1.本发明涉及天然黑色素技术领域，具体涉及一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法。


背景技术：

2.天然真黑色素是一种具有多种生理功能的生物大分子，广泛存在于人、动物、植物、微生物中，通常被用于染色剂、食品添加剂、药物载体等。但是，天然黑色素溶解性通常较差，且与难以除去的蛋白质等生物大分子共生，限制了它的应用。在一些黑色昆虫的外骨骼中，甲壳素、黑色素及蛋白质形成复合物以支撑体壁。利用化学方法破坏昆虫外骨骼并水解蛋白质，就可能获得不含蛋白质的甲壳素/壳聚糖
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黑色素复合物，进一步采用相关酶水解复合物糖部就可得到水溶性糖
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黑色素复合物。为此，本发明将提物黑色昆虫外骨骼中的甲壳素/壳聚糖
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黑色素复合物，并制备水溶性糖
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黑色素复合物，以期获得纯度高、水溶性好且不含蛋白质的天然黑色素。


技术实现要素：

3.本发明提供一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法，能够获得纯度高，不含蛋白质的水溶黑色素，并可拓宽优质天然黑色素的来源。
4.种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法，包括以下步骤：（1）原料预处理：将蜣螂、九香虫、独角仙、蜜蜂放入50～60℃烘干箱内进行干燥，使含水量降至4%。将干燥后的昆虫进行粉碎，过30～50目筛，得昆虫粉末。
5.（2）脱脂：往昆虫粉末中加入正己烷、石油醚做溶剂，料液比1/10～1/20，超声浸提30～40分钟，超声功率200～400w，抽滤，弃去滤液，得脱脂粉末。
6.（3）脱蛋白：往脱脂粉末中加入2～6 mol/l的氢氧化钠溶液，70～95℃加热6～12小时，抽滤，去离子水冲洗滤渣，得脱蛋白粉末。
7.（4）脱乙酰：往脱蛋白药渣中加入18～21 mol/l的氢氧化钠溶液，80～100℃加热8～15小时，抽滤，去离子水冲洗滤渣，得壳聚糖
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黑色素复合物。
8.（5）酶水解：壳聚糖
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黑色素复合物溶解于盐酸水溶液中，最终ph为5～6.5，料液比1/100～5/100，在上述溶液中，加入壳聚糖酶或几丁质酶或纤维素酶，使最终酶活力为 1～100 u/ml，水解温度30～45℃，水解时间5～12小时，随后，将水解液浓缩至原溶液的1/20～1/10，抽滤，收集滤液。
9.（6）大孔树脂柱层析：利用hp
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20或ab
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8大孔树脂对（5）中的滤液进行层析，依次用3～8倍柱体积的水、2～5倍柱体积的50～90％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱物，50～60℃浓缩，冷冻干燥，得壳寡糖
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黑色素复合物粗品。
10.（7）葡聚糖凝胶树脂层析：利用sephadex lh
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20或sephadex g
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25对壳寡糖
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黑色素复合物进行柱层析，流动相为水，以1/15～1/8柱体积为单位收集洗脱液，收集在波长450～550 nm处有光吸收的组分，冻干，即为壳寡糖
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黑色素复合物。
具体实施方式
11.下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
12.实施例一（1）原料预处理：将蜣螂50℃烘干箱内进行干燥，使含水量降至4%。将干燥后的昆虫进行粉碎，过30目筛，得昆虫粉末。
13.（2）脱脂：往昆虫粉末中加入正己烷做溶剂，料液比1/10，超声浸提30分钟，超声功率200w，抽滤，弃去滤液，得脱脂粉末。
14.（3）脱蛋白：往脱脂粉末中加入2 mol/l的氢氧化钠溶液，70℃加热12小时，抽滤，去离子水冲洗滤渣，得脱蛋白粉末。
15.（4）脱乙酰：往脱蛋白药渣中加入18 mol/l的氢氧化钠溶液，100℃加热15小时，抽滤，去离子水冲洗滤渣，得壳聚糖
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黑色素复合物。
16.（5）酶水解：壳聚糖
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黑色素复合物溶解于盐酸水溶液中，最终ph为6.5，料液比5/100，在上述溶液中，加入壳聚糖酶，使最终酶活力为 100 u/ml，水解温度45℃，水解时间12小时，随后，将水解液浓缩至原溶液的1/10，抽滤，收集滤液。
17.（6）大孔树脂柱层析：利用hp
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20大孔树脂对（5）中的滤液进行层析，依次用8倍柱体积的水、5倍柱体积的50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱物，50℃浓缩，冷冻干燥，得壳寡糖
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黑色素复合物粗品。
18.（7）葡聚糖凝胶树脂层析：利用sephadex lh
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20对壳寡糖
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黑色素复合物进行柱层析，流动相为水，以1/15柱体积为单位收集洗脱液，收集在波长550 nm处有光吸收的组分，冻干，即为壳寡糖
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黑色素复合物。
19.实施例二（1）原料预处理：将独角仙放入55℃烘干箱内进行干燥，使含水量降至4%。将干燥后的昆虫进行粉碎，过40目筛，得昆虫粉末。
20.（2）脱脂：往昆虫粉末中加入石油醚做溶剂，料液比1/15，超声浸提35分钟，超声功率350w，抽滤，弃去滤液，得脱脂粉末。
21.（3）脱蛋白：往脱脂粉末中加入5 mol/l的氢氧化钠溶液，85℃加热10小时，抽滤，去离子水冲洗滤渣，得脱蛋白粉末。
22.（4）脱乙酰：往脱蛋白药渣中加入19 mol/l的氢氧化钠溶液，90℃加热12小时，抽滤，去离子水冲洗滤渣，得壳聚糖
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黑色素复合物。
23.（5）酶水解：壳聚糖
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黑色素复合物溶解于盐酸水溶液中，最终ph为6.0，料液比3/100，在上述溶液中，加入纤维素酶，使最终酶活力为90 u/ml，水解温度40℃，水解时间8小时，随后，将水解液浓缩至原溶液的1/15，抽滤，收集滤液。
24.（6）大孔树脂柱层析：利用ab
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8大孔树脂对（5）中的滤液进行层析，依次用6倍柱体积的水、4倍柱体积的60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱物，55℃浓缩，冷冻干燥，得壳寡糖
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黑色素复合物粗品。
25.（7）葡聚糖凝胶树脂层析：利用sephadex g
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25对壳寡糖
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黑色素复合物进行柱层析，流动相为水，以1/10柱体积为单位收集洗脱液，收集在波长500 nm处有光吸收的组分，冻干，即为壳寡糖
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黑色素复合物。
26.本发明通过酶水解及柱层析制备昆虫源不含蛋白质的水溶天然黑色素，可有效拓
宽优质天然水溶黑色素的来源。
27.本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。


技术特征：
1.一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法，包括以下步骤：原料预处理：将黑色昆虫烘干、粉碎；脱脂：将烘干的昆虫粉末置于正己烷或石油醚脱脂；脱蛋白：将脱脂粉末置于热的低浓度氢氧化钠溶液中蛋白；脱乙酰：将脱蛋白粉末置于热的高浓度氢氧化钠溶液中脱乙酰，制备壳聚糖
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黑色素复合物；酶水解：采用酶解法降解壳聚糖
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黑色素复合物，以制备水解物；大孔树脂柱层析：通过大孔树脂柱层析纯化壳聚糖
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黑色素复合物酶解液，得壳寡糖
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黑色素复合物粗品；葡聚糖凝胶树脂柱层析：通过葡聚糖凝胶树脂柱层析纯化壳寡糖
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黑色素复合物粗品，得壳寡糖
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黑色素复合物。2.根据权利1所述一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法，其特征在于，步骤（1）将蜣螂、九香虫、独角仙、蜜蜂放入50～60℃烘干箱内进行干燥，使含水量降至4%，将干燥后的昆虫进行粉碎，过30～50目筛，得昆虫粉末。3.根据权利1所述一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的脱脂：往昆虫粉末中加入正己烷、石油醚做溶剂，料液比1/10～1/20，超声浸提30～40分钟，超声功率200～400w。4.根据权利1所述一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的脱蛋白：脱脂粉末中加入2～6 mol/l的氢氧化钠溶液，70～95℃加热6～12小时。5.根据权利1所述一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的脱乙酰：往脱蛋白药渣中加入18～21 mol/l的氢氧化钠溶液，80～100℃加热8～15小时。6.根据权利1所述一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法，其特征在于，步骤（5）所述的酶水解：壳聚糖
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黑色素复合物溶解于盐酸水溶液中，最终ph为5～6.5，料液比1/100～5/100，在上述溶液中，加入壳聚糖酶或几丁质酶或纤维素酶，使最终酶活力为 1～100 u/ml，水解温度30～45℃，水解时间5～12小时，随后，将水解液浓缩至原溶液的1/20～1/10，抽滤，收集滤液。7.根据权利1所述一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法，其特征在于，步骤（6）所述的大孔树脂柱层析：利用hp
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20或ab
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8大孔树脂对（5）中的滤液进行层析，依次用3～8倍柱体积的水、2～5倍柱体积的50～90％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱物，50～60℃浓缩，冷冻干燥，得壳寡糖
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黑色素复合物粗品。8.根据权利1所述一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法，其特征在于，步骤（7）所述的葡聚糖凝胶树脂柱层析：利用sephadex lh
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20或sephadex g
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25对壳寡糖
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黑色素复合物进行柱层析，流动相为水，以1/15～1/8柱体积为单位收集洗脱液，收集在波长450～550 nm处有光吸收的组分，冻干，即为壳寡糖
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黑色素复合物。

技术总结
本发明涉及天然黑色素技术领域，具体涉及一种昆虫源水溶性不含蛋白质黑色素制备方法。包括以下几个步骤（1）原料预处理；（2）脱脂；(3)脱蛋白；(4)脱乙酰；(5)酶水解；（6）大孔树脂柱层析；（7）葡聚糖凝胶树脂层析。本发明制备了昆虫源不含蛋白质水溶性天然黑色素，可弥补天然真黑色素溶解性差、蛋白质难以除去的缺陷，并拓宽优质天然黑色素的来源。拓宽优质天然黑色素的来源。


技术研发人员：王振宇 辛超 徐宁 王平根 侯可心 包美丽
受保护的技术使用者：哈尔滨工业大学
技术研发日：2021.10.23
技术公布日：2021/12/30