添加灵芝酸a。
[0051]
非离子表面活性剂的制备与实施例1相同。
[0052]
复合菌剂的制备与实施例1的不同之处：微生物载体为本对比例制备的。
[0053]
试验例1：1、红外光谱表征采用傅里叶变换红外光谱仪进行化学结构的表征。通过溴化钾压片法测试。其中，测试波数范围4000~500cm-1
，分辨率为4cm-1
。
[0054]
对对比例1和实施例1制备的微生物载体进行上述测试，结果如图1所示。从图中分析可知，相比于对比例1制备的微生物载体的红外测试结果，实施例1制得的微生物载体的红外光谱中，在1674cm-1
附近出现c=c键的特征吸收峰，表明实施例1中微生物载体成功制备。
[0055]
对实施例1和实施例5制备的非离子表面活性剂进行上述测试，结果如图2所示。从图中分析可知，相比于实施例1制备的非离子表面活性剂的红外测试结果，实施例5制得的非离子表面活性剂的红外光谱中，在1580cm-1
附近出现酯基中n=n键的特征吸收峰，在1265cm-1
附近出现酯基中c-n键的特征吸收峰，在630cm-1
附近出现酯基中c-s键的特征吸收峰，表明实施例5中非离子表面活性剂成功制备。
[0056]
2、载体吸油性能测试测试参照astmf 726-12的规定标准进行，测定载体的最大吸油能力。具体测试操作如下：取0.1g载体样品放入含有100ml原油的烧杯中，浸泡至饱和后用100目钢丝取出，悬滴30s后，在室温下称重。吸油能力按照下列公式计算：s=（m
so
－ms）/ms式中，ms为吸油前载体的质量，g；m
so
为吸油后载体的质量，g。
[0057]
3、载体保油性能测试取约0.1g载体样品放入油层厚度为35mm的烧杯中，浸没一段时间后用100目钢丝取出，分别悬滴0.5min、5min、10min、20min、30min后，在室温条件下测定其质量。试验数据在根据吸油能力计算公式计算各个时间对应的吸附能力s
t
，其保油率按照下列公式计算：rs=s
t
/s0×
100%式中，s0为载体吸油后悬滴0.5min时的吸油能力；s
t
为载体吸油后悬滴时间大于
0.5min时的吸油能力。测试结果以进入稳定阶段的保油率来表征。
[0058]
对对比例1、实施例1~4制得的复合菌剂进行上述两项测试，结果如表1所示：从表1中分析可知，实施例1制备的微生物载体的饱和吸附量以及保油率均明显大于对比例1的，表明采用灵芝酸a作为改性剂之一，对苎麻纤维进行化学修饰，制得的载体的吸油能力和保油能力显著提升。
[0059]
试验例2：乳化性能测定试验采用分水法来测定溶液的乳化能力，并以分出两相的时间来评价其乳化能力。具体操作包括：配制3g/l浓度的表面活性剂水溶液，取20ml放入100ml具塞量筒中，缓慢加入20ml的液体石蜡，置于25℃水浴中，30min后取出振荡200次后计时，记录分出10ml水所需的时间。
[0060]
对实施例1、实施例5制备的非离子表面活性剂进行上述测试，结果如表2所示：从表2中分析可知，实施例5制备的非离子表面活性剂分离出水所需的时间明显长于实施例1，表明采用4-[4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯基]-1,2,3-噻二唑改性制备得到的非离子表面活性剂，具有更强的乳化能力，形成的乳状液稳定性好，分出水所用的时间就更长。
[0061]
胞外多糖测定样品液的制备：取混合菌液加入固定化培养基中，两者体积比为1：9，加入浓度为0.02wt%的非离子表面活性剂，30℃下培养24h。测试利用苯酚-硫酸比色法对样品液的含糖量进行测定。
[0062]
对实施例1、实施例5制备的非离子表面活性剂进行上述测试，结果如表3所示：
从表3中分析可知，实施例5制备的非离子表面活性剂与混合菌液共混培养后，胞外多糖的含量明显高于实施例1，表明采用4-[4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯基]-1,2,3-噻二唑改性制备得到的非离子表面活性剂，具有更高的促微生物释放代谢物质活性，从而更有效的改善微生物细胞的表面性能，进一步促进其对石油的降解去除作用。
[0063]
试验例3：1、对石油去除效果测定取微生物载体接种到石油培养基中，接种量为4g/l，30℃下160r/min摇床培养7d。其中，石油培养基的组分包括含：0.5g/l nacl，1.5g/l k2hpo4，1.5g/l kh2po4，3.0g/l nh4no3，0.1g/l mgso4，0.01g/l fecl2，0.01g/l cacl2，ph 7.2
±
0.2。121℃高温蒸汽灭菌30min。
[0064]
以不接种载体的石油培养基为空白组，采用二氯甲烷萃取石油培养基中残余石油，充分振荡，待分层后将二氯甲烷转入盛有无水硫酸钠的砂型漏斗中静置吸水；得到滤液于35℃下旋蒸浓缩至干，然后加入一定量石油醚溶解，用紫外-可见分光光度法测定石油降解率，其计算公式如下：cd%=（1－c1/c0）
×
100%式中，cd为石油降解率，%；c0为空白组油含量，g/l；c1为接种组油含量，g/l。
[0065]
对对比例1、实施例1~6制备的复合材料进行上述两项测试，结果如表4所示：从表4中分析可知，实施例1制备的复合菌剂的石油降解率明显大于对比例1的，表明采用灵芝酸a作为改性剂之一，对苎麻纤维进行化学修饰得的载体，应用于微生物的固定，在提升微生物密度的同时，可保持微生物的生物活性，不受恶劣环境的影响，有效增强
复合菌剂对石油的降解率。实施例5的效果好于实施例1，实施例6的效果好于对比例1，表明采用4-[4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯基]-1,2,3-噻二唑改性制备得到的非离子表面活性剂，应用于复合菌剂的制备中，能够进一步增强复合菌剂对石油的降解去除能力。
[0066]
2、耐盐性能测试石油培养基中加入nacl，调节盐度为50g/l，接种微生物载体，浓度为4g/l，30℃下160r/min摇床培养7d。石油降解率的测试同上。
[0067]
对对比例1、实施例1~6制备的复合材料进行上述两项测试，结果如表5所示：从表5中分析可知，实施例1制备的复合菌剂的石油降解率明显大于对比例1的，且相比于不添加盐的环境，实施例1制得复合菌剂石油降解率的下降程度明显小于对比例1的，表明采用灵芝酸a作为改性剂之一，对苎麻纤维进行化学修饰得的载体，应用于微生物的固定，制得的复合菌剂具有更优的耐盐性能，特别适用于海洋环境中。实施例5的效果好于实施例1和实施例6，实施例6的效果好于对比例1，表明采用4-[4-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯基]-1,2,3-噻二唑改性制备得到的非离子表面活性剂，应用于复合菌剂的制备中，能够进一步增强复合菌剂的耐盐能力；且当改性苎麻纤维和改性非离子表面活性剂同时存在的条件下，对复合菌剂耐盐能力的增强效果更佳，其石油降解能力基本不受环境盐度影响。
[0068]
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
[0069]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。